巨噬细胞通过二维电泳蛋白组学分析

巨噬细胞是参与宿主致病性的关键细胞。巨噬细胞表现出表型和功能多样性，可以通过蛋白质组学分析进行分析和检测。本文介绍了如何对分化为 M1 或 M2 表型的人巨噬细胞的原代培养物进行 2D 电泳。

该程序的总体目标是通过凝胶电泳中的 2D 差异分析人促炎 M1 和抗炎 M 两个巨噬细胞亚群的表型。这是通过首先用正弦染料标记从原代 M1 和 M 两种巨噬细胞培养物中提取的蛋白质来实现的。在第二步中，将蛋白质混合在一起，并通过再水化对样品进行 ISO 电聚焦。

下一个第二维度，在黑暗中用移动的 pH 梯度或 IPG 试纸条进行电泳，然后在凝胶电泳扫描仪中使用差异扫描凝胶。最终，对数字图像进行分析以检测 M1 和 M 两个巨噬细胞亚群之间息肉消化点的差异。在经典 todi 凝胶电泳等现有方法中，该技术的主要优点是该技术更灵敏，只需要 5 微克蛋白质，这对于从人类患者身上获得的样品非常重要。

演示该程序的博士生 Mario Bove、我实验室的 Olivia Beza 和 Magac 技术员要制备单核细胞衍生巨噬细胞的原代培养物，首先在 25 毫升 PBS 中稀释 25 毫升 Buffy coat。然后小心地将稀释的血液上样到分离梯度上，并在细胞完成离心后，以 1600 Gs 和室温离心细胞 20 分钟。在界面层收集单核细胞，然后在第三次洗涤后，在 10 毫升含有 0.1%EDTA 的 PBS 中连续洗涤收获的细胞 3 次。

仅在 PBS 中将细胞离心一次，然后将沉淀重悬于 5 mL 不含血清种子的 RPMI 1640 培养基中。将细胞以 1 倍 10 的密度放入 35 毫米培养皿中，每培养皿 6 个细胞，然后在培养箱中沉淀 90 分钟后，弃去上清液，用 1 毫升 PBS 洗涤贴壁单核细胞 3 次。接下来，将细胞在 10 毫升新鲜培养基中培养，每体积含有 10% 体积的人血清，在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下培养 6 天。

然后，为了产生抗炎的 M 2 巨噬细胞，在培养的第 6 天用每毫升 15 纳克的 IL 4 补充一些培养物，以在第 12 天产生促炎巨噬细胞。用 100 ng/ml LPS 处理分化巨噬细胞的其他培养物 4 小时，以分离巨噬细胞亚群进行 2D 电泳。接下来，用 25 毫摩尔 tri 洗涤目标培养物 3 次，然后用 chaps 提取缓冲液从板底部释放细胞。

接下来，将细胞转移到 1.5 毫升微量离心管中，并在 4 摄氏度下系带。5 分钟后，将细胞分装在 100 微升等分试样中转移至零下 20 摄氏度储存，直至对巨噬细胞亚群进行 ISO 电聚焦的蛋白质浓度分析。首先，将样品调整至 9 微升等分试样，然后在 37 摄氏度下用补充有 2 毫摩尔 TCEP 的裂解缓冲液减少细胞溶液。

1 小时后，将提取物与 S SI 3 和 S SI 5 在 37 摄氏度下孵育，30 分钟后加入等体积的样品缓冲液终止反应。然后用 SCI 5 标记的 M 2 蛋白制备等体积的 S SI 3 标记 M1 蛋白的两个单独混合物。接下来，在等电聚焦池系统上，用 450 微升标记的混合样品在 chaps 提取缓冲液中再水化 IPG 试纸 24 小时，不要施加任何电流。

第二天，在 300 伏特开始聚焦 3 小时，然后设置梯度至 1000 伏特，持续 6 小时，然后是两个 8， 000 伏特梯度，每个梯度 3 小时，以进行第二维电泳，在平衡缓冲液中孵育 IPG 试纸条。10 分钟后，将胶条转移到 12.5% 页面凝胶上，并用低熔点凝胶密封。然后使用 70 伏恒定电压的 edin dsic 系统在 20 摄氏度下过夜进行电泳，然后运行 300 伏，直到溴酚蓝前沿到达凝胶底部，以获取凝胶图像。

将它们放在差分和凝胶电泳成像仪扫描仪的两个低荧光玻璃板之间，并以 5 32、5 80 纳米（3 纳米）和 6 33 6 70 纳米（5 纳米）的激发发射波长扫描凝胶，以产生像素尺寸为 100 微米的图像。使用适当的软件进行分析，然后计算并归一化每个图像中的斑点体积，将归一化的斑点体积分配给凝胶中检测到的每个斑点总值的比例。通过比较两个巨噬细胞组之间的标准化斑点体积值来分析每种巨噬细胞的蛋白质斑点体积的差异，如果变化是 1.5 倍，则认为斑点体积之间的差异是显着的。

在这个实验中。通过 2D 鉴别法测定巨噬细胞 M1 促炎和 M 2 抗炎两种亚型 2D 蛋白模式。在凝胶电泳中，M1 或 M 2 观察到相同的蛋白质模式，与使用的青色染料无关。

有趣的是，凝胶的生物信息学分析揭示了 20 个包含斑点的区域，斑点体积之间的增加和减少被量化，如黄色、蓝色和绿色着色斑点所显示的那样，如果归一化斑点体积的倍数变化大于 1.5 且 P 值小于 0.05，则认为斑点具有显着的差异表达。在此 CHE 之后，可以进行定量、质谱或其他蛋白质组学分析等方法，以回答其他问题，例如响应各种刺激，两个巨噬细胞亚群之间差异表达的蛋白质类型。