神经肌肉接头：利用共聚焦荧光显微镜测量突触大小、碎片化程度及突触蛋白密度的变化

本实验的总体目标是客观量化突触参数，包括突触大小、碎片化程度以及突触后膜中蛋白质的相对密度。首先从实验动物中解离出目标肌肉组织，随后对分离的肌肉进行冷冻切片，并对切片进行免疫荧光染色，以用于荧光显微镜观察。

随后，在磷酸化条件下，对不同处理组的神经肌肉接头图像进行客观取样，并定量分析突触特化结构染色的相对强度。最终，通过共聚焦显微镜获得针对某种处理或基因修饰对神经肌肉接头结构组织影响的可重复定量数据。该方法利用共聚焦显微镜，为评估重症肌无力和运动神经元病等疾病小鼠模型中神经肌肉接头结构变化提供了标准化、客观的实验方案。

通常，尝试该方法的研究人员可能会发现其操作较为困难，因为在共聚焦显微镜上以无偏且客观的方式采集神经肌肉接头（NMJ）样本需要周密的规划。在采样之后，对NMJ的分析必须以一致且可重复的方式进行，而不同动物之间nplate参数的个体差异可能使这一过程变得复杂。根据文本方案，分离、冷冻切片并免疫荧光染色小鼠神经肌肉接头（NMJs）后，通过为每张切片标注仅由第二位研究人员知晓的随机编号，对切片进行盲法处理，直至NMJ参数的定量分析完成。将一张切片置于显微镜载物台上，使用TRITC滤光片组在宽场照明下观察。

从左到右依次移动视野，并返回，直至在共聚焦针孔设置为1.0艾里单位、激光功率较低的条件下，目标终板出现在视野中。针对待成像的终板，优化trit C red BGT的增益和偏移水平。接着，使用488纳米激光优化fit C荧光信号（代表突触素），然后以每层光学切片间隔0.7微米采集终板的Z轴层扫图像。保存图像时，文件名应包含成像日期、玻片代码名称以及终板编号。

重复上述取样和成像步骤，直至从载玻片或样品中收集到 20 个终板。然后在相同的共聚焦设置下，对剩余的编码载玻片重复该过程。从对照载玻片中采集几张图像。

使用 ImageJ 免费软件打开一个 Zack 并在单一荧光通道中，制备最大投影图像。将投影图像保存为 TIF 文件，文件名应包含图像采集日期、样品编号、终板编号以及荧光通道信息。现在使用 ImageJ 打开 Z 投影图像。

选择乙酰胆碱受体（A CHR）图像通道，并选择八位图像类型，将24位RGB彩色图像转换为屏幕上的一幅八位灰度图像。在红色BGT染色通道中，使用多边形工具围绕目标终板区域大致勾画轮廓，排除来自非目标终板区域的任何染色信号。选择图像→调整→阈值，对图像应用最低强度阈值。

调整阈值水平，以分离A CHR染色区域，同时将周围背景信号作为亚阈值排除。然后打开第二个窗口，显示原始全色调图像以进行比较。在仍保留多边形轮廓的情况下，为确认阈值设置，选择“分析”菜单中的“分析颗粒”选项。

将尺寸范围指定为像素数量，从50到无穷大，以消除因电噪声产生的微小伪影。在光电倍增器中，点击“分析颗粒”以生成一个窗口，其中列出所有高于阈值的独立区域及其荧光强度值，并按照它们在二值图像中的出现顺序进行编号。将此数据复制到带标签的电子表格中，以测量终板的总面积。

在多边形区域内，选择“分析-测量”，将 A CHR 区域及其强度数据复制并粘贴到带有标签列的电子表格中。切换至突触素通道，制备最大投影图像。

选择感兴趣的区域，并按刚刚演示的方法设置最低强度阈值。为测量重叠区域，执行以下步骤：打开包含两个通道图像的原始文件，并选择图像堆栈。

将图像堆栈拆分为两个独立的图像。使用J colocalization插件，选择插件中的共定位功能，并将先前记录的A CHR通道和神经通道的阈值分别输入对应的通道查询框中。结果将生成一幅以白色像素表示重叠区域的图像。

将新生成的重叠图像转换为灰度格式，并对最大值应用阈值，以仅选择对应于前两个通道重叠区域的白色像素。在电子表格中记录共定位所得的面积值，该值表示以像素为单位的重叠区域面积，并整理数据电子表格。计算样本均值，并以直方图或散点图形式绘制标准差和标准误。

将A CHR区域绘制成散点图或频数直方图，以在进行统计检验前判断数据是否呈正态分布。按照文本方案中所述完成免疫荧光染色及横切肌纤维切片的成像后，打开原始图像文件，在查看A CHR通道时，选择图像堆栈中的“stack to images”以分离通道，并选择图像类型为8位，将图像转换为8位灰度格式显示。对两个荧光通道均执行此操作。

选择图像堆栈，将两个先前分离的8位图像合并为一个新的堆栈，从而能够在单个窗口内使用多边形工具在两个荧光通道之间切换。用线条紧密围绕A CHR染色区域的边界绘制，选择“分析-测量”以测定封闭区域内A CHR的平均强度。将该数值复制到已标记的电子表格中，同时保留多边形轮廓。

切换到第二个荧光通道并选择分析测量。这将得到由A CHR染色定义的突触区域内目标蛋白的平均染色强度。选择一个远离可见终板染色的区域。

然后选择“分析-测量”以测定平均背景荧光强度。对其他荧光通道重复此测量，并将背景值复制到荧光值电子表格中。从终板的荧光值中减去平均背景值，以获得每个终板处A CHR及目的蛋白的校正后荧光强度。

最后，将目的蛋白校正后的 nplate 荧光强度值除以校正后的 BGT 荧光强度值，得到荧光强度比值，如图所示。A CHR 和突触素的荧光强度均在运动终板的 PERS 突触区与突触区交界处急剧上升。对于此类图像，采用最小阈值即可有效分离出终板上富含 A CHR 或富含突触素的区域。

如本图所示，在老龄小鼠及某些疾病状态下，突触素的终板染色可能强度较低。乙酰胆碱受体（A CHR）簇的边缘可能显得模糊，并可能出现较高水平的突触外自发荧光。散点图显示，在任一单个小鼠胫骨前肌的各个终板中，A CHR 富集区域的范围存在显著差异。然而，在七只样本小鼠中，基于每只15至20张正面终板图像计算的平均 A CHR 面积相似。在横切面中，终板处的 achr 通常呈新月形，但如本图所示，该形态常不规则。

如图中突触素通道所示，较低强度的背景荧光通常有助于判断一处乙酰胆碱受体（A CHR）染色区域代表的是单个终板，还是位于相邻肌纤维上的两个独立终板。此外，许多突触蛋白（如rapson、musk和beta distro glycan）在神经肌肉接头（nplate）处与乙酰胆碱受体共定位。在实施该实验过程中，实验人员在采集和分析神经肌肉接头（nplate）图像时，必须对处理方式和基因型分组保持盲态。

观看本视频后，您应能充分理解如何采集、取样并分析神经肌肉接头的共聚焦荧光图像。最终，研究人员应能够对不同处理组和基因型之间的神经肌肉接头结构参数进行一致且客观的比较。