Name: 快速分馏和全血的成分的分离样品中从社区为基础的设置获得 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 31 s
Description: 学习全血样本快速分馏技术，通过离心和过滤同时分离DNA、RNA、血浆及外周血单个核细胞。该方法适用于非临床环境，可在两小时内获得高质量组分用于下游分析。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

我们衷心感谢Henriette Mair-Meijers在细节处理上的宝贵投入以及在血液样本处理工作中所花费的大量时间。我们感谢Natalie Jameson Kiesling在平面设计方面的专业支持。同时，我们感谢文中提及的制造商（Qiagen（美国加利福尼亚州瓦伦西亚）、BD Biosciences（美国加利福尼亚州圣何塞）、Life Technologies（美国纽约州格兰岛））批准我们发表其产品的使用情况。本研究工作得到了美国国立卫生研究院基金项目（资助号：DA022720、RC1MH088283 和 DA022720-05-S1）的慷慨资助。

<ol><li>Hernandez, M. E., Martinez-Fong, D., Perez-Tapia, M., Estrada-Garcia, I., Estrada-Parra, S., Pavon, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+effect+of+selective+serotonin-reuptake+inhibitors+on+lymphocyte+subsets+in+patients+with+a+major+depressive+disorder%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Neuropsychopharmacol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the effect of selective serotonin-reuptake inhibitors on lymphocyte subsets in patients with a major depressive disorder.</a> Eur Neuropsychopharmacol. 20, 88-95 (2010).</li>
<li>Weigelt, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TREM-1+and+DAP12+expression+in+monocytes+of+patients+with+severe+psychiatric+disorders+EGR3%2C+ATF3+and+PU.1+as+important+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Behav+Immun%22%5BJournal%5D)">TREM-1 and DAP12 expression in monocytes of patients with severe psychiatric disorders EGR3, ATF3 and PU.1 as important transcription factors.</a> Brain Behav Immun. 25, 1162-1169 (2011).</li>
<li>Robertson, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphocyte+subset+differences+in+patients+with+chronic+fatigue+syndrome%2C+multiple+sclerosis+and+major+depression%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Immunol%22%5BJournal%5D)">Lymphocyte subset differences in patients with chronic fatigue syndrome, multiple sclerosis and major depression.</a> Clin Exp Immunol. 141, 326-332 (2005).</li>
<li>Rotter, A., Asemann, R., Decker, A., Kornhuber, J., Biermann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orexin+expression+and+promoter-methylation+in+peripheral+blood+of+patients+suffering+from+major+depressive+disorder%5BTitle%5D)+AND+%22J+Affect+Disord%22%5BJournal%5D)">Orexin expression and promoter-methylation in peripheral blood of patients suffering from major depressive disorder.</a> J Affect Disord. 131, 186-192 (2011).</li>
<li>Klengel, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allele-specific+FKBP5+DNA+demethylation+mediates+gene-childhood+trauma+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Allele-specific FKBP5 DNA demethylation mediates gene-childhood trauma interactions.</a> Nat Neurosci. 16, 33-41 (2013).</li>
<li>Segman, R. H., Shefi, N., Goltser-Dubner, T., Friedman, N., Kaminski, N., Shalev, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+blood+mononuclear+cell+gene+expression+profiles+identify+emergent+post-traumatic+stress+disorder+among+trauma+survivors%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Peripheral blood mononuclear cell gene expression profiles identify emergent post-traumatic stress disorder among trauma survivors.</a> Mol Psychiatry. 10, 500-513 (2005).</li>
<li>Smith, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cohort+Profile%3A+Generation+Scotland%3A+Scottish+Family+Health+Study+%28GS%3ASFHS%29.+The+study%2C+its+participants+and+their+potential+for+genetic+research+on+health+and+illness%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Epidemiol%22%5BJournal%5D)">Cohort Profile: Generation Scotland: Scottish Family Health Study (GS:SFHS). The study, its participants and their potential for genetic research on health and illness.</a> Int J Epidemiol. 42, 689-700 (2013).</li>
<li>Mallone, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+preservation+of+peripheral+blood+mononuclear+cells+for+analysis+of+islet+antigen-reactive+T+cell+responses%3A+position+statement+of+the+T-Cell+Workshop+Committee+of+the+Immunology+of+Diabetes+Society%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Immunol%22%5BJournal%5D)">Isolation and preservation of peripheral blood mononuclear cells for analysis of islet antigen-reactive T cell responses: position statement of the T-Cell Workshop Committee of the Immunology of Diabetes Society.</a> Clin Exp Immunol. 163, 33-49 (2011).</li>
<li>Duvigneau, J. C., Hartl, R. T., Teinfalt, M., Gemeiner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delay+in+processing+porcine+whole+blood+affects+cytokine+expression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Delay in processing porcine whole blood affects cytokine expression.</a> J Immunol Methods. 272, 11-21 (2003).</li>
<li>Debey, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+different+isolation+techniques+prior+gene+expression+profiling+of+blood+derived+cells%3A+impact+on+physiological+responses%2C+on+overall+expression+and+the+role+of+different+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacogenomics+J%22%5BJournal%5D)">Comparison of different isolation techniques prior gene expression profiling of blood derived cells: impact on physiological responses, on overall expression and the role of different cell types.</a> Pharmacogenomics J. 4, 193-207 (2004).</li>
<li>Uddin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+and+immune+function+profiles+associated+with+posttraumatic+stress+disorder%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Epigenetic and immune function profiles associated with posttraumatic stress disorder.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 9470-9475 (2010).</li>
<li>Kessler, R. C., Wang, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+descriptive+epidemiology+of+commonly+occurring+mental+disorders+in+the+United+States%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Public+Health%22%5BJournal%5D)">The descriptive epidemiology of commonly occurring mental disorders in the United States.</a> Annu Rev Public Health. 29, 115-129 (2008).</li>
<li>Qiagen. QIAamp® DNA Mini and Blood Mini Handbook. , Valencia, California, USA. Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.qiagen.com/us/resources/resourcedetail?id=67893a91-946f-49b5-8033-394fa5d752ea">https://www.qiagen.com/us/resources/resourcedetail?id=67893a91-946f-49b5-8033-394fa5d752ea</a> (2010).</li>
<li>Thermo Scientific. NanoDrop 1000 Spectrophotometer. , Waltham, Massachusetts, USA. Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.nanodrop.com/Library/nd-1000-v3.8-users-manual-8">http://www.nanodrop.com/Library/nd-1000-v3.8-users-manual-8</a> (2010).</li>
<li>Life Technologies. LeukoLOCK™ Total RNA Isolation System. , Grand Island, New York, USA. Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.ambion.com/techlib/misc/leuko_iso.pdf">http://www.ambion.com/techlib/misc/leuko_iso.pdf</a> (2011).</li>
<li>Life Technologies. Countess™ Automated Cell Counter. , Grand Island, New York, USA. Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.lifetechnologies.com/content/dam/LifeTech/migration/files/cell-analysis/pdfs.par.5257.file.dat/mp10227-countess">http://www.lifetechnologies.com/content/dam/LifeTech/migration/files/cell-analysis/pdfs.par.5257.file.dat/mp10227-countess</a> (2009).</li>
<li>Life Technologies. Alternative Protocol for Extraction of RNA from Cells Captured on LeukoLOCK™ Filters Using TRI Reagent®. , Grand Island, New York, USA. Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.lifetechnologies.com/us/en/home/references/protocols/nucleic-acid-purification-and-analysis/rna-protocol/alternative-protocol-extraction-of-rna-from-cells-captured-on-leukolock-filters-using-tri-reagent.html">http://www.lifetechnologies.com/us/en/home/references/protocols/nucleic-acid-purification-and-analysis/rna-protocol/alternative-protocol-extraction-of-rna-from-cells-captured-on-leukolock-filters-using-tri-reagent.html</a> (2011).</li>
<li>Life Technologies. DNA-free™ Kit. , Grand Island, New York, USA. Available from:
 <a target="_blank" href="http://tools.lifetechnologies.com/content/sfs/manuals/cms_055739.pdf">http://tools.lifetechnologies.com/content/sfs/manuals/cms_055739.pdf</a> (2012).</li>
<li>Agilent Technologies. Agilent RNA 6000 Nano Kit Guide. , Santa Clara, California, USA. Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.genomics.agilent.com/files/Manual/G2938-90034_KitRNA6000Nano_ebook.pdf">http://www.genomics.agilent.com/files/Manual/G2938-90034_KitRNA6000Nano_ebook.pdf</a> (2006).</li>
<li>Koenen, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SLC6A4+methylation+modifies+the+effect+of+the+number+of+traumatic+events+on+risk+for+posttraumatic+stress+disorder%5BTitle%5D)+AND+%22Depress+Anxiety%22%5BJournal%5D)">SLC6A4 methylation modifies the effect of the number of traumatic events on risk for posttraumatic stress disorder.</a> Depress Anxiety. 28, 639-647 (2011).</li>
<li>Walsh, K., Uddin, M., Soliven, R., Wildman, D. E., Bradley, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Associations+between+the+SS+variant+of+5-HTTLPR+and+PTSD+among+adults+with+histories+of+childhood+emotional+abuse%3A+Results+from+two+African+American+independent+samples%5BTitle%5D)+AND+%22J+Affect+Disord%22%5BJournal%5D)">Associations between the SS variant of 5-HTTLPR and PTSD among adults with histories of childhood emotional abuse: Results from two African American independent samples.</a> J Affect Disord. 161, 91-96 (2014).</li>
<li>Bustamante, A. C., et al. Childhood maltreatment is associated with epigenetic differences in hypothalamic-pituitary-adrenal (HPA) axis genes in the Detroit Neighborhood Health Study. American Association of Physical Anthropologists 82nd Annual Meeting, Knoxville, TN, , Comprehensive Psychiatry. (2013).</li>
<li>Sipahi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Longitudinal+epigenetic+variation+of+DNA+methyltransferase+genes+is+associated+with+vulnerability+to+post-traumatic+stress+disorder%5BTitle%5D)+AND+%22Psychol+Med%22%5BJournal%5D)">Longitudinal epigenetic variation of DNA methyltransferase genes is associated with vulnerability to post-traumatic stress disorder.</a> Psychol Med. 44, 3165-3179 (2014).</li>
<li>Uddin, M., Koenen, K. C., Aiello, A. E., Wildman, D., de los Santos, R., Galea, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+and+inflammatory+marker+profiles+associated+with+depression+in+a+community-based+epidemiologic+sample%5BTitle%5D)+AND+%22Psychol+Med%22%5BJournal%5D)">Epigenetic and inflammatory marker profiles associated with depression in a community-based epidemiologic sample.</a> Psychol Med. 41, 997-1007 (2011).</li>
<li>Uddin, M., et al. Post-traumatic stress disorder is associated with immunosenescent T cell phenotypes in the Detroit Neighborhood Health Study. 3rd North American Congress of Epidemiology, Montreal, QC, , (2011).</li>
<li>Uddin, M., et al. Post-traumatic stress disorder is associated with immunosenescent T cell phenotypes in the Detroit Neighborhood Health Study. 101st Annual Conference of the American Psychopathological Association, New York, NY, , (2011).</li>
<li>Uddin, M. Biological signatures of post-traumatic stress disorder in the Detroit Neighborhood Health Study. 9th International Conference on Urban Health, New York Academy of Medicine, , (2010).</li>
<li>Aiello, A. E. Cytomegalovirus antibodies as a marker of immunosenescence in the Detroit Neighborhood Health Study. 9th International Conference on Urban Health, New York Academy of Medicine, , (2010).</li>
<li>Bustamante, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBustamante%2C+AC+%22Distinct+gene+expression+profiles+characterize+lifetime+PTSD+and+childhood+maltreatment+in+the+Detroit+Neighborhood+Health+Study%22">Distinct gene expression profiles characterize lifetime PTSD and childhood maltreatment in the Detroit Neighborhood Health Study</a>. , International Society for Traumatic Stress Studies. Philadelphia, PA. (2013).</li>
</ol>

作者声明不存在任何竞争利益。

我们已描述了一种简化的实验流程，该流程已成功应用于底特律社区健康研究（Detroit Neighborhood Health Study）中超过1600份全血样本的处理。尽管其中许多技术在现有文献中已有报道，但我们提供的逐步整合方案，包括各步骤之间精确的时间控制，体现了一种经过优化且高效的流程，能够成功制备多种可用于下游分析的生物样本，包括DNA甲基化、mRNA表达及免疫学分析等。这些样本已在多种实验中得到验证，相关结果已发表于同行评审期刊或在全国性学术会议上报告11,20,21,23,24,29。因此，本方案对于其他计划在类似底特律社区健康研究（DNHS）的人群研究中收集生物样本的研究人员具有参考价值。
以高通量方式处理样本时，确保所有阶段记录的准确性至关重要。我们建议在项目初期即建立一个数据库，用于存储所有冻存管的全部信息。该数据库应包含每个冻存管内样本的各项参数，如体积、浓度、质量、条形码以及储存位置（储存盒编号及管子在盒内的具体位置）。我们建议预先标记带有条形码的冻存管和储存盒。此外，我们发现准备一份“主”文档非常方便，其中按每位参与者分别列出各冻存管...

多项研究已描述了患有与未患有精神（或其他）疾病个体之间在基因表达、DNA甲基化及血液细胞亚群方面的差异1-4。然而，这些研究大多来自临床环境，其中疾病相关差异可能因前来就医的患者病情通常更为严重而被放大。随着“组学”技术的发展，过去十年中，人们越来越关注从社区和/或流行病学环境中采集生物样本5-7，以提供基于人群的疾病患病率估计，并更全面地揭示这些精神和/或躯体疾病的环境决定因素。
在此方面，一个关键挑战是需要快速处理采集的样本。单个核细胞作为常用于评估个体健康状况的关键免疫系统组分，其降解在采血后立即开始，采集后2小时即出现显著的回收率下降8-10。为应对这一挑战，我们提出了一种优化的实验方案，可同时从居住于大型都市地区受试者家中采集的人类全血样本中分离出多种血液组分。该方案基于对现有技术的整合与改进，包括保存所有“额外”组分，以便未来若出现新技术时可进一步分离或分析。尽管可采用其他替代方法或试剂盒替代本文所述的个别方法，但本文所列方法已被证实为一种可靠且高效的高通量样本处理手段。在采血后2小时内即可获得高质量的新鲜血液组分（PBMCs、DNA、血清和RNA），所有可用于检测的样本均可在2天内准备就绪（图1）。
本方案旨在高效处理采集自底特律市社区成年居民的样本，用于底特律社区健康研究（Detroit Neighborhood Health Study, DNHS；资助号：DA022720、RC1MH088283、DA022720-05-S1）中的检测。DNHS 是一项基于人群的研究，旨在探讨创伤后应激障碍（PTSD）及其他精神疾病的社会与生物学决定因素。底特律市 PTSD 的患病率超过全国平均水平的两倍11,12识别该人群中 PTSD 的生物学决定因素，可能有助于开发适当的药物和/或认知行为干预措施，以帮助该城市人群及其他高风险人群中患有此障碍的个体。例如， 退伍军人）。我们实验室此前位于密歇根州底特律的韦恩州立大学，因具备处理多种来源新鲜组织样本的专业能力、样本采集后2小时内必须开始处理的要求，以及靠近样本采集点的地理优势，被选中承担样本处理工作。借此独特机会，我们的目标是优化处理流程，以从每份样本中最大限度地获取DNA、RNA、血清和外周血单个核细胞（PBMCs）（共计5轮样本采集，N=1,639份样本）。此处所述操作步骤可在非临床环境中同步实施，从而制备出起始材料（参见 表1 用于多种下游应用，包括微阵列、表观遗传学、实时RT-PCR和流式细胞术分析（以获得平均得率）。
<img alt="采血与样本处理流程图；从静脉采血到DNA/RNA提取；时间线步骤。" src="/files/ftp_upload/52227/52227fig1highres.jpg" width="700" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 
图1. 整体工作流程。 此处所示的整体流程包括从确定同意参与的受试者到实际采血等血液样本获取的各个环节。在采血后2小时内即可从新鲜全血中分离出高质量的多种组分（外周血单个核细胞；PBMCs、DNA、血清和RNA），所有可用于检测的样本均可在2天内准备就绪。此外，若样本无需立即检测，通过本方法制备的各组分适合长期保存。此处概述的整个时间线可在一天内完成（总计约5小时）。然而，对于仅有一名具备丰富技术经验的技术人员而言，这样的一天工作将极为繁重。因此，我们建议在第1天至少由两名技术人员分工操作，并在第2天完成RNA的处理。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52227/52227fig1highres.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

<table><tbody><tr><td>QIAamp DNA 血液微量提取试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>51104</td><td>第1天：DNA提取</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>Sigma</td><td>P5493-1L</td><td>第1天：PBMC分离</td></tr><tr><td>5 &amp;frac34;&amp;rdquo; 巴斯德吸管</td><td>Fisher</td><td>13-678-6A</td><td>第1天：PBMC分离</td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS），热灭活</td><td>Life Technologies</td><td>10082147</td><td>第1天：PBMC分离</td></tr><tr><td>二甲基亚砜（DMSO）</td><td>Sigma</td><td>D8418-500ml</td><td>第1天：PBMC分离</td></tr><tr><td>RPMI 1640 培养基，液体</td><td>Invitrogen</td><td>11875119</td><td>第1天：PBMC分离</td></tr><tr><td>0.4% 台盼蓝染液&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>T10282</td><td>第1天：PBMC分离</td></tr><tr><td>Countess 细胞计数板</td><td>Invitrogen</td><td>C10283</td><td>第1天：PBMC分离</td></tr><tr><td>Countess 自动细胞计数器或显微镜和血细胞计数板等细胞计数设备</td><td>Invitrogen</td><td>C10281</td><td>第1天：PBMC分离</td></tr><tr><td>白细胞富集分离 &amp;amp; 稳定化试剂盒&amp;nbsp;</td><td>Ambion</td><td>1933</td><td>第1天：白细胞RNA提取</td></tr><tr><td>25&amp;nbsp;G × 5/8 英寸针头</td><td>Becton Dickinson</td><td>305122</td><td>第1天：白细胞RNA提取</td></tr><tr><td>注射器（5&amp;nbsp;毫升</td><td>Becton Dickinson</td><td>309646</td><td>第1天和第2天：白细胞RNA提取</td></tr><tr><td>变性裂解液&amp;nbsp;</td><td>Ambion</td><td>8540G</td><td>第2天：白细胞RNA提取</td></tr><tr><td>5&amp;nbsp;M NaCl</td><td>Life Technologies</td><td>24740011</td><td>第2天：白细胞RNA提取</td></tr><tr><td>TRI Reagent</td><td>Ambion</td><td>9738</td><td>第2天：白细胞RNA提取</td></tr><tr><td>溴氯丙烷（BCP）</td><td>Sigma</td><td>B-9673</td><td>第2天：白细胞RNA提取</td></tr><tr><td>离心柱&amp;nbsp;</td><td>Ambion</td><td>10051G</td><td>第2天：白细胞RNA提取</td></tr><tr><td>0.1&amp;nbsp;mM EDTA</td><td>Ambion</td><td>9912</td><td>第2天：白细胞RNA提取</td></tr><tr><td>无DNA试剂盒</td><td>Ambion</td><td>AM1960</td><td>第2天：DNase 处理</td></tr><tr><td>RNA 6000 Ladder&amp;nbsp;</td><td>安捷伦</td><td>5067-1529</td><td>第2天：Bioanalyzer分析</td></tr><tr><td>RNA 6000 Nano Series II 试剂盒&amp;nbsp;</td><td>安捷伦</td><td>5067-1511</td><td>第2天：Bioanalyzer分析</td></tr><tr><td>RNaseZAP</td><td>Ambion</td><td>AM8782</td><td>第2天：Bioanalyzer分析</td></tr><tr><td>乙醇 &gt;99%</td><td>Sigma</td><td>E7023-500ml</td><td></td></tr><tr><td>异丙醇 &gt;99%&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>I9516-500ml</td><td></td></tr><tr><td>无核酸酶超纯水&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>9938</td><td></td></tr><tr><td>去核酸酶枪头（nuclease-free）</td><td>Eppendorf</td><td>22491253</td><td></td></tr><tr><td>移液器（血清学）</td><td>Eppendorf</td><td>2223020-4</td><td></td></tr><tr><td>移液器（用于1以下体积）&amp;nbsp;毫升</td><td>Eppendorf</td><td>3120000-054</td><td></td></tr><tr><td>移液管（血清学）</td><td>Fisher</td><td>13-678-27E</td><td></td></tr><tr><td>程序降温冻存容器</td><td>Nalgene</td><td>5100-0001</td><td></td></tr><tr><td>冻存管盒（用于放置 2&amp;nbsp;毫升和5&amp;nbsp;毫升冻存管和1.5&amp;nbsp;毫升微量离心管</td><td>Fisher</td><td>03-395-464</td><td></td></tr><tr><td>试管架</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>14-804-134</td><td></td></tr><tr><td>15&amp;nbsp;毫升聚丙烯管</td><td>Fisher</td><td>14-959-49D</td><td></td></tr><tr><td>1.5&amp;nbsp;毫升和0.65微离心管</td><td>Fisher</td><td>07-200-534 和 07-200-185</td><td></td></tr><tr><td>2&amp;nbsp;毫升和5&amp;nbsp;毫升冻存管</td><td>Fisher</td><td>10-500-26 和 10-269-88F&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>8&amp;nbsp;ml CPT 真空采血管</td><td>BD Biosciences</td><td>362761</td><td>2 支试管</td></tr><tr><td>6&amp;nbsp;毫升 K&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; EDTA 真空采血管</td><td>BD生物科学</td><td>367863</td><td>2 支试管</td></tr><tr><td>8.5&amp;nbsp;ml SST 真空采血管</td><td>BD 生物科学</td><td>367988</td><td>1 支离心管</td></tr><tr><td>涡旋振荡器</td><td>Fisher</td><td>2215365</td><td></td></tr><tr><td>用于微量离心管的干浴恒温孵育器及加热模块</td><td>Fisher</td><td>11-715-1250</td><td></td></tr><tr><td>用于细胞培养操作台内的过滤/真空系统</td><td>Fisher</td><td>01-257-87</td><td></td></tr><tr><td>用于微量离心管的固定角转子，带气密盖</td><td>Eppendorf</td><td>22637002</td><td></td></tr><tr><td>带摆动桶式转子和气密性盖子的冷冻离心机，适用于16 x 125&amp;nbsp;mm 真空采血管和 15&amp;nbsp;毫升聚丙烯管</td><td>Eppendorf</td><td>22628157</td><td>2，其中一个无需冷藏</td></tr><tr><td>Nanodrop 2000（推荐用于小体积样品的精确测量）或其他分光光度计设备</td><td>Fisher</td><td>13-400-411</td><td></td></tr><tr><td>安捷伦生物分析仪</td><td>安捷伦科技</td><td>G2940CA</td><td></td></tr><tr><td>液氮罐</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>11-676-56</td><td></td></tr><tr><td>锐器盒</td><td>Fisher</td><td>22-037-970</td><td></td></tr><tr><td>生物废弃物容器</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>1223P52</td><td></td></tr><tr><td>生物安全等级2&amp;nbsp; 经认证的细胞培养罩</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>13-261-315</td><td></td></tr></tbody></table>

基于社区环境采集样本的全血成分快速分离与提取

Rapid Fractionation and Isolation of Whole Blood Components in Samples Obtained from a Community-based Setting

在非临床环境中采集和处理全血样本，为评估社区居住人群中患有和不患有既往疾病个体提供了独特的机会。快速处理这些样本对于避免关键细胞成分的降解至关重要。本文提供了从大都市地区志愿者家中单次采血后，同时分离外周血单个核细胞（PBMC）、DNA、RNA 和血清的方法，且在采血后 2 小时内即开始处理。我们已使用这些技术处理了超过 1,600 份血液样本，获得了稳定且高质量的材料，并成功应用于 DNA 甲基化、基因分型、基因表达和流式细胞术分析。其中部分方法为标准操作；然而，当以所述方式组合使用时，能够高效处理通常不会在临床环境中接受评估的人群（基于人群或社区的研究参与者）的样本。因此，该方案有望获得更能代表总体人群的样本（以及后续数据）。

整个实验流程必须能够产出高质量的材料，以用于多种下游应用，包括通过微阵列和RT-PCR分析进行基因表达检测、表观遗传修饰的检测以及细胞亚群差异分析。表1列出了各实验步骤所得材料的平均产量和质量。图3展示了白细胞RNA分离及滤膜处理方法所得产物质量的一个示例。图3左上方为毛细管电泳所得凝胶图像，每条泳道应出现两条清晰的条带，且拖尾现象最小，若出现明显拖尾则提示存在降解。凝胶下方的色谱图可进一步显示降解的程度和类型，这些信息可通过峰的位置和大小进行判断。RNA完整性数（RIN）是另一种质量评估指标，其数值范围为1（低质量，严重降解）至10（高质量，纯度高，RNA完整）。
这种高通量方法偶尔可能出现误差，但在处理的各个阶段均设有多个质控检查点以确保质量控制。图2展示了含有Ficoll的真空采血管经离心后应有的分层情况。真空采血管未能显示该分层现象的原因可能有多种，包括离心速度错误、采集血量过少，或受试者未按要求空腹（见表2</strong...

我们概述了一种用于处理全血以获取多种组分以供进一步分析的方法。我们优化了一个简化的操作流程，可在非临床环境下快速、高通量地同时处理多个全血样本。

在非临床环境中采集和处理全血样本为评估社区居住个体提供了独特的机会，既可……

本实验方案的总体目标是提供一个简化的流程，以实现快速、高效的眼科样本通量处理，并同时处理全血样本。在非临床环境下，采用重叠方式进行真空采血管样本处理，以便高效地分离出高质量的DNA、RNA、外周血单个核细胞（PBMC）、血清以及血浆和红细胞的残留组分。处理流程首先对血清真空采血管进行离心，然后从一个含有真空采血管的试管中取出部分样本用于DNA提取，接着对试管进行离心处理。随后，在完成DNA提取后，可从K2 EDTA真空采血管中进行白细胞来源的RNA提取。将每支真空采血管中的血液分别通过滤器过滤，并用PBS洗涤，然后加入RNA稳定剂，再返回含有真空采血管的试管中。吸除残留血浆后，用PBS洗涤单个核细胞层。在离心过程中，收集残留的红细胞，并对分离出的血清进行分装。最后，将PBMC保存在细胞冻存液中。最终，可在采集后两小时内获得高质量的新鲜血液组分，所有可用于检测的样本均可在两天内准备就绪。与现有方法相比，该技术的主要优势在于其操作可在非临床环境中同时进行，从而在两天内即可获得起始材料，用于多种下游应用，包括微阵列、表观遗传学实时逆转录聚合酶链式反应（R-T-P-C-R）以及流式细胞术分析。本次实验操作将由我的实验室主管 Amy Weckl 进行演示。开始全血样本处理时，请确保缓冲液、离心机和加热块均已准备就绪。在样本追踪单上记录真空采血管的送达时间。收到样本后，在标本记录单上记录血清分离开始时间，并立即开始处理：将7 mL血清真空采血管在关闭刹车和加速度的条件下进行离心。在 BSL 二级细胞培养操作台中记录 DNA 提取的开始时间。使用带气溶胶盖的水平转子，在 4°C 条件下以 1300 ×g 离心 20 分钟，对血清真空采血管进行离心。将含有分离胶的真空采血管轻轻倒置 5 次，然后从其中一根采血管的上层取 200 微升全血，分别加入到两管各含 20 微升蛋白酶的分装管中。将蛋白酶和血液微量离心管留在生物安全柜中，并继续对含有空泡容器的细胞进行离心。离心前，记录单个核细胞（PBMC）分离的开始时间，该时间必须在采血后两小时内。将已置于气溶胶密闭容器中的含真空采血管倒置8到10次。然后在22摄氏度、1600 ×g条件下，以关闭刹车和加速度的设置离心真空采血管30分钟。返回生物安全柜中的DNA提取样品，向每个含有蛋白酶和血液的微量离心管中加入200 µL Buffer AL。盖上管盖，将管子从生物安全柜中取出。随后涡旋振荡15秒。振荡后立即进行瞬时离心处理。按照随附的文字实验方案进行DNA提取，直至在Ellucian上从柱子中洗脱出DNA。每名受试者的两个柱子的DNA合并，每名受试者总产量为800微升。记录白细胞RNA提取的开始时间。用转移针刺穿K2 EDTA真空采血管的橡胶隔膜。在组装K2 EDTA试管系统后，保留护套和螺帽以备后续使用。使用金属刮勺的一端安全地卸

rapid-fractionation-isolation-whole-blood-components-samples-obtained

Research

科研

JoVE Journal

Medicine

医学

快速分馏和全血的成分的分离样品中从社区为基础的设置获得

来源：Sathish Muthu1,2,31印度哥印拜陀骨科研究组。2卡帕甘高等教育学院工程学院生物技术系。3政府医学院骨科系。本视频演示了通过检测血小板计数、采集血液并离心分离血小板，制备高质量富血小板血浆（PRP）的方法。该 PRP...

从人外周血制备富血小板血浆

本文介绍了一种从脐带血中分离前体B细胞亚群的实验方案。可从这些细胞中提取足量且高质量的核酸，并用于后续基于DNA或RNA的检测分析。...

从脐带血中分离前体B细胞亚群

血液中的白细胞和血小板可作为个体整体生物能量健康状况的标志物，因此具有监测病理过程及治疗效果的潜力。本文 介绍一种用于分离并检测这些细胞中线粒体功能和氧化爆发的方法。...

生物能量学与氧化爆发：人白细胞和血小板分离与评估的实验方案

白细胞-血小板富集纤维蛋白（L-PRF）是一种经美国食品药品监督管理局（FDA）批准的自体血小板浓缩制剂，具有独特的纤维蛋白结构、富集的血小板以及丰富的生长因子。本文介绍一种在临床椅旁制备L-PRF的实验方案，并评估其机械性能，包括单轴拉伸测试和缝线保持强度测试。...

富含白细胞和血小板的纤维蛋白的表征：一种新型生物材料

本文展示了如何通过密度梯度离心法从人抗凝全血中分离外周血单个核细胞，再利用磁珠分选技术从中分离单核细胞。经过5天的培养后，人单核细胞可分化为未成熟树突状细胞，可用于非临床实验操作。...

从全血中生成人单核细胞来源的树突状细胞

本方案详细介绍了在临床试验现场可实际应用的高质量外周血单个核细胞（PBMC）和血浆生物样本的制备方法，可用于转化生物标志物分析。...

临床试验现场单次采血制备外周血单个核细胞团块及血浆用于生物标志物分析

我们介绍一种简单的方案，用于从确诊为塞扎里综合征患者的全血中分离外周血单个核细胞，随后富集CD4+...

从Sézary综合征患者外周血中分离单个核细胞及CD4+ T细胞用于转录组分析

本方案详细描述了一种从全血、血沉棕黄层或白细胞单采膜中分离中性粒细胞的方法，可获得较高的细胞得率、高纯度以及最低程度的细胞活化。我们采用梯度纯化、红细胞（RBC）沉降和红细胞裂解法，以获取高质量/高纯度的中性粒细胞制备物。...

从全血和血沉棕黄层中分离人中性粒细胞

生物样本库是生物医学研究的重要资源，欧洲肿瘤研究所转化与数字医学部门的生物样本库是该领域的典范。本文详细描述了生物样本库在管理各类人类生物样本时的标准操作规程。...

转化医学生物样本库：最佳样本管理的标准操作规程

本方案详细介绍了用于生物样本库建设及其他用途的、与高通量自动化兼容的人类外周血单个核细胞分离方法。...

从血沉棕黄层中分离人外周血单个核细胞 通过 高通量免疫磁珠分离

学习全血样本快速分馏技术，通过离心和过滤同时分离DNA、RNA、血浆及外周血单个核细胞。该方法适用于非临床环境，可在两小时内获得高质量组分用于下游分析。

基于社区环境采集样本的全血成分快速分离与提取

探索更多视频