Nutrient Regulation by Continuous Feeding for Large-scale Expansion of Mammalian Cells in Spheroids

该过程的总体目标是在受控的营养条件下培养大量细胞。使用细胞培养实验室中的常规设备。相关算法允许在实验范围内控制和纵营养物质。

这种方法可以帮助回答大规模细胞培养应用的关键问题。例如人类细胞疗法。该技术的主要优点是可以大规模培养细胞，营养物质和气体分布均匀。

与静态或散装补料的细胞培养物相比，这允许更高的细胞密度，提高产量并减少细胞损失。这可以使用大多数细胞培养实验室中常见的设备来完成。这种方法的视觉演示可能对新的研究人员有所帮助，因为所使用的这些技术可能难以掌握，因为在无菌条件下必须按特定顺序执行大量步骤。

收集饲喂系统所需的五个主要组件。培养基储液槽、蠕动泵、搅拌式生物反应器、废液储液槽和定制设计的管路采样套件。使用 1 升玻璃瓶建立培养基储液罐。

使用两升玻璃瓶的废物储存库。使用 250 mL 体积玻璃反应器的搅拌式生物反应器。使用数字蠕动泵或带有 8 通道泵头的类似泵来控制介质更换。

液槽和改性生物反应器盖由坚硬且可高压灭菌的塑料组装而成。带有不锈钢管直通端口，可通过无菌过滤器提供通气，并允许在储液槽和生物反应器之间转移介质。将由多孔玻璃曝气管制成的流出管连接到改良的搅拌悬浮生物反应器盖上。

使用聚偏二氟乙烯管接头和耐用的蠕动泵管组装可高温高压灭菌的灌注管组。截面的长度取决于不同组件之间的距离。使用两种管径组装进料管。

将 L/S 14 用于初级管路，该管路将跨越从生物反应器到培养基储液罐的距离。使用适当的 PVDF 适配器，将 L/S 13 管路长度插入泵段管路长度的中间。使用标准 PVDF 软管倒钩管适配器将两根 L/S 14 管连接在较短的泵段管的两侧。

使用较大直径的 L/S 16 管组装分段管段以清除废物，并在中间插入一小段 L/S 14 管用于泵送段。这与使用 PVDF 软管倒钩适配器的进料管组件相同。通过用三种较短的 L/S 14 管路长度构建管路组，组装管路组的最终组件。

通过 T 型 HVDF 连接器和两个小软管夹连接在一起，其中两个管道长度上。将样品组件连接到生物反应器盖上的不锈钢样品连接器。灭菌后，将连接一个无菌气体过滤器，用于将气体排放到其中一个夹紧长度。

另一个用于连接无菌采样注射器。在开始实验之前，如文本方案中所述，在将样品组件连接到生物反应器时对其进行高压灭菌。使用此组件根据需要从生物反应器中收集无菌样品，而不会干扰连续进料过程。

将无菌通气孔连接到旋转瓶盖、培养基容器、废液容器和样品端口的适当位置。按照文本协议中的说明培养和收获细胞。让细胞在生物安全柜中在胰蛋白酶中室温孵育 2 到 3 分钟，然后收集到锥形管中。

然后收集小细胞样品并用台盼蓝染色。如文本方案中所述，使用显微镜和标准血细胞计数器进行台盼蓝染色计数细胞密度。对于每种条件，将所需数量的总细胞添加到无菌搅拌悬浮生物反应器中。

使用移液管将培养基添加到搅拌的悬浮生物反应器中，以达到所需的总培养体积。将带有细胞的搅拌悬浮生物反应器移至细胞培养箱内的搅拌板上。在生物反应器中培养细胞，在 37 摄氏度下不换料 3 天，二氧化碳为 5%，相对湿度为 100%，搅拌速度为 70 rpm，以形成球状体。

球状体形成后，从培养箱中取出搅拌好的悬浮生物反应器。在生物安全柜中组装连续饲喂系统的组件。首先用所需的培养基填充新鲜培养基储液槽，然后连接到补料管线的一侧。

还要确保新鲜培养基储液槽使用无菌过滤器正确通风。应更换生物反应器入口上的无菌过滤器，以便在培养基进入生物反应器之前对其进行过滤。将废液管线连接到中等废液储液器，并确保废液储液罐用无菌过滤器正确排气。

将搅拌后的悬浮生物反应器放在培养箱内的搅拌板上，使用与球状体形成相同的培养参数。将新鲜培养基储液罐放入附近的迷你冰箱中。确保进料管线能够在不阻止门关闭的情况下离开冰箱。

同样重要的是，进料管线不要被冰箱或培养箱的门夹住。废液储液槽可以放在培养箱外的工作台上，位置方便。将剩余的管端插入培养箱，并将进料管连接到生物反应器入口上的过滤器。

然后将废液管线连接到流出管端口。接下来，将进料管路和废液管路的泵段放入泵头中，确保正确的方向，以便进料管路将培养基从新鲜培养基储液器泵入搅拌式悬浮生物反应器，而废液管路将培养基从生物反应器泵送到废液储液器中。使用文本协议中所述的调整后的进给率公式计算进给率。

使用带有细胞计数信息的最新样品，以及生长速率预测和中等葡萄糖测量值，以估计维持培养物中所需葡萄糖浓度所需的补料速率。根据计算出的进料速率设置泵速。重复进给速率计算并调整每个采样点的泵速。

使用静态搅拌悬浮生物反应器和连续补料搅拌悬浮生物反应器培养方法对 β-TC6 胰岛素瘤球状体培养进行中等葡萄糖测量。使用标准高葡萄糖培养基补料。连续饲喂能够消除葡萄糖波动，但在培养期间培养基中的平均葡萄糖水平变化很大，远高于生理范围。

调整后的饲喂能够消除波动，并在培养期间将葡萄糖浓度保持在接近生理水平。在这里，比较了常规培养基更换的搅拌悬浮生物反应器、恒定进料速率搅拌悬浮生物反应器培养物和调整进料速率搅拌悬浮生物反应器培养物在 21 天培养期间以细胞数量倍数变化报告的细胞生长。按照此程序，将采用其他方法，如不同的条件 cam 来回答其他问题，例如新细胞系的营养需求或特定的实验结果。

开发后，这项技术为细胞生物学领域的研究人员探索患有癌症或其他疾病的人类细胞的代谢需求铺平了道路。观看此视频后，您应该对如何组装丰富的细胞培养系统以更好地控制培养条件并最大限度地提高细胞产量有很好的了解。不要忘记，与人体细胞一起工作可能非常危险，因此在执行此程序时应始终采取预防措施，例如防止血源性病原体。