Name: 从小鼠和人类食管隔离肌纤维母细胞 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 18 s
Description: 学习从小鼠和人类食管中分离原代肌纤维母细胞的方法，通过胶原酶消化和组织培养获得纺锤形细胞，并利用免疫化学和流式细胞术进行表型鉴定。该技术适用于研究上皮-间质相互作用及食管疾病相关机制。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

作者无任何利益冲突需要披露。

动物实验方案、研究的原理和目的已提交并获得南加州大学机构动物护理和使用委员会的批准。
从匿名的人类食管切除标本建立原代培养物的方案已获得南加州大学机构审查委员会的批准。
1. 获取小鼠或人类食管
<ol>
	<li>获取小鼠食管：
	<ol>
		<li>使用2%异氟烷吸入过量麻醉处死8至12日龄小鼠，随后进行颈椎脱位。</li>
		<li>将动物仰卧固定，并用70%乙醇润湿腹侧表面。用镊子夹住尿道口前方的皮肤并提起，使用标准直手术剪沿腹中线从尿道口剪至下颌。注意仅剪开皮肤。</li>
		<li>从尿道口沿两侧向下至膝部做切口，形成倒置的“Y”形。再沿动物两侧肋骨 cage 做切口。</li>
		<li>小心将两侧皮肤从下方的腹膜和肋骨 cage 上剥离，并向两侧翻开。检查覆盖胸腔的肋骨 cage 及覆盖腹腔的腹膜。
		<ol>
			<li>用镊子提起腹膜，剪开至横膈膜和肋骨 cage，剪刀尖朝上，以防损伤腹腔内容物。轻轻提起肝脏左叶，暴露下方的胃、食管-胃交界处及食管的腹段。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>使用高压灭菌的手术剪沿中线剪开胸骨和肋骨 cage，直至颈环。剪刀尖朝上，以防损伤胸腔内容物。将肋骨 cage 向两侧拉开，充分暴露胸腔内容物。</li>
		<li>轻柔移除心脏和两叶肺组织，用棉签吸除多余血液。胸段食管是一条细长而柔韧的管道，位于气管后方和胸椎前方。 
		注：在新生小鼠中，食管可能较难辨认。通过定位食管-胃交界处可简便地识别食管。</li>
		<li>从胃部开始沿食管向上仔细分离，剔除周围血管、脂肪和系膜组织，直至食管在颈腔的起始部位。钝头手术剪最适用于此操作。</li>
		<li>完整切除整段食管，并置于Hanks平衡盐溶液（HBSS）中，用于后续处理（如下所述）。如需定位，可同时取部分胃组织保留。 
		注：由于组织体积较小，无法在新生小鼠食管中分离肌层和黏膜肌层，因此整个食管将直接进行如下所述的处理。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>获取人食管组织：
	<ol>
		<li>用HBSS清洗食管切除标本（通常不超过5 cm），并去除附着的结缔组织、脂肪或血管组织。</li>
		<li>如需进行后续组织学检查，可取部分标本置于福尔马林中固定。</li>
		<li>通过锐性解剖将剩余黏膜层与下方的固有肌层分离。</li>
		<li>将黏膜切成小于1厘米的碎片，并按如下所述方案进行处理。 
		注：人食管切除标本可在PBS中保存最多6小时后再进行如下处理。食管切除标本的来源将决定标本大小，具体操作依实验室条件而定。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 分离小鼠和人类食管间质细胞
<ol>
	<li>通过机械法与酶消化法相结合，从鼠源和人源组织中分离食管间质细胞。
	<ol>
		<li>使用剪刀将组织剪碎，并用HBSS多次洗涤，进行机械消化。通过将组织与300 U/ml胶原酶XI和0.1 mg/ml中性蛋白酶在37°C下孵育25分钟（小鼠组织）或最长6小时（人组织），进行酶消化。确保用于剪碎组织的器械已经过高压灭菌和灭菌处理。 
		注意：胶原酶是一类可降解胶原蛋白的酶，胶原蛋白是一种细胞外基质蛋白，负责维持动物组织的完整性。胶原酶XI具有较高的胶原酶活性，在本分离方案中已取得良好效果。Dispase是一种具有温和蛋白水解解离活性的细菌酶，可保持细胞膜活性，常与胶原酶联合用作辅助酶。</li>
		<li>将从小鼠或人体组织获取的黏膜碎片分别置于含有HBSS的1.7 ml微量离心管或5 ml试管中。使用尖端开口宽度可插入相应试管的剪刀，将组织进一步剪切成2–3 mm大小的片段。静置足够时间，使食管黏膜碎片充分沉降至管底。</li>
		<li>缓慢倾倒出HBSS，注意不要意外丢弃组织。更换新鲜的HBSS，并轻轻振荡。或者，使用1 ml移液器移除HBSS。</li>
		<li>以该方式清洗组织共8次，每次清洗之间轻轻振荡，并留出时间使食管碎片在每次清洗间隔中沉淀。 
		注意：人体组织比新生小鼠组织需要更充分的剪碎。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将小鼠组织与 300 U/ml 胶原酶 XI 和 0.1 mg/ml 中性蛋白酶在室温下于低速摇床上孵育 25 分钟。
	<ol>
		<li>将人组织与300 U/ml XI型胶原酶和0.1 mg/ml中性蛋白酶在室温下置于摇床上，以低速振荡孵育，时间最长可达6小时。 
		注意：人食管的可获取性存在差异。人食管黏膜在酶中孵育最长6小时，可成功建立原代培养。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>酶消化后，用剪刀进一步剪碎组织，并在200 × g离心10分钟。</li>
	<li>弃去上清液。将含有混合细胞悬液的沉淀转移至5 ml离心管中，用添加2%山梨醇的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）洗涤5次，以去除非活细胞和碎片。</li>
	<li>在6孔板中接种细胞，使用含10%胎牛血清（FBS）、10 mg/ml胰岛素、10 µg/ml转铁蛋白、10 µg/ml庆大霉素和2 ng/ml表皮生长因子（EGF）的DMEM培养基进行培养。除EGF外，所有组分均需经0.22 µm滤膜真空过滤，EGF可在过滤后加入。根据切除标本的大小，将从人手术切除组织中获得的细胞分配至多个6孔板中。</li>
	<li>当培养孔细胞融合度达到80%时，使用0.05%胰蛋白酶/乙二胺四乙酸（EDTA）将贴壁细胞传代至T25培养瓶中。用培养基中和后，在400 × g条件下离心。
	<ol>
		<li>6 孔板传代至 T25 培养瓶时，按 1:1 比例传代。汇合的 T25 培养瓶可按 1:2 或 1:3 比例传代。从 T25 培养瓶传代至 T75 培养瓶时，使用 1:1 比例。无论培养容器如何，每 2–3 天更换一次培养基。</li>
		<li>在37 ºC、5% CO₂的湿化培养箱中培养细胞2 培养箱中，使用上述培养基培养肌成纤维细胞。 
		注意：上皮细胞在这些培养或传代条件下无法存活。用于表征及下述研究中的细胞传代次数在5至15代之间。</li>
		<li>在液氮中冷冻保存细胞2 通过向成肌纤维细胞培养基中添加10%二甲基亚砜。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 表征小鼠和人类食管间质细胞
<ol>
	<li>使用倒置显微镜观察细胞形态。观察贴壁细胞的梭形形态（图1）。</li>
	<li>通过评估以下细胞骨架标志物来表征培养的细胞：α-SMA、波形蛋白（vimentin）、结蛋白（desmin）和细胞角蛋白（cytokeratin）。具有成肌纤维细胞样表型的间质细胞表达细胞骨架成肌纤维细胞标志物 α-SMA 和波形蛋白（图2）。
	<ol>
		<li>为了进一步区分培养的间质细胞与肌细胞，可对结蛋白进行免疫染色。对培养细胞进行免疫染色时，将 1.5 × 104 个细胞接种于4孔板腔载玻片中，在成肌纤维细胞培养基中培养24小时。具有成肌纤维细胞样表型的间质细胞结蛋白表达微弱或缺失。间质细胞不表达上皮标志物广谱细胞角蛋白（pan-cytokeratin）（数据未显示）。 
		注意：细胞培养物的评估包括通过免疫细胞化学法检测细胞骨架标志物，以及通过流式细胞术检测细胞表面标志物。免疫细胞化学法作为主要的表征方法，因为成纤维细胞、成肌纤维细胞或肌细胞的细胞骨架蛋白表达谱具有特异性。流式细胞术通过检测上皮、内皮和造血细胞标志物的细胞表面表达来确定培养物的纯度。CD90 可作为辅助手段用于鉴定人源间质细胞，因其在人成纤维细胞和成肌纤维细胞上均有表达；但 CD90 不适用于小鼠间质细胞的表征，因为小鼠T细胞也表达 CD90。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>当细胞达到60%融合度时，用磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗载玻片，并用甲醇固定。将细胞在 -20 °C 的甲醇中孵育10分钟，随后保存于4 °C 的 PBS 中备用。</li>
	<li>按照标准免疫染色流程操作。</li>
	<li>简要地，在加入一抗之前，用含5%山羊血清的PBS对固定后的细胞进行封闭。一抗和二抗也均用含5%山羊血清的PBS稀释。
	<ol>
		<li>检测 α-SMA 和波形蛋白时，使用以下抗体及其稀释比例：小鼠单克隆抗体抗 α-SMA，稀释比例为1:250；兔多克隆抗体抗波形蛋白，稀释比例为1:500。</li>
		<li>一抗在室温下孵育过夜（4 °C），用 PBS 洗涤3次后，加入二抗：罗丹明标记的山羊抗小鼠IgG（稀释比例1:200）和Cy2标记的山羊抗兔IgG（稀释比例1:1,000），室温孵育1小时。</li>
		<li>用4’,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）对细胞核进行复染，浓度为1 µg/mL，孵育1分钟，随后用PBS洗涤。使用倒置显微镜观察载玻片。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过流式细胞术检测小鼠和人食管细胞的造血细胞标志物（CD45）和内皮细胞标志物（CD31），以评估培养物的纯度（图3）。进一步通过间质细胞表面标志物 CD90 的表达情况对人源细胞进行表征。 
	注意：CD90 不能用于鉴定小鼠间质细胞，因为小鼠T细胞也表达 CD90。
	<ol>
		<li>使用非酶解细胞解离液在37 °C 处理10分钟，将培养的小鼠食管间质细胞从培养瓶中分离，用FACS缓冲液洗涤两次，计数后根据标准染色程序，使用FITC标记的CD45抗体和APC标记的CD31抗体进行染色，并设置相应的同型对照。</li>
		<li>使用FACS Calibur仪器收集细胞，并用FlowJo软件分析数据。在染色前，需使用同型对照、正常小鼠脾脏和骨髓细胞优化抗体并滴定最佳浓度。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Stappenbeck, T. S., Miyoshi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+stromal+stem+cells+in+tissue+regeneration+and+wound+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The role of stromal stem cells in tissue regeneration and wound repair.</a> Science. 324 (5935), 1666-1669 (2009).</li>
<li>Powell, D. W., Pinchuk, I. V., Saada, J. I., Chen, X., Mifflin, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+cells+of+the+intestinal+lamina+propria%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Physiol%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal cells of the intestinal lamina propria.</a> Annu Rev Physiol. 73, 213-237 (2011).</li>
<li>Rieder, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-Helper+2+Cytokines%2C+Transforming+Growth+Factor+beta1%2C+and+Eosinophil+Products+Induce+Fibrogenesis+and+Alter+Muscle+Motility+in+Patients+With+Eosinophilic+Esophagitis%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">T-Helper 2 Cytokines, Transforming Growth Factor beta1, and Eosinophil Products Induce Fibrogenesis and Alter Muscle Motility in Patients With Eosinophilic Esophagitis.</a> Gastroenterology. 146 (5), 1266-1277 (2014).</li>
<li>Powell, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paracrine+cells+important+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Paracrine cells important in health and disease.</a> The American Journal of Physiology. 277 (1 Pt. 1), C1-9 (1999).</li>
<li>Powell, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+subepithelial+myofibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Intestinal subepithelial myofibroblasts.</a> The American Journal of Physiology. 277 (2 Pt. 1), C183-201 (1999).</li>
<li>Shaker, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stromal+cells+participate+in+the+murine+esophageal+mucosal+injury+response%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+Gastrointestinal+and+Liver+Physiology%22%5BJournal%5D)">Stromal cells participate in the murine esophageal mucosal injury response.</a> American Journal of Physiology Gastrointestinal and Liver Physiology. 304 (7), 662-672 (2013).</li>
<li>Shaker, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epimorphin+deletion+protects+mice+from+inflammation-induced+colon+carcinogenesis+and+alters+stem+cell+niche+myofibroblast+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Epimorphin deletion protects mice from inflammation-induced colon carcinogenesis and alters stem cell niche myofibroblast secretion.</a> The Journal of Clinical Investigation. 120 (6), 2081-2093 (2010).</li>
<li>Kalabis, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+mouse+and+human+esophageal+epithelial+cells+in+3D+organotypic+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of mouse and human esophageal epithelial cells in 3D organotypic culture.</a> Nature Protocols. 7 (2), 235-246 (2012).</li>
<li>Khalil, H., Nie, W., Edwards, R. A., Yoo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+primary+myofibroblasts+from+mouse+and+human+colon+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation of primary myofibroblasts from mouse and human colon tissue.</a> Journal of Visualized Experiments. (80), (2013).</li>
<li>Rieder, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gastroesophageal+reflux+disease-associated+esophagitis+induces+endogenous+cytokine+production+leading+to+motor+abnormalities%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Gastroesophageal reflux disease-associated esophagitis induces endogenous cytokine production leading to motor abnormalities.</a> Gastroenterology. 132 (1), 154-165 (2007).</li>
</ol>

本研究由美国国立卫生研究院/国家癌症研究所 K08CA153036-01A1（AS）、美国胃肠病学会-通用磨坊贝尔健康与营养研究所肠道生理与健康研究学者奖（AS）以及赖特基金会试点项目奖（AS）资助。

使用小鼠或人类组织进行原代培养的建系技术总体相似，仅需根据组织大小调整剪切和消化时间。我们使用小鼠组织的经验表明，采用上述方法能够稳定成功地建立原代培养体系。该实验方案中的关键步骤包括手术器械的灭菌以及严格遵循组织培养的标准无菌操作技术。小鼠的年龄也是一个关键因素。8至12日龄的新生小鼠 consistently 能够成功获得原代培养物。从未能成功建立来自更年轻新生小鼠的间质细胞。目前仍在尝试从较年长的小鼠中建立类似肌成纤维细胞的间质细胞。其他研究者曾报道可从4至8周龄小鼠中成功分离食管成纤维细胞8。
与结肠肌成纤维细胞的培养不同，在培养小鼠肌成纤维细胞时，只要在培养基中添加抗生素，污染通常较少见。由于培养物来源于新生小鼠，限制因素在于组织体积较小，难以完整剥离肌层。相比之下，在人食管中，肌层与黏膜肌层易于区分并可顺利分离。无论是来源于小鼠还是人食管的培养物，所采用的酶消化及培养条件均不利于免疫细胞或上皮细胞的生长。尽管在培养基中使用了抗生素，人切除标本仍容易受到细菌污染，可能是因为处理的组织量较大。采用标准的组织培养技术并严格灭菌手术器械，可降低污染风险。<...

上皮-间质相互作用参与调控多种胃肠道功能，包括黏膜再生、修复、纤维化以及癌变过程1,2。这些相互作用在小肠和结肠中研究最为深入，可能在食管黏膜疾病中也发挥类似作用3。已发现一类称为肌成纤维细胞的肠道和结肠间质细胞亚群，可介导组织损伤、炎症及修复过程4,5。在远端胃肠道中，这些纺锤形细胞位于上皮与固有层交界处的基底膜旁，其表型定义为α-SMA和波形蛋白阳性，广谱细胞角蛋白阴性，且弱阳性或结蛋白阴性5。
食管间质在细胞或分子水平上尚未得到充分表征。我们在小鼠食管中的研究已证实食管间质中存在α-SMA和波形蛋白（vimentin）阳性细胞，这些细胞偶尔位于复层鳞状上皮下方6。上皮-间质相互作用已被认为参与了食管黏膜疾病的发生，例如胃-食管反流介导的损伤6和嗜酸性粒细胞性食管炎3。纤维化性狭窄也是食管损伤的已知并发症，间质细胞被认为参与了胃肠道纤维化的发病机制。分离这些细胞将有助于开展必要的研究，以探究异常的信号通路。
本投稿提供了建立α-SMA阳性、波形蛋白（vimentin）阳性肌成纤维细胞原代培养所必需的技术，从而有助于填补关于介导这些相互作用的信号通路的知识空白。作者已成功应用该技术建立小鼠结肠肌成纤维细胞原代培养体系7，并进一步优化用于建立小鼠6和人源肌成纤维样食管间质细胞。
本文描述了在将小鼠或人类食管来源的培养物用于后续功能研究之前，建立和鉴定这些培养物所需的条件。这些培养物可传代培养并使用至多15代。通过下述方法分离并建立的原代培养物可获得具有肌成纤维细胞表型的间质细胞，其表现为α-SMA和波形蛋白（vimentin）阳性，结蛋白（desmin）弱阳性或阴性，以及细胞角蛋白（cytokeratin）阴性。该表型不同于食管成纤维细胞的表型（主要为波形蛋白阳性、α-SMA阴性3），也不同于黏膜肌层细胞的α-SMA阳性、波形蛋白阴性表型6。

<table><tbody><tr><td colspan="4">组织培养试剂</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H6648</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>GIBCO, Invitrogen</td><td>17105-041</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase XI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C9407</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>GIBCO, Invitrogen</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>山梨醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1876</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F42442</td><td></td></tr><tr><td>转铁蛋白</td><td>Roche</td><td>10-652-202-001</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶/EDTA</td><td>Corning</td><td>25-052-Cl</td><td></td></tr><tr><td>表皮生长因子</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9644</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">免疫染色试剂</td></tr><tr><td>山羊血清</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G9023</td><td></td></tr><tr><td>抗 &amp;alpha;-SMA 小鼠单克隆抗体&amp;nbsp;</td><td>abcam</td><td>ab7817</td><td></td></tr><tr><td>抗波形蛋白兔多克隆抗体</td><td>abcam</td><td>ab45939</td><td></td></tr><tr><td>Cy2 标记的山羊抗兔二抗</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>111-225-144</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8417</td><td></td></tr><tr><td>CD31-eFluor 450 偶联物</td><td>eBioscience</td><td>48-0319-41</td><td></td></tr><tr><td>CD90-APC 偶联物</td><td>eBioscience</td><td>17-0909-41</td><td></td></tr><tr><td>Annexin V 和 7AAD</td><td>BD Pharmigen</td><td>559763</td><td></td></tr><tr><td>CD16/CD32 封闭用小鼠 Fc 阻断剂</td><td>BD Pharmigen</td><td>2136662</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">设备</td></tr><tr><td>5 ml 离心管</td><td>Eppendorf</td><td>30108310</td><td></td></tr><tr><td>倒置显微镜</td><td>Motic</td><td>AE31</td><td></td></tr><tr><td>生物安全柜和培养箱</td><td>Nuaire</td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://www.nuaire.com/products/&quot; target=&quot;_blank">http://www.nuaire.com/products/&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>4 孔板</td><td>Thermo Scientific</td><td>177437</td><td></td></tr><tr><td>冷冻离心机</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>Olympus 真空驱动过滤系统</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-227</td><td></td></tr><tr><td>荧光显微镜</td><td>Nikon</td><td>Eclipse TE300</td><td></td></tr><tr><td>6 孔板</td><td>Corning</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>T25 培养瓶</td><td>TRP</td><td>90026</td><td></td></tr><tr><td>T75 培养瓶</td><td>Corning</td><td>43064</td><td></td></tr><tr><td>解剖剪刀</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>解剖镊</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>单头棉签</td><td>Kendall</td><td>540500</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">软件</td></tr><tr><td>Metamorph 软件 (Molecular Devices)</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FACSCalibur</td><td>BD Bioscience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FACSVerse</td><td>BD Bioscience</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

从小鼠和人类食管中分离肌成纤维细胞

Isolation of Myofibroblasts from Mouse and Human Esophagus

通过酶消化法获取小鼠和人类食管肌成纤维细胞。取新生小鼠（8–12日龄）食管组织，切碎、洗涤后，用胶原酶和分散酶消化25分钟。人类食管切除标本去除固有肌层和外膜后，将剩余黏膜组织切碎，并用胶原酶和分散酶消化长达6小时。培养所得细胞表达α-SMA和波形蛋白，对结蛋白呈弱表达或不表达。培养条件不利于上皮细胞、造血细胞或内皮细胞生长。通过流式细胞术检测潜在污染的造血细胞和内皮细胞表面标志物的表达，进一步确认培养细胞的纯度。该方法操作简便，可稳定获得非造血、非内皮的间质细胞。该技术的局限性源于分子生物学研究中使用原代培养细胞所固有的问题。 即，不同小鼠或人类个体间建立的培养体系所不可避免的变异性。然而，原代培养更能真实反映 体内 与细胞系相比具有更接近生理状态的优势。这些方法还使研究人员能够从不同的临床和实验条件下分离并培养间质细胞，从而实现组间比较。经鉴定的食管间质细胞还可用于功能研究，以探讨食管疾病中的上皮-间质相互作用。

采用机械法和酶消化法分离的食管间质细胞最初接种并培养于6孔板中。接种后数小时内，通过倒置显微镜观察可见混合细胞悬液松散地贴附于培养板底部（图1A）。在接下来的24小时内，可见从混合细胞悬液中长出的梭形细胞牢固贴附于培养板底部（图1B）。这些出芽状细胞在5天内可覆盖整个孔板区域，并可成功传代，且至少在15次传代过程中保持形态稳定。在低密度（图1C）以及接近融合状态时（图1D）均可观察到梭形贴壁细胞。
在培养皿中培养的食管间质细胞原代培养物的免疫染色显示，肌成纤维细胞细胞骨架标志物 α-SMA 和波形蛋白表达丰富（图2），结蛋白表达微弱，细胞角蛋白则无表达。
可通过检测造血细胞和内皮细胞表面标志物来进一步评估食管肌成纤维细胞原代培养物的细胞纯度。首先确定小鼠食管间质细胞原代培养物的前向散射和侧向散射信号，随后对活细胞进行设门并分析其细胞表面蛋白（图...

我们介绍一种用于培养具有肌成纤维细胞表型的小鼠和人食管间质细胞原代培养物的实验方案。培养的细胞呈梭形形态，表达α-SMA和波形蛋白（vimentin），且不表达上皮细胞、造血细胞和内皮细胞的表面标志物。经鉴定的间质细胞可用于上皮-间质相互作用的功能研究。

小鼠和人类食管肌成纤维细胞通过酶消化法获得。取新生小鼠（8–12日龄）食管组织，剪碎、洗涤……

本实验的总体目标是从小鼠和人类食管中分离原代肌成纤维细胞。首先从供体新生小鼠或人类组织中完整取出食管，随后将黏膜层与固有肌层分离。第二步是将组织切碎，并用 HBSS 多次洗涤。接着，用胶原酶消化组织，进一步切碎以释放间充质细胞及其附着的上皮组织。然后将混合的细胞群体在肌成纤维细胞培养基中进行培养，其中肌成纤维细胞会贴壁生长，而上皮细胞无法存活，被洗去。最终，通过免疫化学和流式细胞术来确认原代培养的细胞为肌成纤维细胞。演示实验操作的人员包括我本人、技术员 Matthew Gargas，以及来自我实验室 Tori 的博士后 chow new。在处死一只8至12日龄的小鼠后，将其背部朝下固定，并用70%乙醇润湿腹部表面。接下来，使用镊子夹住并提起尿道口前方的皮肤。沿腹侧中线从尿道口剪至下巴处，仅剪开皮肤。然后从尿道口向膝盖处做切口，形成一个倒Y形。沿至膝盖的切口后，再在肋骨两侧分别做切口。完成所有切口后，小心剥离皮肤并将其置于一旁。现在提起腹膜，沿腹膜剪开直至横膈膜和肋骨部位。操作剪刀时应始终朝上，以避免损伤胸腔和腹腔内的器官。然后用手术剪轻轻提起肝脏左叶，暴露其下方的胃、胃食管连接部以及食管的腹段；沿胸骨和肋骨的中线剪开，直至颈部肩带区域。再次强调，操作时应使剪刀尖端远离下方器官，保持适当角度，避免损伤。然后将肋骨拉开，暴露胸腔内容物。现在轻轻取出心脏和两叶肺组织。根据需要使用棉签吸收出血。胸段食管是一条位于气管后方、胸椎前方的狭窄而柔韧的管道。在新生儿中，可通过寻找食管胃连接处来区分食管与胃。钝性分离食管周围血管结构，包括脂肪和肠系膜组织，直至食管起始部的颈段腔隙。现在切除食管的全长，并根据需要将其转移至预冷的HBSS中。同时，取一部分胃组织以用于定位。本方案开始时，将从小鼠或人体组织中获得的黏膜碎片在HBSS中分别置于1.7毫升离心管或5毫升试管中进行剪碎处理。现在，在获取人食管间质细胞时，重要的是通过锐性解剖将黏膜层与下方的固有肌层分离。随后在管中使用精细剪刀将组织剪切成2至3毫米大小的组织块。食管黏膜碎片沉降后，小心倾去下层的HBSS，注意不要意外弃去组织。您也可以使用大吸头移液器去除多余的HBSS，然后加入新鲜的HBSS。轻轻振荡混匀管内液体，并让组织自然沉降。静置后，再次倾去 HBSS 并重复此洗涤步骤，共进行八次。八次洗涤后，在室温下以低速设置的摇床上，用胶原酶 11 孵育组织，并对小鼠组织进行孵育，最长时间不超过 25 分钟。在相同条件下，将人体组织孵育六小时。消化完成后，使用精细剪刀进一步剪碎组织，然后在200 G条件下离心10分钟。弃去上清液，将沉淀的组织转移至一支干净的1.7毫升离心管中。然后在组织培养罩内用含2%山梨醇的DMEM洗涤细胞五次，以去除不可存活的细胞和其他碎片。每次洗涤时，让细胞依靠重力自然沉降，然后倾去洗涤液。洗涤结束后，将

isolation-of-myofibroblasts-from-mouse-and-human-esophagus

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

从小鼠和人类食管隔离肌纤维母细胞

本视频展示了从小鼠趾长伸肌（EDL）中分离单根肌纤维的方法。分离得到的肌纤维可用于培养，以研究与肌纤维相关的肌肉干细胞活性。...

肌纤维分离：从小鼠趾长伸肌（EDL）中获取单根肌纤维的技术

肌纤维的分离与培养是金标准 体外...

分离与培养成年骨骼肌单个肌纤维及其卫星细胞

肌成纤维细胞是胃肠道间质中一种具有重要影响的细胞，可在正常及疾病状态下调控多种关键的生理过程。本文介绍一种可从鼠源和人源结肠组织中分离原代肌成纤维细胞的技术，该技术可用于 体外 实验。...

从小鼠和人类结肠组织中分离原代肌成纤维细胞

本手稿描述了一种由正常原代人食管成纤维细胞和鳞状上皮细胞在脱细胞猪源支架内接种培养而构建的组织工程三维食管结构，介绍了其制备方法、表征结果及潜在应用。研究结果表明，该结构可形成成熟的复层上皮，类似于正常人食管组织。...

三维组织工程人食管黏膜模型的制备、表征及其潜在应用

本文介绍了一种从冷冻的胃、小肠和结肠组织中分离并建立原代成纤维细胞/肌成纤维细胞（MF）培养物的方案，所获得的细胞具有MF表型。这些细胞表达CD90、α-SMA和波形蛋白（vimentin）。肌成纤维细胞可用于多种功能检测，包括酶活性和细胞因子产生等实验。...

从人冷冻胃肠道标本中分离CD90+成纤维细胞/肌成纤维细胞

获得成纤维细胞的纯种群体对于研究其在伤口修复和纤维化中的作用至关重要。本文详细描述了一种从正常和损伤的小鼠心脏中分离成纤维细胞和肌成纤维细胞的方法，并通过免疫荧光、逆转录PCR（RTPCR）、荧光辅助细胞分选以及胶原凝胶收缩实验对细胞的纯度和功能特性进行表征。...

成年心脏成纤维细胞与肌成纤维细胞的分离与鉴定

本方案阐述了以下两个方面：1）从小鼠成年腓肠肌中分离和培养原代成纤维细胞；以及...

骨骼肌成纤维细胞外泌体的分离与表征

本文提出一种方法，可从纯合突变型Lamin...

单根肌纤维的分离与培养：早产后发育阶段Emery-Dreifuss型肌营养不良小鼠模型的研究

本文介绍了一种分离小鼠肠道间充质组织（包括端足细胞）的实验方案。分离得到的细胞可用于多种实验应用，例如与小鼠或人源类器官进行共培养，以支持类器官生长并更真实地模拟原始组织中的微环境。...

小鼠肠道间充质的分离获得高产量的端细胞

类器官-成纤维细胞共培养为研究提供了模型 体内...

利用类器官共培养对食管成纤维细胞进行功能表征与可视化

本文提供了一种人食管类器官及其气液界面培养的实验方案。食管类器官的气液界面培养可用于研究细胞因子对食管上皮屏障功能的影响。...

用于研究嗜酸性粒细胞食管炎上皮屏障的三维细胞培养模型

学习从小鼠和人类食管中分离原代肌纤维母细胞的方法，通过胶原酶消化和组织培养获得纺锤形细胞，并利用免疫化学和流式细胞术进行表型鉴定。该技术适用于研究上皮-间质相互作用及食管疾病相关机制。

从小鼠和人类食管中分离肌成纤维细胞

探索更多视频