基于社区环境采集样本的全血成分快速分离与提取

本实验方案的总体目标是提供一个简化的流程，以实现快速、高效的眼科样本通量处理，并同时处理全血样本。在非临床环境下，采用重叠方式进行真空采血管样本处理，以便高效地分离出高质量的DNA、RNA、外周血单个核细胞（PBMC）、血清以及血浆和红细胞的残留组分。处理流程首先对血清真空采血管进行离心，然后从一个含有真空采血管的试管中取出部分样本用于DNA提取，接着对试管进行离心处理。

随后，在完成DNA提取后，可从K2 EDTA真空采血管中进行白细胞来源的RNA提取。将每支真空采血管中的血液分别通过滤器过滤，并用PBS洗涤，然后加入RNA稳定剂，再返回含有真空采血管的试管中。吸除残留血浆后，用PBS洗涤单个核细胞层。

在离心过程中，收集残留的红细胞，并对分离出的血清进行分装。最后，将PBMC保存在细胞冻存液中。最终，可在采集后两小时内获得高质量的新鲜血液组分，所有可用于检测的样本均可在两天内准备就绪。

与现有方法相比，该技术的主要优势在于其操作可在非临床环境中同时进行，从而在两天内即可获得起始材料，用于多种下游应用，包括微阵列、表观遗传学实时逆转录聚合酶链式反应（R-T-P-C-R）以及流式细胞术分析。本次实验操作将由我的实验室主管 Amy Weckl 进行演示。开始全血样本处理时，请确保缓冲液、离心机和加热块均已准备就绪。

在样本追踪单上记录真空采血管的送达时间。收到样本后，在标本记录单上记录血清分离开始时间，并立即开始处理：将7 mL血清真空采血管在关闭刹车和加速度的条件下进行离心。

在 BSL 二级细胞培养操作台中记录 DNA 提取的开始时间。使用带气溶胶盖的水平转子，在 4°C 条件下以 1300 ×g 离心 20 分钟，对血清真空采血管进行离心。将含有分离胶的真空采血管轻轻倒置 5 次，然后从其中一根采血管的上层取 200 微升全血，分别加入到两管各含 20 微升蛋白酶的分装管中。

将蛋白酶和血液微量离心管留在生物安全柜中，并继续对含有空泡容器的细胞进行离心。离心前，记录单个核细胞（PBMC）分离的开始时间，该时间必须在采血后两小时内。

将已置于气溶胶密闭容器中的含真空采血管倒置8到10次。然后在22摄氏度、1600 ×g条件下，以关闭刹车和加速度的设置离心真空采血管30分钟。返回生物安全柜中的DNA提取样品，向每个含有蛋白酶和血液的微量离心管中加入200 µL Buffer AL。

盖上管盖，将管子从生物安全柜中取出。随后涡旋振荡15秒。振荡后立即进行瞬时离心处理。

按照随附的文字实验方案进行DNA提取，直至在Ellucian上从柱子中洗脱出DNA。每名受试者的两个柱子的DNA合并，每名受试者总产量为800微升。记录白细胞RNA提取的开始时间。

用转移针刺穿K2 EDTA真空采血管的橡胶隔膜。在组装K2 EDTA试管系统后，保留护套和螺帽以备后续使用。使用金属刮勺的一端安全地卸下针头，并将针头插入一个空的10毫升真空采血管中。

颠倒K型EDTA真空采血管滤器接收管组件以完成装置安装。过滤并用3毫升PBS洗涤后，使用新的10毫升注射器吸取3毫升RNA稳定剂。冲洗滤膜，确保RNA稳定剂保持连接状态。然后在不回抽活塞的情况下将注射器从滤器上拆下。

用转移穿刺针上保留的鞘管和螺帽密封滤器的进样口和出样口，并使滤器保持被RNA稳定剂饱和的状态。将滤器在零下80摄氏度条件下保存至少两小时，直至有时间完成RA的分离。一旦真空采血管被送回生物安全二级（BSL-2）生物安全柜，取下塞子，使用血清学移液管吸取顶部血浆层1.5毫升，注意不要接近单个核细胞层。

将两个真空采血管中的血浆转移至一个5毫升冻存管中，然后记录采集的体积。使用血清移液管将剩余的血浆和单个核细胞层转移至一个15毫升锥形管中。

然后加入足量预先配制的1×PBS，使锥形管中的总体积达到15毫升。盖紧管盖并倒置混匀5次。随后在22摄氏度下，以300 ×g离心15分钟，离心时关闭刹车和加速功能。

返回生物安全柜中装有真空容器的瓶，收集红细胞（RBCs）。使用一支5又3/4英寸的巴斯德吸管轻轻搅动，使瓶内凝胶层外周松动，然后将其移除。用移液管吸取红细胞，并转移至一个5毫升的冻存管中。

然后记录体积。接着将血浆和红细胞冻存管转移至程序降温盒中，并在 -80 °C 条件下保存至少 24 小时。24 小时后，将样品转移至冻存盒中，并重新放回 -80 °C 环境进行长期保存。

离心完成后，将锥形管放回生物安全柜中，吸去上清液，保留500微升PBS，注意不要扰动沉淀。加入1倍体积的XPBS，使总体积达到10毫升，并重悬沉淀。轻轻盖紧管盖，倒置混匀5次。

然后在离心机的刹车和加速度关闭的条件下，以300 ×g、22摄氏度离心10分钟。离心后，将真空采血管中的上层血清部分分装至2毫升冻存管中，并记录体积。使用4个冻存管，每管分装200 µL。

将1000微升移入第二个冻存管中。然后将剩余体积分装至第三和第四个冻存管中。将冻存管转移至冻存盒，并于-80°C保存以长期储存。

记录冻存起始时间。继续进行PBMC分离。离心后将样本放回生物安全柜，尽可能吸除上清液，注意不要扰动沉淀。

将沉淀重悬于2.5毫升PBMC培养基一中。加入2.5毫升含有DMSO和RPMI的PBMC冻存培养基二。

将培养基加入先前制备的细胞悬液中，轻轻涡旋混匀。然后取10微升细胞悬液分装至微量离心管中。向该微量离心管中加入10微升0.4%台盼蓝染液，通过反复吹打数次充分混匀溶液。

接下来，取10 µL混合液加入细胞计数板中。混匀后三分钟内将盖玻片放入细胞计数仪。放大并聚焦于细胞。

然后选择进行细胞计数，以获得A-P-B-M-C计数。如果活细胞数超过每毫升300万个细胞，则将样本分装至最多五个冻存管中，每毫升细胞浓度至少为300万个细胞。在样本记录表中记录每支冻存管的细胞数量。

如果每毫升有核细胞数低于300万个，请参见配套文字方案了解后续操作步骤。最后，将冻存管转移至程序降温盒中，并置于零下80摄氏度环境中至少24小时。24小时后，将冻存管转移至冻存盒中，并将冻存盒置于液氮罐的气相中进行长期保存。

在样本记录表上记录冰柜的启动时间。白细胞RNA提取和滤膜处理方法经毛细管电泳后得到此凝胶图像。结果显示两条清晰条带，分别代表18S和28S核糖体RNA，降解程度极低。

在进行该操作时，重要的是要牢记准确记录至关重要。我们建议在开始时建立一个数据库，用于存储所有冻存管的信息，包括体积、浓度、质量、条形码和储存位置。有关样本管理的更多建议可在文字版实验方案中找到。