Name: 神经肌肉接头处：测量突触大小，碎片和改变突触蛋白密度利用共聚焦荧光显微镜 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 18 s
Description: 学习利用共聚焦荧光显微镜定量分析神经肌肉接头突触大小、碎片程度及突触后膜蛋白密度。该方法为重症肌无力和运动神经元疾病等神经肌肉疾病研究提供标准化评估手段。

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本工作由国家卫生与医学研究理事会 [570930] 提供资助。成像工作在博世研究所高级显微技术平台完成。感谢实验室前成员在引用工作中为开发这些方法所做出的贡献。

注意：动物实验的设计、实施和报告应遵循现行指南24。此类工作必须事先获得当地动物福利机构的批准（在本例中为悉尼大学动物伦理委员会）。
1. 动物安乐死与肌肉解剖
<ol>
	<li>使用Shimizu25所述的小鼠操作方法，将小鼠从饲养室转移至单独房间，并通过腹腔注射戊巴比妥钠溶液（30 mg/kg）实施安乐死。将小鼠放回其笼中。</li>
	<li>当小鼠呼吸停止超过1分钟时，通过轻轻夹捏足部测试足部回缩反射，通过轻刷角膜测试角膜反射。只有在确认无反射反应后，方可进行解剖准备。</li>
	<li>在尝试解剖目标肌肉前，参考啮齿类动物解剖图谱（如Chiasson26）和/或寻求有经验的解剖学家的帮助。在切开皮肤暴露肌肉前，先使用小型电动剃毛器去除覆盖皮肤上的毛发。 
	注意：每种解剖位置不同的肌肉，其解剖方法均有所不同。</li>
	<li>使用钝头镊子将肌肉从覆盖的膜和周围组织中分离。夹住并切断远端肌腱，使肌肉与其止点分离。</li>
	<li>小心地剥离并剪断肌肉与其周围组织的连接，直至其起点。将刚解剖出的肌肉短暂置于0.1 M磷酸盐缓冲盐水（PBS）溶液或任氏液中，再进行后续处理。</li>
</ol>
2. 准备肌肉组织以进行冷冻切片
注意：最佳的结构保存可通过全动物灌流固定实现，具体方法如前文所述27，或对小块肌肉采用浸入式固定（见可选步骤 2.1）。然而，4% 多聚甲醛固定可能会影响后续多种抗体探针以及荧光标记的 BGT 染色效果。应特别避免使用戊二醛。若肌肉组织不进行固定，则必须立即进行速冻处理（进入步骤 2.3）。
<ol>
	<li>可选的浸没固定：将肌肉在静息长度下固定于盛有石蜡的培养皿中。用新配制的含2% w/v多聚甲醛（溶于PBS）溶液在室温下覆盖肌肉，固定2小时。用PBS洗涤3次，每次10分钟，共30分钟，然后将PBS替换为含30% w/v蔗糖的PBS溶液，4 °C过夜孵育。</li>
	<li>提前制作模具（“小船”）：将2 cm × 1.5 cm的铝箔片按图1所示折叠成形。将一片硝酸纤维素膜置于模具底部。缓慢倒入冷冻切片包埋剂（见材料表），深度约2 mm，注意避免产生气泡。将肌肉放入模具中，使其与硝酸纤维素膜上的圆珠笔标记线对齐。再加入更多包埋剂，完全覆盖肌肉组织（图1）。</li>
	<li>用永久性标记笔预先标记聚丙烯管。每管中加入一滴水，并将管子浸入液氮中冷却。 
	注意：冷冻的水滴可维持蒸气压，防止样品在长期-80 °C保存过程中脱水。</li>
	<li>佩戴面罩、厚实的防护手套，并使用大号钝头镊子，将装有约2 cm深异戊烷的小金属杯（直径3 cm，深8 cm）部分浸入液氮容器中，持续30秒。取出金属杯并置于实验台面上。使用较小的钝头镊子将含有肌肉和包埋剂的模具放入已冷却的异戊烷中。注意避免液氮混入异戊烷。</li>
	<li>等待约2分钟，待组织块完全冻结后，用钝头镊子将冻好的组织块取出，密封至已预先标记并预冷的对应试管中（步骤2.3）。</li>
	<li>在转移至-80 °C冰箱前，可暂时将试管存放于液氮中。将所有样品信息记录在冰箱内容物的电子表格中。</li>
</ol>
3. 神经肌肉接头表面成像的冷冻切片与荧光染色
<ol>
	<li>剥离铝制模具。在 -20 °C 冷冻切片机腔室内，将冻结的组织块固定于切片机持片夹头上，以便沿肌纤维长轴方向切下 20 μm 厚的冷冻切片（图 1）。用聚-L-赖氨酸或明胶包被的载玻片捞取切片。</li>
	<li>注意：若组织在冷冻前已固定，则省略此步骤。切片在载玻片上干燥 30 分钟后，于室温下在每张切片上滴加一滴含 2% 多聚甲醛的 PBS 溶液，固定 15 分钟。</li>
	<li>在 Coplin 染色缸中用 PBS 洗涤载玻片 3 次，每次 10 分钟，随后将载玻片浸入含 0.1 M 甘氨酸的 PBS 溶液中 30 分钟，以封闭残余醛基。</li>
	<li>用 PBS 洗涤载玻片 10 分钟，然后将其浸入预冷至 -20 °C 的甲醇中 7 分钟。此通透步骤是荧光-BGT 与抗突触素双标染色的常规操作，但可能对其他某些蛋白质的免疫染色产生不利影响。</li>
	<li>用 PBS 洗涤载玻片 2 次，每次 10 分钟，然后将每张载玻片置于稳定且水平的湿盒中。立即在每张切片上覆盖 20 µl 封闭液（含 0.2% Triton X-100 和 2% 牛血清白蛋白（BSA）的 PBS 溶液），室温孵育 1 小时。免疫染色过程中任何阶段均不得使切片干燥。</li>
	<li>进行一抗孵育：逐张取出载玻片，小心吸去每张切片上的多余封闭液，并替换为 20 µl 兔抗突触素抗体（用封闭液按 1:200 稀释）。</li>
	<li>设置一张阴性对照载玻片，仅加入封闭液而不加一抗。每次免疫染色实验均必须包含此“无一抗对照”。</li>
	<li>小心确保一抗始终覆盖在每张切片上，关闭湿盒，并于 4 °C 孵育 1–2 天。</li>
	<li>检查每张切片，确认一抗仍保留在原位。用巴氏吸管轻轻以 PBS 冲洗每张载玻片，并将其放入 Coplin 染色缸中。用 PBS 洗涤所有载玻片 3 次，每次 10 分钟。</li>
	<li>进行二抗孵育：逐张取出载玻片，小心吸去多余的 PBS，平放于湿盒内，在每张切片上覆盖 20 µl 混合液（含 FITC 标记的驴抗兔 IgG 抗体与四甲基罗丹明偶联的 BGT 或其他红色荧光染料偶联的 BGT（TRITC-/redBGT；5 g/ml），用封闭液稀释）。室温孵育 2 小时。</li>
	<li>在 Coplin 染色缸中用 PBS 洗涤载玻片 3 次，每次 10 分钟。</li>
	<li>逐张取出载玻片，小心吸去多余 PBS，用最小体积的抗荧光淬灭甘油封片剂加盖玻片封片。用透明指甲油密封盖玻片边缘，使其充分干燥硬化。</li>
	<li>将载玻片置于 4 °C 避光保存，可保存至一周；或于 -20 °C 长期保存（可达数月）。</li>
</ol>
4. 运动终板的无偏采样与表面成像
<ol>
	<li>通过为每张切片标记一个随机编码数字来实施盲法，该编码仅对第二位研究人员（不参与分析）知晓。因此，操作者在整个样本的神经肌肉接头（NMJ）参数定量分析完成前，对处理分组保持盲态。</li>
	<li>将切片置于显微镜载物台上，使用TRITC滤光片组在宽场照明下观察（63X油镜，1.3 N.A.物镜）。从左到右逐区移动，直至在视野中出现终板（图2A）。 
	注意：取样标准：每一个乙酰胆碱受体（AChR）染色的结构，若相对平坦且面向物镜（即在z轴方向延伸&lt;15 m），则视为一个终板，并对其进行成像分析（AChR染色的月牙形结构代表终板的横截面，应予以排除）。</li>
	<li>将共聚焦针孔设置为1.0艾里单位，使用低激光功率，在待成像的终板处优化TRITC/red-BGT（532 nm激光）的增益和偏移值。随后使用488 nm激光优化FITC/突触素荧光信号。以每层0.7 μm的间隔采集终板的z轴层扫图像。将图像保存为包含成像日期、切片编码名称及终板编号的文件名。 
	注意：使用488 nm和532 nm激光（FITC和TRITC）的扫描应依次进行（而非同时进行），以避免绿色荧光通道受到红色荧光染料的串色干扰，反之亦然（荧光串扰）。</li>
	<li>重复步骤4.2–4.3的取样与成像，直至从每张切片/样本中采集到20个终板图像。</li>
	<li>更换至下一张编码切片，并重复步骤4.2–4.4。对所有编码切片依次重复此过程。</li>
	<li>使用在实验组切片中确定的最佳共聚焦设置，从对照切片（无一抗对照）中采集少量终板图像（FITC荧光通道应呈黑暗状态）。</li>
	<li>共聚焦成像结束后，将图像文件转移至另一台计算机，并将原始文件备份至外部硬盘或服务器。</li>
</ol>
5. 在正面图像中测量突触特化区域的面积
<ol>
	<li>使用 NIH ImageJ 免费软件（http://imagej.nih.gov/ij/）从每个 z-stack 生成最大投影（MIP）图像。将其保存为 tiff 文件（图 2A 和 B）。文件名应包含图像采集日期、样本编号、终板编号和荧光通道（例如，060414_5723_7_FITC.tiff）。</li>
	<li>在 ImageJ 中打开 z 投影图像。选择乙酰胆碱受体图像通道（图 3A），然后选择：图像 &gt; 类型 &gt; 8 位，将 24 位 RGB 彩色图像转换为屏幕上三个 8 位灰度图像。</li>
	<li>使用 ImageJ 多边形工具，在 redBGT 染色（ACHR）通道中围绕目标终板大致绘制轮廓，以包含该单个终板所有明显的染色区域，同时排除来自非目标终板的任何染色信号（图 3C）。</li>
	<li>通过选择：图像 &gt; 调整 &gt; 阈值，对图像应用最低强度阈值（图 3E 及相关 ImageJ 截图）。</li>
	<li>调整阈值水平，以分离 AChR 染色部分，并将周围背景信号作为亚阈值排除（图 3E）。在窗口旁打开第二个显示原始（连续色调）图像的窗口，以便比较，辅助确定阈值。记录该阈值，供后续共定位分析使用。</li>
	<li>保持终板周围的多边形轮廓，选择：分析 &gt; 分析颗粒。在弹出菜单中将尺寸范围设置为：50 至无穷像素（此设置可消除光电倍增管电噪声引起的微小伪影）。</li>
	<li>“分析颗粒”命令将生成一个窗口，列出二值图像中各个离散的超阈值区域及其荧光强度值，并按其在图像中的出现顺序编号（图 3G 及相关 ImageJ 截图）。将此数据复制到带标签的电子表格中。</li>
	<li>通过选择：分析 &gt; 测量，测量总终板面积（多边形内的面积）。这将得到总终板面积。将 AChR 面积和强度数据复制粘贴到电子表格中，确保正确标注列标题，每一行用于记录特定载玻片上各个终板的数据。</li>
	<li>切换至抗突触素荧光通道，并重复步骤 5.1–5.5，但针对 FITC 通道（图 3B、D 和 F）。目标是调整阈值，使生成的二值图像尽可能接近肉眼观察到的染色边界。记录该阈值。</li>
	<li>通过以下步骤测量重叠面积：打开包含两个通道图像的原始文件，选择：图像 &gt; 图像栈 &gt; 图像栈拆分为图像，将其拆分为两个独立图像。</li>
	<li>使用 Colocalization 插件（从 ImageJ 网站下载并安装），选择：插件 &gt; 共定位，并将先前记录的 AChR 和神经通道的阈值分别输入对应的通道查询框。这将生成一个以白色像素表示的重叠图像（图 3H 及相关 ImageJ 截图）。</li>
	<li>将新生成的重叠图像转换为灰度格式，并对其应用最大阈值。最大阈值将仅选择对应于前两个通道重叠区域的白色像素。将所得的“共定位”面积值（以像素为单位）记录在电子表格中。</li>
	<li>整理样本均值数据电子表格，计算并以直方图或散点图形式绘制标准差和标准误20,22。请注意，统计学意义上的 n 值通常表示每组样本的小鼠数量。</li>
	<li>将终板 AChR 面积以散点图或频率直方图形式绘制，以在进行统计检验前判断数据是否呈正态分布（图 6）。</li>
</ol>
6. 利用横向光学切片比较相对染色强度
注意：本实验方案中，需将所有肌肉样本一同处理，并在一次共聚焦显微镜成像过程中完成成像。设计实验时，应为每个肌肉样本预留最多 30 分钟的成像时间。
<ol>
	<li>切割 15 µm 将肌肉纤维长轴垂直的冷冻切片按步骤3.1所述方法收集到载玻片上。</li>
	<li>按照步骤3.2-3.13所述进行荧光染色。</li>
	<li>按照步骤4.1所述，对染色后的载玻片进行编码，以便在成像和分析过程中操作者对处理分组保持盲态。</li>
	<li>使用40倍荧光物镜（数值孔径0.75），快速扫描每张切片的一个区域，以确定乙酰胆碱受体（AChR）信号的增益和偏移水平设置，该设置应适用于所有样本切片中的所有终板。最亮的终板信号在灰度 scale 上应略低于256。此优化过程应针对第二个荧光通道（依次采集）单独进行。记录固定的增益和偏移水平设置，并在整个成像过程中保持不变。</li>
	<li>采集荧光标准样品载玻片的图像（例如， 非漂白荧光微球），在共聚焦成像会话开始和结束时使用相同参数检测激光强度是否可能发生波动。</li>
	<li>利用AChR通道逐步扫描切片以定位终板。</li>
	<li>聚焦以在每个显微镜视野中找到含有最多AChR染色终板的单个光学切面。</li>
	<li>对该单个光学切片扫描两次，并保存平均后的图像（图 4G).</li>
	<li>保持相同的焦平面，切换至第二荧光通道（目标蛋白），并按照步骤6.8采集图像。保存图像文件，在文件名中包含：成像日期、样品编号、图像编号以及用于标识荧光通道的符号。 图4A-F 显示了AChR的终板分布与rapsyn、MuSK或-营养不良聚糖（-DG）相比的示例。</li>
	<li>移动载物台至下一个含有一个或多个终板的视野，重复步骤6.8–6.9。重复此过程，直至共成像60个终板。</li>
	<li>成像实验结束后，将所有文件转移至另一台计算机并进行备份。</li>
	<li>打开每个原始图像文件，在查看AChR通道的同时，选择： 图像 &gt; 堆叠 &gt; 堆栈转图像，以拆分通道。</li>
	<li>选择： 图像 &gt; 类型 &gt; 8bit 将屏幕上的图像转换为8位灰度格式。对两个荧光通道均执行此操作。</li>
	<li>选择： 图像 &gt; 堆叠 &gt; 图像堆叠打开一个由两个先前分离的8位图像组成的新图像栈。随后可在单个窗口内方便地切换两个荧光通道。</li>
	<li>使用多边形工具在 AChR 染色边界的周围紧密绘制一条线（图4I).</li>
	<li>选择： 分析 &gt; 测量 测量封闭区域内AChR的平均像素强度（注意绘制线条时要紧贴边界）。将该值复制到已标注的电子表格中。</li>
	<li>保持相同的多边形轮廓（以定义待测区域），切换至第二荧光通道（例如， 图4B, D, F）并选择： 分析 &gt; 测量这将得到由AChR染色界定的突触区域内目标蛋白的平均染色强度。</li>
	<li>选择一个远离可见终板染色的区域，然后选择： 分析 &gt; 测量 测量平均背景荧光强度。对其他荧光通道重复此步骤，并将背景值填入荧光值电子表格中。</li>
	<li>从每个终板的数值中减去平均背景值，以获得终板处AChR和目标蛋白的校正后信号强度。</li>
	<li>将目标蛋白的校正后终板强度值除以校正后的BGT荧光强度，得到荧光强度比值 14,21</li>
</ol>
7. 使用FRET比较突触后膜AChR密度
注意：本方案用于评估乙酰胆碱受体（AChRs）紧密聚集的程度（&lt;10 nm 间距）中。供体与受体荧光团的精确组合对该FRET实验至关重要。荧光团的名称和详细信息见下文 材料 表格。其光谱特性与FRET的关系已在我们先前的论文中讨论过 14,15.
<ol>
	<li>按照第6.1节所述方法制备固定的横截面冷冻切片。所有样本组必须同时处理，并在同一次共聚焦成像会话中成像。</li>
	<li>在小型塑料管中，将2.5 g/ml红-BGT（FRET供体）与10 g/ml远红-BGT（FRET受体）用封闭液充分混合，通过移液器上下吹打12次。该1:4摩尔比的混合物可使FRET效率最大化14。</li>
	<li>将每张载玻片置于湿化 chamber 中，小心地在每个切片上滴加12 µl上述混合液，室温孵育1.5小时。</li>
	<li>对照切片：用2.5 g/ml红-BGT（仅供体；标记为C1对照）覆盖少量切片，另用10 g/ml远红-BGT（仅受体；标记为C2对照）覆盖部分切片。这些对照切片的孵育条件与步骤7.3相同。</li>
	<li>用PBS洗涤载玻片3次，每次10分钟，然后封片于基于甘油的抗淬灭封片剂中（见步骤3.12）。</li>
	<li>按照步骤6.7的方法对神经肌肉接头进行采样。由于荧光标记BGT分子的随机结合，供体和受体的荧光信号应在神经肌肉接头处完全共定位。</li>
	<li>对照图像采集：使用40倍物镜和低激光功率，针对C1对照载玻片上的神经肌肉接头优化红BGT的增益和偏移设置；针对C2对照载玻片上的神经肌肉接头优化远红BGT的增益和偏移设置。确认不存在任何荧光串色。</li>
	<li>保持激光功率、增益和偏移设置不变，切换至实验组载玻片，采集两个荧光通道的图像（光漂白前）。</li>
	<li>选择性光漂白单个神经肌肉接头的一部分区域内的远红-BGT：缩小扫描区域，使用633 nm激光以100%功率连续扫描10次。扫描区域内的荧光应明显变暗。</li>
	<li>恢复原始激光功率和缩放设置，使用步骤7.7中设定的共聚焦参数，采集光漂白后两个荧光通道的图像。</li>
	<li>根据受体（远红-BGT）光漂白后供体（红-BGT）荧光强度的百分比增加，计算FRET效率（E），公式如下*： 
	<img alt="光漂白后荧光恢复公式，实验数据分析方程。" fo:content-width="2.5in" src="/files/ftp_upload/52220/52220eq1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="方程1"> 
	*适用于所有受体光漂白后供体荧光增强的情况。</li>
</ol>

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</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

本文所述的实验方案使我们能够可靠地测量和量化神经肌肉接头（NMJ）在多种条件下的性质变化，包括正常衰老和疾病状态。用于表面神经肌肉接头成像的方法将使研究人员能够比较突触前和突触后特化区域的面积以及突触重叠/对准区域的面积。为了比较突触前和突触后蛋白的相对强度，推荐使用第二种基于横断光学切片的方案。第三种方案专门用于检测突触后膜中乙酰胆碱受体（AChR）排列紧密程度的变化。
特异性对照在免疫荧光显微镜中至关重要。在使用任何一抗进行间接免疫荧光染色时，必须首先确认该抗体能够特异性地结合肌肉切片中的靶蛋白。不同的组织处理和固定方法可能对抗体的特异性产生不同程度的影响。必须确认免疫荧光染色（例如对rapsyn的染色）确实与运动终板处的乙酰胆碱受体（AChR）共定位。还必须检查阴性对照切片，以确保抗体结合具有特异性。例如，rapsyn免疫荧光染色的最佳阴性对照应来自rapsyn-/-小鼠的切片，这些切片使用抗rapsyn抗体染色后不应显示任何终板信号。非特异性荧光可能来源于组织内源性荧光物质（自发荧光），或荧光标记的二抗的非特异性结合。此类荧光常因醛类固定而加剧。此外，...

神经肌肉接头（NMJ）是介导神经系统与骨骼肌之间通信的关键突触连接，对所有自主运动至关重要。长期以来，荧光显微镜被用于研究转基因对小鼠 NMJ 的影响1-3，或比较年龄、饮食、运动和疾病对啮齿类动物 NMJ 的作用4-11。这些研究极大地增进了我们对 NMJ 生理学和病理生理学的理解，但所报告的参数多样（例如，AChR 面积、终板面积、周长、碎片化指数），常常使得不同研究之间的结果难以比较。目前，人们对临床前研究人员能够证明研究可重复性的期望日益提高，尤其是在使用啮齿类疾病模型的研究中12。本文所述的实验方案是在一系列研究 NMJ 发育、生理及病理生理变化的过程中逐步优化而成。此类研究需要测量小鼠运动终板处突触特化区域的面积，以及突触后特化区域内突触蛋白的相对堆积密度13-15。
这些方法的应用价值已在抗MuSK型重症肌无力小鼠模型的近期研究中得到证实。将抗MuSK阳性重症肌无力患者体内的IgG每日注射至成年小鼠体内，可在2周内导致小鼠出现肌无力症状16。对肌肉切片进行共聚焦显微镜最大投影成像，通过突触素（位于神经末梢）和突触后乙酰胆碱受体（AChR）的双标染色显示，AChR染色面积进行性减少是主要变化。重要的是，该下降速率足以解释突触电位振幅的相应降低、突触传递失败以及肌无力现象17,18。其他研究团队也报道了定性相似的结果10,19。此后，相同的神经肌肉接头（NMJ）测量方法已被用于评估三种治疗抗MuSK型重症肌无力药物在此小鼠模型中的作用效果20,21。
久坐不动的衰老过程可能导致神经肌肉连接的丧失。本文所述的实验方案揭示了随着小鼠进入老年阶段，运动终板处神经末梢突触素的面积出现与年龄相关的下降。相同的方法还发现，自主运动锻炼在很大程度上能够防止突触前神经末梢面积的减少22，这与其他研究团队先前的研究结果一致4。在肌萎缩侧索硬化症的SOD1G93A小鼠模型中，也观察到神经肌肉连接的丢失9,23。
上述研究显示，多种健康状况可能导致神经肌肉接头（NMJ）处突触前或突触后特化区域的面积减少。这可能引起突触功能受损，或预示神经肌肉连接的完全丧失。本文描述了三种可用于定量分析突触特化区域面积和密度的实验方案。第一种方案的目的是利用荧光显微镜，对哺乳动物神经肌肉接头处突触前和突触后特化区域的面积及其对齐情况进行实用且可重复的测量。通过二维最大投影共聚焦图像，并结合NIH ImageJ软件进行图像分析，检测突触素染色区域（突触小泡）、突触后乙酰胆碱受体（AChR）以及突触重叠区域面积的变化。共聚焦成像参数（增益和偏移水平）针对每个神经肌肉接头进行优化，以最大程度地获取用于识别突触特化区域的视觉信息。神经肌肉功能障碍也可能由突触后AChR和/或其它突触蛋白密度的改变引起。第二种方案可用于检测突触后蛋白（如MuSK、rapsyn、dystroglycan、磷酸化Src激酶和磷酸化AChR）相对密度的变化18,21。
在重症肌无力中，突触后膜内乙酰胆碱受体（AChR）密度降低是导致突触传递障碍和肌肉无力的直接原因。第三种方案描述了一种荧光共振能量转移（FRET）方法，用于评估突触后膜内相邻AChR之间距离的变化14,15。该方法通过检测用荧光标记的α-银环蛇毒素（BGT）标记的相邻AChR之间的能量转移来实现。只有当荧光供体和受体探针之间的距离小于10 nm时，才会发生FRET。该技术可揭示AChR排列紧密程度的（亚显微）变化，这些变化可能与突触电位的幅度直接相关。
在过去十年中经过优化的这三种方案，以一致且可重复的方式提供了神经肌肉接头完整性的互补性评估。采用标准化的方案和参数，应有助于比较基因和环境干预对哺乳动物神经肌肉接头的影响。

<table><tbody><tr><td>扫描共聚焦显微镜</td><td>Leica</td><td>DM 2000 配备&amp;nbsp;TCS SP2 系统</td><td>大多数扫描共聚焦显微镜均适用。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td></td><td>Zeiss</td><td>LSM 510 Meta&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Leica</td><td>SPE-II</td><td></td></tr><tr><td>Alexa555-α-银环蛇毒素（红色-BGT）</td><td>Life technologies</td><td>B35451</td><td>用于标记乙酰胆碱受体（AChRs）</td></tr><tr><td>Alexa647-&amp;alpha;-银环蛇毒素（远红-BGT）</td><td>Life technologies</td><td>B35450</td><td>远红荧光：通过目镜几乎不可见&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>兔抗突触素抗体</td><td>Life technologies</td><td>18-0130</td><td>不同批次的一抗其有效工作稀释度可能存在差异</td></tr><tr><td>FITC-抗rapsyn 单克隆抗体1234</td><td>Milipore</td><td>FCMAB134F</td><td>与FITC偶联的单克隆抗体</td></tr><tr><td>FITC-驴抗兔IgG</td><td>Jackson</td><td>711-095-152</td><td>多克隆二抗的质量可能因来源和批次而异</td></tr><tr><td>最佳切割温度化合物（O.T.C.）</td><td>ProSciTech</td><td>IA018</td><td>冷冻肌肉组织时使用的恒冷箱包埋介质&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>DABCO</td><td>Sigma</td><td>10981</td><td>一种可减缓荧光染料光漂白的封片介质</td></tr></tbody></table>

神经肌肉接头：利用共聚焦荧光显微镜测量突触大小、碎片化程度及突触蛋白密度的变化

The Neuromuscular Junction: Measuring Synapse Size, Fragmentation and Changes in Synaptic Protein Density Using Confocal Fluorescence Microscopy

神经肌肉接头（NMJ）是哺乳动物运动神经元控制随意肌收缩的大型胆碱能突触。NMJ 结构的改变可导致神经传导失败，从而引起肌纤维无力、萎缩甚至死亡。许多研究已探讨了基因修饰或疾病如何改变小鼠 NMJ 的结构。然而，由于这些研究常采用不同的参数和分析方法，直接比较其研究结果往往较为困难。本文描述了三种实验方案。第一种方案利用共聚焦显微镜的最大强度投影图像，测量终板处富含乙酰胆碱受体（AChR）的突触后膜区域面积以及覆盖其上的突触前神经末梢内突触小泡染色的面积。第二种方案比较突触后膜中突触蛋白免疫染色的相对强度。第三种方案则利用荧光共振能量转移（FRET）技术检测终板处突触后 AChR 排列密度的变化。这些方案已在一系列研究中得到开发与优化。文中还讨论了影响结果质量与一致性的各种因素，并提供了健康年轻小鼠 NMJ 的正常参考数据。

神经肌肉接头处突触面积的测量
任何面积估算都依赖于划定边界以定义突触特化区域的范围。在健康年轻成年动物的肌肉中，神经肌肉接头（NMJ）图像应显示出乙酰胆碱受体（AChR）和突触素（synaptophysin）染色清晰明确的边界（图2A 和 B）。在突触周围区与运动终板突触区交界处，AChR和突触素的荧光强度均急剧上升（图5A' 和 B'）。对于此类图像，采用一个略高于突触外背景荧光的最低阈值，即可轻松分离出终板上富含AChR或富含突触素的区域（图5A' 和 B' 中的水平虚线）。在老年小鼠以及某些疾病状态下，AChR的终板染色可能较弱，AChR簇边缘可能显得模糊，并且突触外自发荧光水平可能更高（图5D；17,22）。边界不清晰的荧光染色可能在突触面积估算中引入误差。在所有情况下，目标是选择一个...

在多种情况下，神经肌肉接头（NMJ）会发生改变，有时可能导致突触功能障碍。本报告描述了基于荧光显微镜的方法，用于量化此类结构变化。

神经肌肉接头（NMJ）是哺乳动物运动神经元控制随意肌收缩的大型胆碱能突触。

本实验的总体目标是客观量化突触参数，包括突触大小、碎片化程度以及突触后膜中蛋白质的相对密度。首先从实验动物中解离出目标肌肉组织，随后对分离的肌肉进行冷冻切片，并对切片进行免疫荧光染色，以用于荧光显微镜观察。随后，在磷酸化条件下，对不同处理组的神经肌肉接头图像进行客观取样，并定量分析突触特化结构染色的相对强度。最终，通过共聚焦显微镜获得针对某种处理或基因修饰对神经肌肉接头结构组织影响的可重复定量数据。该方法利用共聚焦显微镜，为评估重症肌无力和运动神经元病等疾病小鼠模型中神经肌肉接头结构变化提供了标准化、客观的实验方案。通常，尝试该方法的研究人员可能会发现其操作较为困难，因为在共聚焦显微镜上以无偏且客观的方式采集神经肌肉接头（NMJ）样本需要周密的规划。在采样之后，对NMJ的分析必须以一致且可重复的方式进行，而不同动物之间nplate参数的个体差异可能使这一过程变得复杂。根据文本方案，分离、冷冻切片并免疫荧光染色小鼠神经肌肉接头（NMJs）后，通过为每张切片标注仅由第二位研究人员知晓的随机编号，对切片进行盲法处理，直至NMJ参数的定量分析完成。将一张切片置于显微镜载物台上，使用TRITC滤光片组在宽场照明下观察。从左到右依次移动视野，并返回，直至在共聚焦针孔设置为1.0艾里单位、激光功率较低的条件下，目标终板出现在视野中。针对待成像的终板，优化trit C red BGT的增益和偏移水平。接着，使用488纳米激光优化fit C荧光信号（代表突触素），然后以每层光学切片间隔0.7微米采集终板的Z轴层扫图像。保存图像时，文件名应包含成像日期、玻片代码名称以及终板编号。重复上述取样和成像步骤，直至从载玻片或样品中收集到 20 个终板。然后在相同的共聚焦设置下，对剩余的编码载玻片重复该过程。从对照载玻片中采集几张图像。使用 ImageJ 免费软件打开一个 Zack 并在单一荧光通道中，制备最大投影图像。将投影图像保存为 TIF 文件，文件名应包含图像采集日期、样品编号、终板编号以及荧光通道信息。现在使用 ImageJ 打开 Z 投影图像。选择乙酰胆碱受体（A CHR）图像通道，并选择八位图像类型，将24位RGB彩色图像转换为屏幕上的一幅八位灰度图像。在红色BGT染色通道中，使用多边形工具围绕目标终板区域大致勾画轮廓，排除来自非目标终板区域的任何染色信号。选择图像→调整→阈值，对图像应用最低强度阈值。调整阈值水平，以分离A CHR染色区域，同时将周围背景信号作为亚阈值排除。然后打开第二个窗口，显示原始全色调图像以进行比较。在仍保留多边形轮廓的情况下，为确认阈值设置，选择“分析”菜单中的“分析颗粒”选项。将尺寸范围指定为像素数量，从50到无穷大，以消除因电噪声产生的微小伪影。在光电倍增器中，点击“分析颗粒”以生成一个窗口，其中列出所有高于阈值的独立区域及其荧光强度值，并按照它们在二值图像中的出现顺序进行编号。将此数据复制到带标签的电子表格中，以测量终板的总面积。在多边形区域内，选择“分析-测量”，将 A CHR 区域及其强度数据复制并粘贴到带有标签列的电子表格中。切换至突触素通道，制备最大投影图像。选择感兴趣的区域，并按刚刚演示的方法设置最低强度阈值。为测量重叠区域，执行以下步骤：打开包含两个通道图像的原始文件，并选择图像堆栈。将图像堆栈拆分为两个独立的图像。使用J colocalization插件，选择插件中的共定位功能，并将先前记录的A CHR通道和神经通道的阈值分别输入对应的通道查询框中。结果将生成一幅以白色像素表示重叠区域的图像。将新生成的重叠图像转换为灰度格式，并对最大值应用阈值，以仅选择对应于前两个通道重叠区域的白色像素。在电子表格中记录共定位所得的面积值，该值表示以像素为单位的重叠区域面积，并整理数据电子表格。计算样本均值，并以直方图或散点图形式绘制标准差和标准误。将A CHR区域绘制成散点图或频数直方图，以在进行统计检验前判断数据是否呈正态分布。按照文本方案中所述完成免疫荧光染色及横切肌纤维切片的成像后，打开原始图像文件，在查看A CHR通道时，选择图像堆栈中的“stack to images”以分离通道，并选择图像类型为8位，将图像转换为8位灰度格式显示。对两个荧光通道均执行此操作。选择图像堆栈，将两个先前分离的8位图像合并为一个新的堆栈，从而能够在单个窗口内使用多边形工具在两个荧光通道之间切换。用线条紧密围绕A CHR染色区域的边界绘制，选择“分析-测量”以测定封闭区域内A CHR的平均强度。将该数值复制到已标记的电子表格中，同时保留多边形轮廓。切换到第二个荧光通道并选择分析测量。这将得到由A CHR染色定义的突触区域内目标蛋白的平均染色强度。选择一个远离可见终板染色的区域。然后选择“分析-测量”以测定平均背景荧光强度。对其他荧光通道重复此测量，并将背景值复制到荧光值电子表格中。从终板的荧光值中减去平均背景值，以获得每个终板处A CHR及目的蛋白的校正后荧光强度。最后，将目的蛋白校正后的 nplate 荧光强度值除以校正后的 BGT 荧光强度值，得到荧光强度比值，如图所示。A CHR 和突触素的荧光强度均在运动终板的 PERS 突触区与突触区交界处急剧上升。对于此类图像，采用最小阈值即可有效分离出终板上富含 A CHR 或富含突触素的区域。如本图所示，在老龄小鼠及某些疾病状态下，突触素的终板染色可能强度较低。乙酰胆碱受体（A CHR）簇的边缘可能显得模糊，并可能出现较高水平的突触外自发荧光。散点图显示，在任一单个小鼠胫骨前肌的各个终板中，A CHR 富集区域的范围存在显著差异。然而，在七只样本小鼠中，基于每只15至20张正面终板图像计算的平均 A CHR 面积相似。在横切面中，终板处的 achr 通常呈新月形，但如本图所示，该形态常不规则。如图中突触素通道所示，较低强度的背景荧光通常有助于判断一处乙酰胆碱受体（A CHR）染色区域代表的是单个终板，还是位于相邻肌纤维上的两个独立终板。此外，许多突触蛋白（如rapson、musk和beta distro glycan）在神经肌肉接头（nplate）处与乙酰胆碱受体共定位。在实施该实验过程中，实验人员在采集和分析神经肌肉接头（nplate）图像时，必须对处理方式和基因型分组保持盲态。观看本视频后，您应能充分理解如何采集、取样并分析神经肌肉接头的共聚焦荧光图像。最终，研究人员应能够对不同处理组和基因型之间的神经肌肉接头结构参数进行一致且客观的比较。

the-neuromuscular-junction-measuring-synapse-size-fragmentation

Research

科研

JoVE Journal

Neuroscience

神经科学

神经肌肉接头处：测量突触大小，碎片和改变突触蛋白密度利用共聚焦荧光显微镜

本方案详细介绍了如何通过免疫细胞化学方法，在分离的神经元培养物和脑切片中定量突触数量。利用特定区室的抗体，我们标记突触前终末以及突触后特化位点。我们将突触定义为这些标记物产生的信号之间共定位的位点。...

量化突触：一种基于免疫细胞化学的突触数量检测方法

突触处聚集的神经递质受体丰度显著影响突触强度。该方法可在单个突触分辨率下，对秀丽隐杆线虫（C.

C. elegans 中突触荧光的自动化定量分析

果蝇神经肌肉接头（NMJ）被用作研究突触形态与功能的模型。本视频介绍了研究人员用于表征 NMJ...

Drosophila 神经肌肉接头（NMJ）定量分析：一种评估突触形态与功能的方法

来源：Marinello, M.，等. 通过共聚焦与超分辨率显微镜联合表征小鼠神经肌肉接头.J. Vis. Exp.

通过共聚焦与超分辨率显微镜联合表征小鼠神经肌肉接头

本文概述了一种利用免疫荧光技术在海马切片中准确识别和分析突触的实验方案。...

海马体啮齿类动物脑切片中突触密度的评估

本方案展示了如何利用超分辨率显微镜研究原代神经元培养物中蛋白质的共定位。...

超高分辨率成像研究原代神经元中蛋白质与突触标志物的共定位

准确检测神经肌肉接头组分的能力对于评估病理或发育过程引起的结构改变至关重要。本文详细介绍了一种简便的方法，可用于获取高质量的全装片神经肌肉接头图像，进而进行定量测量。...

单根骨骼肌纤维的分离用于全 mounts 神经肌肉接头的免疫荧光及形态计量分析

描述了两种相关方法，用于可视化突触传递所需的亚细胞事件。这些方案通过活细胞成像技术，实现对突触前钙离子内流和突触囊泡膜融合动态过程的实时监测。 体外...

肌萎缩侧索硬化症模型中突触功能的实时荧光检测

本方案描述了一种通过共聚焦与STED显微镜联合进行神经肌肉接头形态计量分析的方法，用于量化脊髓性肌萎缩（SMA）和与ColQ相关的先天性肌无力综合征（CMS）小鼠模型中的病理改变。...

通过共聚焦与超分辨率显微镜联合技术对小鼠神经肌肉接头进行表征

DetectSyn：一种快速、无偏倚的荧光方法用于检测突触密度的变化

本方案描述了通过切断的神经将荧光钙染料加载到小鼠运动神经末梢的方法。此外，还介绍了一种利用共聚焦显微镜记录外周神经末梢快速钙瞬变的独特方法。...

使用共聚焦显微镜以高时间分辨率记录小鼠神经肌肉接头中的钙瞬变

学习利用共聚焦荧光显微镜定量分析神经肌肉接头突触大小、碎片程度及突触后膜蛋白密度。该方法为重症肌无力和运动神经元疾病等神经肌肉疾病研究提供标准化评估手段。

神经肌肉接头：利用共聚焦荧光显微镜测量突触大小、碎片化程度及突触蛋白密度的变化

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