Name: 该拼图方块的使用作为评价环境富集的功效的一种手段 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 50 s
Description: 了解如何使用拼图方块方法评估小鼠认知功能，研究环境富集对神经科学的影响。该方法操作简便、灵活可调，适用于不同认知负荷任务，为神经退行性疾病研究提供有效工具。

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作者没有致谢内容。

伦理声明：所有实验程序均经悉尼大学动物伦理委员会批准，并符合澳大利亚国家卫生与医学研究委员会的指导方针。实验所用C57/BL6J小鼠均饲养于悉尼大学博世啮齿类动物设施。所有小鼠均饲养于同一间通风良好的房间内 21 °C 12小时光照-黑暗循环条件下，光照于0600开启，饲养于独立通风笼具中，环境温度为常温 随意摄取 可自由获取干粮和水。妊娠晚期的雌性动物被随机分配至标准饲养环境或环境富集饲养条件下。
1. 饲养（丰富化水平）：
<ol>
	<li>选取4只妊娠晚期的成年雌性小鼠。将其中2只随机分配至标准环境条件，每只单独置于一个洁净的标准小鼠笼（总体尺寸为391 × 199 × 160 mm）中，笼内放置一个红色小鼠窝。其余2只小鼠则置于一个洁净的大鼠尺寸笼（总体尺寸为462 × 403 × 404 mm）中，用于丰富化环境条件。</li>
	<li>在丰富化环境笼内放置多种旨在增强感觉和运动刺激的物体（例如跑轮、视觉刺激物、带香味的棉球、魔术贴条）。</li>
	<li>每隔2至3天在笼内重新布置这些物体的位置，并更换已损坏的物品。</li>
	<li>在出生后21天断奶时，按性别分开小鼠，并根据其生长环境条件分别饲养于单性别群体中。丰富化环境条件下每笼饲养3至10只小鼠，标准环境条件下每笼饲养2至5只。待小鼠达到成年（12–14周龄）后，开始进行行为学测试。</li>
</ol>
2. 拼图盒的构建
<ol>
	<li>准备6块白色亚克力板（或其他非多孔材料）：一块750 × 280 mm，两块280 × 250 mm，两块750 × 250 mm，以及一块150 × 280 mm（见图1）。</li>
	<li>准备一块280 × 250 mm的黑色亚克力板，并在其一侧切割出一个40 × 40 mm的方形开口（见图1）。</li>
	<li>按以下方式组装迷宫箱：将750 × 280 mm的亚克力板作为箱体底部，将两块280 × 250 mm的亚克力板作为箱体两端，将两块750 × 250 mm的亚克力板作为箱体两侧。</li>
	<li>从箱体一端向内测量150 mm，将黑色亚克力板横置于箱内，使其将箱体分隔为两个隔室（一大一小），且开口边缘与箱底齐平。</li>
	<li>取150 × 280 mm的白色亚克力板，将其覆盖在较小的隔室上方，确保完全遮盖该区域，形成一个黑暗的“目标箱”隔室。通过合页将此亚克力板固定在主箱体上，或保持可完全移除，以便在行为测试期间取下。</li>
	<li>取3块亚克力板（每块4 × 120 mm），拼接成“U形”通道。</li>
</ol>
<img alt="带标注尺寸的盒式示意图：750x280x250 mm，40 mm 切口，结构设计。" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52225/52225fig1highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 1"> 
图 1：迷箱任务的示意图。迷箱是一个丙烯酸材质的盒子，由一个开阔区域（600 × 280 mm）和一个有遮蔽的目标箱区域（150 × 280 mm）组成，整体尺寸为 750 × 280 mm。两个区域之间由一块隔板（灰色）分隔，隔板上设有一个 40 × 40 mm 的开口，允许动物从开阔区域进入有遮蔽的目标区域。随着测试的进行，该开口会被越来越难移除的障碍物封闭。动物需经历为期五天的实验流程，包括四种不同的障碍条件，每种条件进行三次试验。
3. 拼图盒实验任务的执行
<ol>
	<li>使用70%酒精彻底清洁迷箱。每测试一只动物后均需重复此步骤。</li>
	<li>在迷箱的目标箱区域放置一个干净的红色小鼠窝，并盖上目标箱的盖子。</li>
	<li>若需测试障碍条件，则将障碍物放置于目标箱的门口处（见图2）。</li>
	<li>将待测试小鼠放入迷箱的开放区域，使其朝向目标箱，并置于距离目标箱最远的一端。</li>
	<li>记录动物四肢全部进入迷箱目标箱区域所需的时间。</li>
	<li>若动物未能进入目标箱，在达到设定的时间限制时终止试验（见表1）。</li>
	<li>一次试验结束后，将动物从迷箱中取出，并放入单独的暂养笼中，直至下一次试验开始。每只动物每次试验之间应保持60至180秒的间隔。</li>
	<li>对每只动物，连续5天每天进行3次试验，共测试4种障碍条件，每种条件进行3次试验。每种特定障碍条件的第3次试验必须安排在后续的不同日期进行（见表1）。</li>
</ol>
<img alt="详细列出每日障碍设置和时间限制的试验条件表。" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52225/52225table1.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Table 1"> 
表1：迷箱任务方案。迷箱任务共进行五天，包含四种障碍条件。前四天每天进行三次试验，第五天进行一次。每种障碍条件共进行三次试验，其中前两次在同一天完成，第三次在次日进行。每种障碍条件的第一次试验用于测试动物天生的问题解决能力，第二次试验用于评估任务学习与强化效果，第三次试验则用于检测解决方案的保持与回忆能力。
<img alt="迷宫实验示意图，展示大鼠探索障碍物以演示空间学习与记忆。" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52225/52225fig2highres.jpg" width="600" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 
图 2：迷箱任务中的障碍条件。迷箱实验区域及其在本研究中所采用的障碍条件的示意图。（A） 条件 0（C0），开放区域与目标箱区域之间的门道中无任何障碍物。（B） 条件 1（C1），开放区域与目标箱区域之间的门道中设有“U 形”通道。（C） 条件 2（C2），通道内填满干净的垫料。（D） 条件 3（C3），开放区域与目标箱区域之间的门道中设有“纸巾塞”障碍。（E） 条件 4（C4），开放区域与目标箱区域之间的门道中设有“泡沫塞”障碍。实验区域的尺寸详见“方法”部分及图 1。
4. 数据解读
<ol>
	<li>将数据表示为完成试验所需的时间（包括动物在规定时间内未完成任务的无效试验）或无效试验的次数。</li>
	<li>采用重复测量方差分析（ANOVA）评估饲养条件对 Puzzle Box 中表现的影响，其中障碍类型/条件（C）和任务编号（T）为组内因素，丰富化水平（标准 vs. 丰富）为组间因素。</li>
</ol>

作者声明不存在竞争性财务利益。

实验结果表明，拼图盒可有效用于评估丰富环境（EE）的影响。在丰富环境中饲养的小鼠，在该行为实验中解决障碍类拼图任务所需时间显著少于在标准实验室条件下饲养的小鼠。此外，在所测试的四种条件中的三种条件下，这种差异在第一次试验中最为显著，提示丰富环境对动物固有的问题解决能力影响更大，相较于其对任务中所遇问题的解决方案进行强化或记忆的能力而言更为突出。
Puzzle Box 的主要优势在于其材料成本低廉、构建和实施简单，且无需对受试对象进行预先训练。此外，该方法可灵活调整，以使用多种障碍材料和条件。例如，本实验方案改编自先前的研究，这些研究曾采用 Puzzle Box 评估多种小鼠疾病状态模型的认知能力5-7。其他研究也曾利用 Puzzle Box 的变体，评估认知增强型抗精神病药物的影响33，以及在此测试环境中进行观察学习的能力34。因此，Puzzle Box 提供了一种行为学任务，能够评估多种环境、遗传和药理学干预因素，同时具有相对较高的时间和成本效益。
然而，这种...

环境富集（Environmental enrichment, EE）可被定义为一种为动物提供比标准实验室环境更多的社交互动机会、运动活动以及更强感官刺激的饲养环境。研究表明，EE 能持续影响动物的行为，带来一系列变化，例如减轻应激和焦虑相关行为8-10，改善学习与记忆任务中的表现8,11，促进运动协调能力和探索行为的早期发展11，改变母体照料行为8，以及增强对成瘾性物质的抵抗能力12-15。此外，EE 还被发现能够缓解神经退行性疾病的效应，在亨廷顿病1-4,16、帕金森病17和阿尔茨海默病18的动物模型中，可延缓疾病 onset 并减轻症状严重程度。
这些变化与丰富环境已知在全脑范围内诱导的解剖学和分子水平改变相关。从发育早期开始在丰富环境中饲养的动物表现出多种神经系统的改变，包括脑重量和皮层厚度增加、树突分支增多9,2-22 以及突触密度升高23。丰富环境可改变生长因子表达的水平和时序9,24-30，这已被证明有助于感觉25,26,28,29、记忆30以及运动环路31,32的加速发育。
既往研究在探讨丰富环境（EE）的影响时，由于未考虑各项研究中所使用的不同动物种类和环境类型，有时会得出相互矛盾的结果9,24,27,30。目前尚缺乏一种一致且简单的可行为任务，用于评估不同品系和物种动物中各种丰富环境范式的有效性。
拼图盒任务被设计为一种简单的测试，用于评估动物天生的问题解决能力 7。将动物置于开放区域后，其需要移除位于小开口内的障碍物，以进入被遮盖的区域/庇护所。每个受试动物需进行三次相同的障碍任务，以评估三种不同的认知特征。第一次试验可获得其固有或天生问题解决能力的基线指标。同一天进行的第二次试验，可在一定程度上反映动物改进并强化特定障碍物移除策略的能力。第三天进行的第三次试验，则有助于了解受试动物对已习得解决方案的记忆与回忆能力。
动物解决这些“障碍谜题”的动机可能多种多样，可能激发其回避开阔场地并寻找庇护所的先天欲望，以及探索周围环境的内在驱动力6,7。推动动物完成谜题箱任务的多种潜在行为驱动因素表明，大脑的多个区域均参与了该任务表现的调控。先前的研究显示，在精神分裂症的小鼠模型中，前额叶皮层和海马体均参与了该任务的学习过程5。大鼠的损毁研究也揭示了大量参与谜题箱操作的脑区，包括多个丘脑核团、下丘脑、小脑以及边缘系统结构。这些发现共同表明，执行此类解决问题的任务涉及一系列与认知功能相关的神经结构。
拼图箱已成功用于评估小鼠的问题解决能力，以及精神分裂症小鼠模型所表现出的认知缺陷5-7。该任务的表现已被证明具有高度一致性，并与其他认知行为测试的结果具有良好相关性6。因此，本研究的目标是将拼图箱任务改进为一种简单且可靠的评估丰富化环境（EE）效果的方法。

<table><tbody><tr><td>黑色亚克力板</td><td></td><td></td><td>280 × 250 mm，其中一侧切出一个 40 × 40 mm 的&quot;门&quot;</td></tr><tr><td>白色亚克力板</td><td></td><td></td><td>280 × 250 mm</td></tr><tr><td>白色亚克力板</td><td></td><td></td><td>280 × 250 mm</td></tr><tr><td>白色亚克力板</td><td></td><td></td><td>750 × 250 mm</td></tr><tr><td>白色亚克力板</td><td></td><td></td><td>750 × 250 mm</td></tr><tr><td>白色亚克力板</td><td></td><td></td><td>150 × 280 mm</td></tr><tr><td>白色亚克力板</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>通道</td><td></td><td></td><td>3 块 40 × 120 mm 的有机玻璃或亚克力板</td></tr><tr><td colspan="4">注：若无法获得亚克力板，使用有机玻璃或其他类似的无孔材料亦可。</td></tr><tr><td>网络摄像头</td><td>Logitech</td><td>C210</td><td>使用电工胶带固定在顶部；也可使用三脚架。</td></tr><tr><td>VirtualDub v1.10.4</td><td>VirtualDub</td><td>N/A&amp;nbsp;</td><td>用于录制行为视频的软件，输入源来自网络摄像头。</td></tr><tr><td>TopScan v 3.0</td><td>CleverSys Inc.</td><td>N/A&amp;nbsp;</td><td>用于小鼠行为的自动化俯视追踪与分析的软件。录制的视频在事后进行分析。</td></tr></tbody></table>

利用迷箱评估环境丰富化效果的方法

The Use of the Puzzle Box as a Means of Assessing the Efficacy of Environmental Enrichment

环境富集可显著影响神经回路的发育与功能。此外，已有研究表明，在亨廷顿病模型中，环境富集能够有效延缓症状的出现1-4，提示环境因素可对神经退行性疾病中所观察到的进行性细胞水平损伤产生神经保护作用。然而，动物所接受的环境富集方式可能存在显著差异。此外，目前尚无简便直接的方法来评估环境富集的效果：大多数方法都需要较为复杂的动物行为范式和/或死后解剖学/生理学分析。本实验方案描述了一种简单且低成本的行为检测方法——谜题箱（Puzzle Box）5-7，用于可靠地评估相较于在标准实验室条件下饲养的小鼠群体，增强的社会性、感觉和运动刺激对小鼠认知功能的影响。该简单的解决问题任务利用了啮齿类动物天生倾向于躲避开阔环境而寻求庇护所的行为特性。通过在庇护所入口处设置日益复杂的障碍物来评估认知能力。个体动物成功移除障碍并进入庇护所所需的时间作为任务表现的主要衡量指标。该方法可为快速可靠地评估不同环境富集方案对认知功能的影响提供有效手段，从而为进一步系统性地确定特定环境因素在延缓神经发育障碍和神经退行性疾病发病过程中所起的作用奠定基础。

此处描述的结果为代表性样本，数据来自多个不同窝别的实验动物群组。所有行为学测试均在0700至1100时之间进行，每组动物的测试顺序随机化。在丰富化环境（enriched environment）中饲养的动物（n = 14，雌性7只，雄性7只）完成迷宫盒（Puzzle Box）中障碍任务所需时间显著短于在标准环境中饲养的动物（n = 15，雌性7只，雄性8只）（见图3）（以饲养环境为组间因素的重复测量方差分析，F = 19.525，p &lt;0.001）。这种丰富化环境对表现的影响在迷宫盒测试的各个单独试验中均被观察到：丰富化环境组小鼠解决每一项独立障碍任务所需时间均显著更短，尤其在每种条件下的第一次试验中表现尤为明显（以饲养环境为组间因素的单变量方差分析：条件1-试验1（C1T1），F = 4.308，p = 0.048；C1T3，F = 4.317，p = 0.047；C2T1，F = 9.466，p = 0.005；C2T2，F = 5.164，p = 0.031；C2T3，F = 7.031，p = 0.013；C3T1，F = 19.979，p = 0.000；C3T2，F = 5.788，p...

环境富集可能对神经退行性疾病具有潜在的保护作用。然而目前尚无简便方法来评估富集措施的有效性。本方案描述了一种用于评估动物认知功能的简单“迷题箱”方法，以揭示环境富集的效果。

环境富集可显著影响神经环路的发育和功能。此外，研究表明环境富集还能成功……

以下实验的总体目标是评估环境富集对小鼠认知功能的影响。首先构建一个包含两个腔室的迷箱，然后使小鼠适应测试环境，并让其自行发现通往遮蔽目标箱的入口。接下来，用多种障碍物或谜题阻挡小鼠巢穴的入口，对小鼠进行挑战。结果显示，环境富集能够可靠地改善小鼠在谜题箱任务中的表现。该技术相较于其他方法的主要优势在于其装置构建和实施过程简便易行，且在设计具有不同认知负荷水平的任务时具有极高的灵活性。因此，该方法可用于解决神经科学领域的一系列问题，特别是与评估环境干预措施有效性相关的问题。尽管该方法可为环境富集对认知功能的影响提供见解，但也可应用于其他系统，例如人类疾病的转基因动物模型以及新型治疗药物的临床前测试。首先，将怀孕小鼠随机分配至标准饲养条件组或富集环境组：标准组小鼠置于标准小鼠笼中，富集组小鼠则置于大鼠尺寸的笼子中。每隔两到三天，将多种旨在增强感觉和运动刺激的物品放入丰富化饲养笼中。在笼内定期移动这些物品，并在断奶分笼时更换已损坏的物品。将幼鼠按性别分开，并根据其成长环境的条件进行分组饲养，以维持丰富化环境组的饲养条件。每笼饲养3至10只小鼠，标准饲养组每笼2至5只。当这些动物达到成年时，应开始行为学测试。在12至14周龄时，使用六块白色亚克力板构建迷箱，另将一块带有方形开口的黑色亚克力板从一端起150毫米处插入，以将箱子分隔为两个隔室。将一块白色亚克力板覆盖在较小的隔室上方，形成一个黑暗的目标箱。丙烯酸材质的盖子可以通过铰链固定在主箱体上，或保持自由状态以便在行为测试期间完全取下。接下来，将三块丙烯酸板连接起来，制成一个U形通道，用于后续测试中的障碍物。首先，用70%酒精彻底清洁迷箱。每次测试动物之间均需重复此步骤。接下来，将一只干净的红色小鼠放入目标箱内的 igloo 中，并在准备就绪后盖上盖子。将小鼠放置于开阔场地区域的远端，使其朝向目标箱。立即启动计时器，并记录动物进入另一侧腔室所需的时间。停止计时。当动物的四肢全部进入目标箱区域时，终止该次试验。如果动物在预设的时间限制内未进入目标箱，则在试验结束后将动物移出，并放入单独的暂养笼中。每只动物两次试验之间的间隔应保持在60至182秒之间。每天进行三次试验，连续五天。在测试过程中，引入四种阻塞条件，每种条件各进行三次试验。首先，引入之前构建的U型通道，记录动物进入目标箱所需的时间，以创建另一种阻塞条件。在测试其他可引入的障碍物之前，先在通道内及周围放置 bedding。包括在门口处放置一块组织或泡沫塞。每种障碍条件的第三次试验应始终在后续的另一天进行。测试完成后，计算每次试验的完成时间，包括动物在规定时间内未完成任务的无效试验。最后，使用重复测量方差分析（NOVA）来评估饲养条件对动物在迷箱任务中表现的影响。该数据代表了从出生起在丰富环境或标准环境中饲养的成年动物在迷箱任务中的表现。在丰富环境中饲养的动物解决迷箱中障碍任务的速度显著快于在标准环境中饲养的动物，测试的第2至第4天期间差异最为明显。在进行该操作时，重要的是要记住以适当的方式处理实验动物，以防止因意外应激而引发的行为变化。因此，在完成该操作后，可采用其他方法，如免疫组织化学、靶向外科干预或在体电生理记录，以揭示所观察到的行为效应背后的机制。通过观看本视频，您应能够充分理解如何在AMA模型中获得高效且可靠的认知功能初步评估。

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