神经细胞类型的流式细胞仪协议的表面和细胞内抗原分析
December 18th, 2014
我们提供了神经细胞类型中表面抗原和/或细胞内抗原的流式细胞术分析方案的详细说明。解释了实验计划的关键方面、分步方法程序和流式细胞术的基本原理，以便神经生物学家能够利用这项强大的技术。
该程序的总体目标是使用流式细胞术分析神经细胞表面和细胞内抗原的表达。这是通过首先从体外培养物或原代神经组织中收获神经细胞来实现的。接下来，将可选的非特异性细胞内染色剂应用于细胞。
然后立即用一抗标记所需的表面抗原，而所需的细胞内抗原在细胞固定和渗透后标记。最终，可以通过使用流式细胞术分析表面抗原在细胞内标记定义的特定目标神经亚群上的共表达来获得结果。该协议将演示如何制备组织培养衍生的神经细胞，用于用多色流式细胞术询问表面和细胞内抗原。
首先，在室温下用 5 毫升不含镁和钙的 PBS 轻轻洗涤细胞一次，开始收获在 T 75 培养瓶中生长的贴壁神经细胞。然后加入 3 毫升胰蛋白酶替代物，将细胞从培养瓶中分离出来，并在 37 摄氏度下孵育 2 到 5 分钟。通过上下吹打细胞悬液几次来松开细胞团块后，加入 6 毫升流式缓冲液淬灭酶消化，将整个细胞悬液转移到新鲜的 15 毫升试管中以分离细胞。
将试管放入离心机中，在室温下将细胞离心 5 分钟，然后吸出 snat 以准备细胞内染料标记。用 5 毫升 PBS 加 0.1% BSA 重新悬浮细胞沉淀。否则，加入 5 mL 流式缓冲液并结合标准 trian 蓝染色方案。
使用血细胞计数器估计有效的活细胞计数。使用上一步使用的相同缓冲液，将现有悬浮液的细胞浓度重新调整为每毫升 100 万个活细胞。这些细胞现在可用于两种染色选项，表面抗原抗体染色，或可选的羧基荧光素荧光细胞内染色，然后是上述表面抗原染色。
要使用羧基荧光素 CIN 酯染料进行细胞内标记步骤，首先加入 10 μL CFSE 储备液。对于每 1 mL 细胞悬液，将试管以 200 RPM 的转速放在摇床上，并孵育混合物 5 分钟。在室温下，通过保护试管免受阳光直射来防止光漂白。
通过加入 5 体积含有流式缓冲液的血清来淬灭所有未反应的染料，然后轻轻上下移液几次以混合。然后在室温离心机中将细胞离心 5 分钟，并吸出上清液以去除残留的未反应染料。通过复苏洗涤细胞沉淀，用 5 体积的流式缓冲液悬浮。
然后将细胞在室温离心机中再次旋转 5 分钟，然后丢弃 SUP natant。最后，用流式缓冲液重新悬浮细胞沉淀，使最终细胞浓度为每毫升 100 万个活细胞。对于多重实验，将来自不同实验条件的相同数量的未染色目标细胞添加到 CFSC 染色细胞悬液中。
细胞现在已准备好使用抗体进行表面抗原标记，以开始细胞表面染色。将 100 μL 细胞悬液（带或不带 CFSC 标记）转移到新的 1.5 mL 试管中。向细胞悬液中加入 fluor 4 偶联抗体，其量为先前通过抗体滴定试验测定的量。
将试管置于室温轨道摇床上，以 100 RPM 的离心速度孵育混合物 30 分钟。在没有光线的情况下，通过添加 1 mL 流式缓冲液稀释抗体混合物。轻轻上下移液，在预冷的 4 摄氏度微量离心机中混合并离心细胞 4 分钟。
吸出螺旋体以去除未结合的抗体，然后重复洗涤离心和吸液。再迈出一步。Reus 将细胞沉淀悬浮在 100 μL 流缓冲液中，以用于先前染色的细胞。
将 500 微升固定缓冲液添加到 100 微升细胞悬液中。将试管放在室温轨道摇床上，以 100 RPM 的速度离心，并在黑暗中孵育 15 分钟。甲醛会交联所有彼此靠近的蛋白质和 DNA 物种，并产生无活力的细胞悬液。
加入 1 毫升 PBS 稀释固定混合物，然后轻轻上下移液几次以混合。然后在预冷的 4 摄氏度离心机中离心固定的细胞 3 分钟。吸出旋后液，使 100 μL 液体留在细胞沉淀上方，以渗透细胞膜，以便随后进行细胞内抗原标记。
向 100 μL 细胞悬液中加入 500 μL 渗透缓冲液。将试管放在室温轨道摇床上，以 100 RPM 的速度离心，并在黑暗中孵育 15 分钟。加入 1 毫升 PBS 稀释渗透混合物，轻轻上下移液几次，使固定细胞在预冷的 4 摄氏度离心机中混合并旋转 3 分钟。
孵育前完全吸出 SUP natant。通过在 PBS 加 0.5%tween 20 缓冲液中稀释抗体来制备一抗工作储备液。它进一步富含 1% BSA、10% 驴血清或 10% 山羊血清。
然后用 100 μL 一抗工作储备液重悬膜渗透性细胞沉淀。将试管放在室温轨道摇床上，以 200 RPM 的转速在黑暗中孵育 30 分钟。通过添加 1 mL 流式缓冲液稀释一抗混合物。
轻轻上下移液几次，在预冷的 4 摄氏度离心机中混合并旋转细胞 4 分钟。完全吸出旋后物以去除未结合的抗体。接下来，用 100 μL 二抗工作储备液重悬沉淀。
重复避光室温孵育 30 分钟。在同一摇床中，加入 1 mL 流式缓冲液稀释二抗混合物。重复相同的试管倒置混合、离心和去除上清液，以去除所有未结合的抗体。
重复相同的 1 mL 洗涤离心和去除上清液步骤，再重复两次，但使用新鲜 PBS 作为洗涤缓冲液。相反，最终结果将是用 CFSC 细胞外或细胞内靶向荧光抗体或三种重悬的任意组合标记的干净细胞沉淀，标记的细胞沉淀在 150 μL 流式缓冲液中。将细胞悬液转移到流式细胞仪中，并为每层四层楼使用适当的激光激发和发射滤光片设置开始分析。
使用前向和侧向散射数据作为指导，在流式细胞术分析软件中设置初始前向与侧向散射，以排除非特异性数据点，例如细胞碎片和死细胞。接下来，使用来自未染色细胞悬液的原始数据作为阴性对照，设置多个荧光整合门，从细胞外和细胞内抗原标记中选择正发射信号，以解释来自多色的背景荧光。光谱重叠效应使用来自单抗体染色对照的原始数据重新调整荧光门。
在多重传真实验中，羧基荧光素标签可用作基线信号，无需使用抗体即可区分来自两个不同谱系或实验条件的细胞。例如，在异质细胞悬液中，只需查看绿色通道中是否存在荧光，就可以立即区分用 CFSC 标记的神经细胞和未标记的成纤维细胞。此外，结合 CFSE Esther 标记，可以使用不同颜色的荧光抗体来确定混合样品中 CFSE 标记和未标记亚群之间表面抗原的差异表达。
例如，在绿色荧光通道中用 CFSE 标记的 SHSY 5 Y 神经母细胞瘤细胞共表达高水平的 CD 24 表面抗原，但不共表达成纤维细胞标志物 CD 54。相比之下，CFSC 阴性 BJ 成纤维细胞对 CD 54 呈阳性，CD 24 水平较低。神经表面抗原的分析也可以与基于抗体的细胞内抗原检测一起进行。
包含表面抗原和细胞内抗原的未染色样品和单染色对照对于替代基于一抗和二抗的细胞内抗原标记（如此处所示的神经标志物图谱 2）至关重要。一抗的非共价荧光标记可以在共表达分析中产生相当的结果，并缩短实验步骤。观看本视频后，您应该对如何使用各种替代标记方法及其组合制备用于基本流式细胞术分析的神经细胞有很好的了解。
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概览
本文详细介绍了一种使用流式细胞术分析神经细胞表面和细胞内抗原的协议。它涵盖了关键的实验规划和方法步骤，以帮助神经生物学家有效地利用这项技术。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 细胞生物学
- 流式细胞术
背景
- 流式细胞术是分析细胞群体的强大工具。
- 了解抗原表达对研究神经细胞功能至关重要。
- 本协议适用于体外培养和原代神经组织。
- 它能够识别特定的神经亚群体。
研究目的
- 分析神经细胞上的表面和细胞内抗原。
- 展示多色流式细胞术的使用。
- 为神经生物学家提供逐步指南。
所用方法
- 从培养物或原代组织中收集神经细胞。
- 应用可选的非特异性细胞内染色。
- 用一抗标记表面抗原。
- 固定和渗透后标记细胞内抗原。
主要结果
- 成功标记表面和细胞内抗原。
- 能够分析特定神经亚群体中的共同表达。
- 展示多色流式细胞术技术。
- 协议适用于各种神经细胞类型。
结论
- 本协议增强了对神经细胞生物学的理解。
- 流式细胞术是分析抗原的有效方法。
- 它提供了神经细胞功能状态的洞察。
常见问题
Executive Industry Relevance
Flow cytometry enables precise characterization of neural cell subpopulations through surface and intracellular antigen profiling, supporting target validation in neuroscience drug discovery. This methodology provides quantitative, multiparametric data that enhances predictive confidence in early-stage target de-risking by linking phenotypic markers to functional states. It addresses a key discovery inflection point where mechanistic ambiguity in neural target engagement must be resolved before portfolio advancement.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by defining neural subpopulations via CD surface antigens (e.g., CD24, CD54) and intracellular markers.
- Operational Value: Supports biological de-risking through co-expression analysis of surface and intracellular antigens to clarify target specificity.
- Predictive Value: Facilitates predictive confidence in target selection by quantifying antigen expression levels across experimental conditions using CFSE labeling for lineage discrimination.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated neural cell systems for downstream workflows via standardized harvesting, staining, and fixation-permeabilization steps.
- Quantitative Outputs: Generates reproducible fluorescence intensity measurements enabling compound screening against antigen expression profiles.
- Platform Reuse: Establishes a scalable, multicolor flow cytometry platform compatible with antibody panels and fluorescent dyes for repeated use across neural models.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery-phase antigen profiling to preclinical validation by enabling consistent neural subpopulation identification across in vitro and primary tissue models.
- Biomarker Alignment: Supports translational biomarker development through detection of intracellular antigens (e.g., MAP2) alongside surface markers to define disease-relevant neural states.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs go/no-go decisions by providing quantitative antigen expression data that correlates with functional neural phenotypes.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target hypothesis testing through lead identification, providing antigen expression data that informs early compound screening and mechanistic follow-up.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling detection of surface antigen co-expression patterns defined by intracellular labels in neural subpopulations.
- Screening: Delivers assay readiness and quantitative fluorescence readouts that allow reliable comparison of compound effects on antigen expression levels.
- Analytics: Provides statistical outputs including gating strategies, compensation controls, and replication-ready data for cross-functional team alignment.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity through standardized neural cell preparation applicable to both culture and primary tissue models.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable capability for immunophenotyping neural cells across projects, reducing redundant protocol development.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity through multiparametric antigen profiling.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility via detailed protocols for harvesting, staining, fixation, and permeation steps.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality by supplying quantitative antigen expression data that de-risks target selection.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of neural targets based on antigen expression profiles linked to functional subpopulations.
Implementation Considerations
- Requires expertise in flow cytometry panel design, compensation, and gating strategy development for multicolor neural antigen analysis.
- Dependent on access to flow cytometers with appropriate laser excitation and emission filters for fluorophores such as CFSE and antibody conjugates.
- Necessitates cross-team standardization of staining protocols, antibody titration, and control usage (unstained, single-stained, fluorescence-minus-one) to ensure data comparability.
- Involves adaptation considerations when transferring protocols between neural cell lines, primary tissues, or differentiation states due to variability in antigen accessibility.
- Includes practical limitations such as potential epitope masking during fixation/permeabilization and the need to optimize antibody concentrations for low-abundance neural targets.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:03
Neural Cell Harvesting
3:10
Antibody-independent Intracellular Labeling with Carboxyfluorescein Succinimidyl Ester (CFSE)
4:49
Cell-surface Antigen Staining with Fluorophore-conjugated Antibodies
5:56
Fixation and Membrane Permeabilization
7:35
Intracellular Antigen Staining with Non-fluorescent Primary Antibodies
9:30
Flow Cytometry Analysis
10:37
Results: Multicolor Flow Cytometric Analysis of Surface vs. Introcellular Antigens in Neural Cells
12:36
Conclusion
