神经肌肉接头处：测量突触大小，碎片和改变突触蛋白密度利用共聚焦荧光显微镜
December 26th, 2014
神经肌肉接头 （NMJ） 在各种情况下发生改变，有时会导致突触衰竭。本报告描述了基于荧光显微镜的量化此类结构变化的方法。
该程序的总体目标是客观量化突触参数，包括突触大小、碎裂和突触后膜中蛋白质的相对密度。这是通过首先从实验动物中解剖感兴趣的肌肉来实现的。接下来，对解剖的肌肉进行冷冻切片，并将切片进行免疫染色以进行荧光显微镜检查。
然后在 phos 上，客观地对来自不同治疗组的神经肌肉接头图像进行采样，并量化突触特化的相对染色强度。最终，通过共聚焦显微镜获得治疗或基因改造对神经肌肉接头结构组织影响的可重复定量测量。好吧，该方法提供了使用共聚焦显微镜的标准化客观方案，以评估重症肌无力和运动神经元疾病等疾病的小鼠模型中神经肌肉接头结构的变化。
通常，尝试这种方法的人可能会发现它很困难，因为在共聚焦显微镜上以无偏和客观的方式对 NPLS 进行采样后需要进行规划NPLS 的采样分析需要以一致且可重复的方式进行，其中 nplate 参数之间的动物间差异可能使这变得困难。在分离冷冻切片和免疫荧光染色后，小鼠神经肌肉接头或 njs，根据文本方案，通过用随机数标记每个载玻片来蒙蔽载玻片，该随机数只有第二个研究人员知道，直到 NMJ 参数的量化完成。将载玻片放在显微镜载物台上，并使用 trit C 滤光片组在宽视场照明下观察它。
从左到右和向后逐渐穿过场，直到场中出现一个端板，共聚焦针孔设置为 1.0 通风单位，并使用低激光功率，优化要成像的端板上 trit C 红色 BGT 的增益和偏移水平。接下来，使用 488 纳米激光器优化代表突触素的 fit C 荧光，然后收集端板的 Z 堆栈，每个光学切片之间间隔为 0.7 微米。使用包含成像会话日期、载玻片代码名称和端板编号的文件名保存图像。
重复刚刚演示的采样和成像程序，直到从载玻片或样品中收集 20 个端板。然后在相同的共聚焦设置下对剩余的编码载玻片重复该过程。从控制幻灯片中拍摄一些图像。
使用图像 J 免费软件打开 Zack 并在一个荧光通道中准备最大投影图像。将投影保存为 TIF 文件，并附上文件名，包括图像会话日期、示例代码、端板编号和荧光通道。现在使用图像 J 打开 Z 投影。
选择乙酰胆碱受体或 A CHR 图像通道，然后选择图像类型 8 位，以使用多边形工具将 24 位 RGB 彩色图像转换为屏幕上的一个 8 位灰度图像。在红色 BGT 染色通道中，在目标终板周围画一个粗略的轮廓，排除任何不是源自目标终板的染色。选择图像调整阈值以将最小强度阈值应用于图像。
调整阈值电平以隔离 A CHR 染色部分，同时将周围的背景信号排除为子阈值。然后打开第二个窗口，其中包含原始全色调图像以进行比较。要在多边形轮廓仍然存在的情况下确认阈值设置，请在弹出菜单中选择 analyze， analyze particles。
将大小范围（以像素数为单位）指定为 50 到无穷大，这样可以消除由电噪声引起的微小伪影的选择。在照片倍增器中，单击分析粒子以生成一个窗口，其中包含离散的超阈值区域列表及其荧光强度值，这些值在二进制图像中出现时进行了编号。将此数据复制到标记的电子表格中，以测量端板总面积。
在多边形中，选择 Analyze measure （分析测度），将 A CHR 面积和强度的数据复制并粘贴到带有标记列的电子表格中。切换到突触素通道。准备最大投影图像。
选择感兴趣的区域，并设置最小强度阈值，如刚才所示。要测量重叠区域，请应用以下步骤。打开包含双通道图像的原始文件，然后选择图像堆栈。
堆叠到图像以将其拆分为两个单独的图像。使用图像 J 共定位插件，选择插件共定位，并将先前为 A CHR 和神经通道记录的阈值输入到相应的通道查询框中。结果是白色像素的重叠图像。
将新创建的重叠图像转换为灰度格式，并对最大值应用阈值，这将仅选择与前两个通道的重叠区域对应的白色像素。在电子表格中记录共定位的结果面积值，该值表示以像素为单位的重叠面积，准备数据电子表格。样本均值计算标准差和标准误差并将其绘制为直方图或散点图。
将 A CHR 区域绘制并板为散点图或频率直方图，以确定在统计检验之前数据是否呈正态分布。按照文本协议中概述的横向肌纤维切片准备免疫荧光染色和成像后，打开原始图像文件，并在查看 A CHR 通道时，选择图像堆栈到图像以拆分通道，选择图像类型 8 位将 8 位灰度格式转换为屏幕。对两个荧光通道执行此作。
选择图像堆栈 要堆叠的图像，并从两个先前分离的 8 位图像中打开一个新的堆栈，这样就可以使用多边形工具在单个窗口内的两个荧光通道之间切换。在 A CHR 染色的边界周围画一条紧线，选择分析测量以测量封闭区域内 A CHR 的平均强度。将此值复制到已标记的电子表格中，同时保留多边形轮廓。
切换到第二个荧光通道并选择 analyze measure。这将产生 A CHR 染色定义的突触区域内目标蛋白质的平均染色。选择远离可见终板染色的区域。
然后选择 analyze measure （分析测量） 以测量平均背景荧光强度。对其他荧光通道重复测量，并将背景值复制到荧光值电子表格中。从终板值中减去平均背景值，以获得 A CHR 和每个终板目标蛋白质的校正强度。
最后，将目标蛋白质的校正 nplate 强度值除以校正后的 BGT 荧光强度，得到荧光强度比，如下所示。A CHR 和突触素的荧光强度在运动终板的 PERS 突触和突触部分之间的边界急剧上升。对于此类图像，最小阈值将很容易隔离终板富含 A CHR 或富含突触素的区域。
如图所示，在老年小鼠和某些疾病状态下，突触素的终板染色可能不那么强烈。A CHR 簇边缘可能看起来模糊，并且可能存在更高水平的突触额外自发荧光散点图揭示了任何小鼠的胫骨前肌终板中 A CHR 富集区域的相当大的范围。尽管如此，基于面部终板图像上 15 到 20 的平均 A CHR 面积在 7 只样本小鼠中是相似的 在横向切片中，终板 achr 通常表现为新月形，但这种形状通常是不规则的，如此处所示。
如此处突触素通道上显示的低强度背景荧光通常揭示 A CHR 染色斑块是代表位于相邻肌肉纤维上的单个端板还是两个单独的端板。此外，许多突触蛋白（如 rapson、musk 和 β distro 聚糖）与 nplate 的 CHR 共定位。在尝试此过程时，重要的是实验者在采样和分析 nplate 图像期间对治疗和基因型组保持盲目。
观看本视频后，您应该对如何收集、采样和分析神经肌肉接头的共聚焦荧光图像有很好的了解。最终，研究人员应该能够一致和客观地比较不同处理组和基因型之间 nplate 的不同结构参数。
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概述
本研究重点关注神经肌肉接点（NMJ）及其在可能导致突触失效的各种条件下的变化。所描述的方法利用荧光显微镜来量化神经肌肉接点的结构变化。
研究的关键组成部分
科学领域
- 神经科学
- 细胞生物学
- 荧光显微镜学
背景
- 神经肌肉接点对肌肉收缩至关重要，并且受到多种神经肌肉疾病的影响。
- 了解神经肌肉接点的结构可以提供关于重症肌无力和运动神经元疾病等疾病的见解。
- 定量评估神经肌肉接点的变化可以帮助评估治疗效果。
- 荧光显微镜允许详细观察突触结构。
研究目的
- 客观地量化突触参数，如大小和碎片化。
- 评估突触后膜中蛋白的相对密度。
- 建立评估神经肌肉接点结构的标准化协议。
使用的方法
- 从实验动物中解剖肌肉。
- 对解剖的肌肉进行冷冻切片。
- 进行荧光显微镜的免疫染色。
- 使用共聚焦显微镜定量分析突触特化。
主要结果
- 获得了重复性的神经肌肉接点结构组织定量测量。
- 有效评估了不同治疗组中神经肌肉接点结构的变化。
- 该方法提供了对基因修饰对神经肌肉接点影响的见解。
- 标准化的协议提高了结果的可靠性。
结论
- 该研究提出了一种评估神经肌肉接点变化的可靠方法。
- 定量分析可以帮助理解神经肌肉疾病。
- 未来的研究可以在这些发现的基础上探索治疗干预措施。
常见问题
Executive Industry Relevance
Quantitative confocal fluorescence microscopy of the neuromuscular junction (NMJ) enables objective assessment of synaptic structure, fragmentation, and protein density in preclinical models. Standardized measurement protocols reduce variability and support robust target validation for neuromuscular disease research. These capabilities enhance predictive confidence at the discovery and translational inflection points for portfolio advancement.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables objective quantification of synaptic parameters for mechanistic de-risking.
- Supports functional target validation by measuring structural changes in NMJs.
- Facilitates comparison of genetic or treatment effects across experimental groups.
- Improves predictive confidence for early-stage neuromuscular disease models.
Screening & Assay Development
- Provides standardized imaging and analysis workflows for reproducible data generation.
- Delivers quantitative outputs suitable for assay development and compound screening.
- Enables reliable evaluation of synaptic integrity as a screening endpoint.
- Supports platform reuse across multiple neuromuscular research programs.
Translational & Preclinical Research
- Aligns structural NMJ measurements with disease-relevant phenotypes in preclinical models.
- Enables continuity from discovery through preclinical validation of therapeutic hypotheses.
- Supports risk-adjusted advancement decisions based on quantitative synaptic metrics.
- Facilitates biomarker development for translational research when supported by protein density changes.
Pipeline & Workflow Integration
This confocal imaging and analysis protocol integrates from early discovery through preclinical research, supporting hypothesis testing, target validation, and translational continuity.
- Discovery Biology: Objectively quantifies synaptic structure and protein density for hypothesis testing and pathway clarification.
- Screening: Provides reproducible, quantitative readouts for assay standardization and compound evaluation.
- Analytics: Generates statistical outputs, including area, intensity, and overlap metrics, to compare experimental conditions.
- Translational Research: Links NMJ structural changes to disease models, supporting preclinical decision-making.
- Enterprise Reuse: Offers a standardized, scalable protocol adaptable across neuromuscular research portfolios.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in neuromuscular target validation.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible, and scalable imaging and analysis workflows.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient portfolio management.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of neuromuscular disease programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in confocal microscopy and quantitative image analysis.
- Needs access to fluorescence imaging instrumentation and analytical software (e.g., ImageJ).
- Demands rigorous cross-team standardization for sampling and analysis protocols.
- Adaptation may be needed for different muscle types or disease models.
- Variability in animal models and staining quality can impact reproducibility and must be controlled.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:48
Unbiased Sampling and En Face Imaging of Motor Endplates
3:41
Measuring the Area of Synaptic Specializations in en face Images
7:36
Relative Staining Intensities Compared Using Transverse Optical Sections
9:47
Results: Measurement of Synaptic Area at the Neuromuscular Junction
11:29
Conclusion
