从小鼠和人类食管中分离肌成纤维细胞

本实验的总体目标是从小鼠和人类食管中分离原代肌成纤维细胞。首先从供体新生小鼠或人类组织中完整取出食管，随后将黏膜层与固有肌层分离。

第二步是将组织切碎，并用 HBSS 多次洗涤。接着，用胶原酶消化组织，进一步切碎以释放间充质细胞及其附着的上皮组织。然后将混合的细胞群体在肌成纤维细胞培养基中进行培养，其中肌成纤维细胞会贴壁生长，而上皮细胞无法存活，被洗去。

最终，通过免疫化学和流式细胞术来确认原代培养的细胞为肌成纤维细胞。演示实验操作的人员包括我本人、技术员 Matthew Gargas，以及来自我实验室 Tori 的博士后 chow new。在处死一只8至12日龄的小鼠后，将其背部朝下固定，并用70%乙醇润湿腹部表面。

接下来，使用镊子夹住并提起尿道口前方的皮肤。沿腹侧中线从尿道口剪至下巴处，仅剪开皮肤。

然后从尿道口向膝盖处做切口，形成一个倒Y形。沿至膝盖的切口后，再在肋骨两侧分别做切口。完成所有切口后，小心剥离皮肤并将其置于一旁。现在提起腹膜，沿腹膜剪开直至横膈膜和肋骨部位。

操作剪刀时应始终朝上，以避免损伤胸腔和腹腔内的器官。然后用手术剪轻轻提起肝脏左叶，暴露其下方的胃、胃食管连接部以及食管的腹段；沿胸骨和肋骨的中线剪开，直至颈部肩带区域。再次强调，操作时应使剪刀尖端远离下方器官，保持适当角度，避免损伤。

然后将肋骨拉开，暴露胸腔内容物。现在轻轻取出心脏和两叶肺组织。根据需要使用棉签吸收出血。

胸段食管是一条位于气管后方、胸椎前方的狭窄而柔韧的管道。在新生儿中，可通过寻找食管胃连接处来区分食管与胃。钝性分离食管周围血管结构，包括脂肪和肠系膜组织，直至食管起始部的颈段腔隙。

现在切除食管的全长，并根据需要将其转移至预冷的HBSS中。同时，取一部分胃组织以用于定位。本方案开始时，将从小鼠或人体组织中获得的黏膜碎片在HBSS中分别置于1.7毫升离心管或5毫升试管中进行剪碎处理。

现在，在获取人食管间质细胞时，重要的是通过锐性解剖将黏膜层与下方的固有肌层分离。随后在管中使用精细剪刀将组织剪切成2至3毫米大小的组织块。食管黏膜碎片沉降后，小心倾去下层的HBSS，注意不要意外弃去组织。

您也可以使用大吸头移液器去除多余的HBSS，然后加入新鲜的HBSS。轻轻振荡混匀管内液体，并让组织自然沉降。

静置后，再次倾去 HBSS 并重复此洗涤步骤，共进行八次。八次洗涤后，在室温下以低速设置的摇床上，用胶原酶 11 孵育组织，并对小鼠组织进行孵育，最长时间不超过 25 分钟。

在相同条件下，将人体组织孵育六小时。消化完成后，使用精细剪刀进一步剪碎组织，然后在200 G条件下离心10分钟。弃去上清液，将沉淀的组织转移至一支干净的1.7毫升离心管中。

然后在组织培养罩内用含2%山梨醇的DMEM洗涤细胞五次，以去除不可存活的细胞和其他碎片。每次洗涤时，让细胞依靠重力自然沉降，然后倾去洗涤液。洗涤结束后，将细胞接种至六孔板中的三个孔。

将细胞接种于培养板中，并在经真空过滤的添加培养基的DMEM中进行培养。人组织可能需要更多的孔或培养板，具体取决于标本培养物的大小和细胞数量，直至培养孔中细胞融合度达到80%。随后先将贴壁细胞传代至T25培养瓶中，使用含EDTA的0.05%胰蛋白酶消化细胞以使其脱离培养表面。

然后加入培养基以中和反应。将脱落的细胞收集到离心管中。随后在400 ×g条件下离心，收集细胞用于显微镜观察。

观察贴壁细胞的纺锤形形态，以区分培养的间质细胞与肌细胞，并对 Desmond 进行免疫染色。采用标准方案，简要地将 15,000 个细胞接种于四孔板中，在成肌纤维细胞培养基中培养 24 小时。次日固定细胞，然后在加入一抗之前，用含 5% 驴血清的 PBS 封闭固定后的细胞。一抗和二抗均应使用含 5% 驴血清的溶液进行稀释。

在室温下或4°C条件下过夜孵育一抗。随后用PBS洗涤细胞三次，每次洗涤后均进行后续冲洗。加入二抗，孵育细胞一小时。

在室温下，使用 PBS 洗涤三次以去除二抗。随后即可在洗涤后对染色的细胞进行分析。使用封片剂和盖玻片封片，以确定食管细胞的纯度。

使用流式细胞术检测其造血和内皮细胞表面标志物。在培养瓶中培养足够数量的细胞，直至可以收集。

然后在37摄氏度下，使用非酶细胞解离溶液处理培养的小鼠食管间质细胞10分钟，使其脱离。收集细胞后，用fax缓冲液洗涤细胞两次，并对细胞进行计数。

现在使用标准染色程序，用CD45染色以鉴定免疫细胞，用CD31染色以鉴定内皮细胞，然后将细胞上机进行流式细胞术分析。食管间质细胞通过机械法和酶消化法分离，并在接种后数小时内接种于6孔板中进行培养。这些细胞呈混合悬液状态，松散地贴附于培养板上。

在接下来的24小时内，梭形细胞从细胞悬液中长出，并牢固地贴附于培养板底部。这些细胞在五天内覆盖了整个孔板，并成功传代，其形态至少在15次传代中保持稳定。此处显示的细胞密度较低。这些是接近汇合状态的梭形细胞，为食管间质细胞原代培养物的免疫染色结果。

在腔室载玻片中培养的细胞显示出肌成纤维细胞骨架标志物的丰富表达。通过流式细胞术评估α-SMA及培养物纯度。针对食管源性原代间质细胞设定前向散射和侧向散射，随后对活细胞进行门控，并分析其细胞表面蛋白。

原代食管间质细胞不表达造血细胞表面标志物CD45，也不表达内皮细胞表面标志物CD31。观看本视频后，您应能够充分理解如何从小鼠和人食管组织中建立肌成纤维细胞的原代培养。是的。