Name: 神经细胞类型的流式细胞仪协议的表面和细胞内抗原分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 5 s
Description: 学习利用流式细胞术分析神经细胞表面与胞内抗原的实验方法。本方案涵盖细胞收获、荧光标记、固定通透及多色检测步骤，适用于体外培养或原代神经组织，助力神经生物学研究者精准鉴定特定神经亚群的功能状态。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

本研究项目由德国研究基金会（DFG）的艾米·诺特计划（Emmy Noether-Program）资助，项目编号 PR1132/3-1。我们感谢弗莱堡大学穆勒-法恩贝格基金会（Müller-Fahnenberg Foundation）提供的额外支持。本研究部分得到了德国研究基金会卓越计划（卓越集群 GSC-4，施佩曼研究生院 Spemann Graduate School）的资助。

1. 神经细胞收获
<ol>
	<li>显微镜评估：
	<ol>
		<li>在开始实验之前，使用明场或相差显微镜检查培养物的状态。 
		注意：原则上，从解剖中获得的原代神经组织同样适用于流式细胞术分析14,28请注意，本方案的重点是来源于 体外 神经细胞系统</li>
	</ol>
	</li>
	<li>收集细胞7:
	<ol>
		<li>轻轻用含镁离子的缓冲液洗涤贴壁细胞培养皿/瓶2+/ Ca2+ 室温下无游离磷酸盐缓冲液（PBS）（例如，T75培养瓶加5 ml，6孔板每孔加3 ml，或10 cm培养皿加10 ml。 
		注意：本实验方案中使用的 PBS 均不含 Mg2+/ 钙2+ 自由的
		<ol>
			<li>以视频示例为例，使用一个汇合度为80%的T75培养瓶培养的SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞。若培养皿中存在较多碎片，请增加额外的洗涤步骤。</li>
			<li>考虑使用含血清白蛋白的 PBS 进行洗涤48，Percoll，或Ficoll49 离心梯度和/或市售微珠50,51去除髓鞘及其他脂质或污染物至关重要，尤其是在使用成年个体的原代组织来源时。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>加入预热的（37 °C用适量的胰蛋白酶替代液覆盖组织培养容器的整个表面。 
		注意：也可考虑使用Accutase或其他酶消化方法。此关键步骤可能对表面表位表达产生不利影响（参见 7).</li>
		<li>将培养皿/培养瓶置于培养箱中孵育 37 °C 孵育2-5分钟（根据细胞类型而定），以使细胞脱落。轻轻敲击培养容器或用血清学移液管冲洗，以促进细胞脱落。避免消化过度（以免导致细胞丢失及后续步骤中出现凝集）。</li>
		<li>通过加入两倍体积的流式缓冲液（PBS 中含 2% FBS）终止胰蛋白酶消化，并将细胞收集至 15 ml 锥形管中。</li>
		<li>使用微量移液器（100 - 1,000 µl）或使用5 ml血清移液管制备单细胞悬液。</li>
		<li>以 220 × g 离心 5 分钟，温度设为 25 °C小心吸除上清液，保留沉淀。</li>
		<li>将沉淀重悬于适量的流式缓冲液中，缓冲液体积取决于沉淀的大小（例如， 一个汇合度达到100%的T75培养瓶中，SH-SY5Y细胞的典型产量至少为10 × 10⁶6 细胞，此时需将细胞重悬于5 ml流式缓冲液中）。 
		注意：如果观察到较大碎片或凝块，需通过30 - 100 µm 网孔</li>
	</ol>
	</li>
	<li>细胞计数52:
	<ol>
		<li>将少量细胞悬液转移至微量离心管中，用台盼蓝或其它替代性活率染料按预定比例稀释一定体积后，再转移至血细胞计数板或自动细胞计数系统中进行计数。</li>
		<li>将细胞悬液稀释至浓度为 1 x 106 通过加入适量的流式缓冲液或含0.1% BSA的PBS（如进行CFSE标记）来调整每毫升中的活细胞数量。 
		注意：碘化丙啶、7-氨基放线菌素D、annexin V以及市售的可固定活力检测试剂盒均可作为评估细胞活力的替代方案。此外，也可采用如前所述的以caspase-3荧光为指标的细胞凋亡检测方法。53 可使用这些试剂。由于这些试剂会占据荧光通道，若在所有样本中加入，可能会限制后续步骤的选择。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 使用CFSE进行细胞内染料标记（图3）
<ol>
	<li>将CFSE稀释至适合使用的所需储存浓度。 
	注意：本实验中使用的储存浓度为0.01 mM。CFSE的最佳工作浓度需通过实验确定。</li>
	<li>每毫升细胞悬液（第1.3.2节，浓度为1 × 106 个细胞/ml，溶于PBS + 0.1% BSA）中加入10 µl的0.01 mM CFSE溶液，使终浓度为0.1 µM。短暂涡旋混匀。 
	注意：此处使用的CFSE浓度约为增殖实验中常用浓度的十分之一，因此染料的细胞毒性极低。我们未观察到对细胞活力的不良影响。</li>
	<li>在室温下避光孵育5分钟，并持续振荡（200 rpm）。</li>
	<li>向管中加入5倍体积的流式缓冲液以淬灭染料。在室温下以94 × g离心5分钟。</li>
	<li>弃去上清液，保留沉淀。用5倍体积的流式缓冲液重悬细胞。</li>
	<li>在室温下以94 × g离心5分钟。弃去上清液，并将细胞重悬于流式缓冲液中，调整浓度至1 × 106 个细胞/ml。</li>
	<li>向染色后的细胞悬液中加入等数量的未染色目标细胞。继续进行表面抗原染色实验（第3节）。</li>
</ol>
<img alt="显示CFSE染色的SH-SY5Y和BJ细胞相互作用以及CD24-APC和CD54-PE的流式细胞术图谱。" src="/files/ftp_upload/52241/52241fig3highres.jpg" width="700" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图3"> 
图3. 通过CFSE染料标记检测两种细胞系之间CD表面抗原表达的差异。 SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞预先用CFSE标记，以便后续与未标记的BJ成纤维细胞进行区分。混合样品（右侧面板）用表面标志物CD24或CD54（均偶联APC）共染色，结果显示由于CFSE染色的存在，两种细胞系易于区分（箭头 = SH-SY5Y；箭头末端 = BJ成纤维细胞）。大多数SH-SY5Y细胞表达CD24但不表达CD54（ICAM-1）；相反，BJ成纤维细胞（CFSE阴性）对CD54呈阳性，而对CD24基本呈阴性。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52241/52241fig3highres.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
3. 细胞表面染色
<ol>
	<li>标记含有样本和关键对照的试管（见表1）。</li>
</ol>
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>试管编号</td>
			<td>样本名称</td>
			<td>抗原-荧光素</td>
			<td>稀释比例</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1</td>
			<td>未染色细胞</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2</td>
			<td>单染样本</td>
			<td>CD24-APC</td>
			<td>1:50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3</td>
			<td>单染样本</td>
			<td>TUJ1-Alexa fluor 488nm</td>
			<td>1:2,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4</td>
			<td>双染样本</td>
			<td>CD24-APC</td>
			<td>1:50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>TUJ1-Alexa fluor 488nm</td>
			<td>1:2,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5</td>
			<td>单染样本（仅二抗）</td>
			<td>Secondary only: Alexa fluor 488nm</td>
			<td>1:2,000</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1. 典型流式细胞术实验中应包含的试管列表。 本表格展示了一个最小样本管集合，用于本视频文章中描述的共染色实验。一个理想的实验需要包含所有必要的对照（阴性对照、阳性对照以及补偿对照），以便准确解读实验结果。
<ol start="2">
	<li>向每个1.5 ml微量离心管中加入100 µl细胞悬液（来自第2.7节或1.3.2节）。 
	注意：确保每100 µl细胞悬液中至少含有0.1 × 106个细胞。</li>
	<li>将荧光素标记的抗体以适当的稀释比例加入样本中。 
	注意：实验前应确定每种抗体的工作稀释度。神经表面抗原列表见表2。</li>
</ol>
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>抗原</td>
			<td>细胞类型</td>
			<td>参考文献</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD15</td>
			<td>神经干细胞 </td>
			<td>[28, 67]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD24</td>
			<td>神经元细胞</td>
			<td>[28, 68]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD29</td>
			<td>神经干细胞</td>
			<td>[28, 69, 70]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD44</td>
			<td>胶质细胞</td>
			<td>[25]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD49f</td>
			<td>神经干细胞 </td>
			<td>[38]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD56 (NCAM)</td>
			<td>神经元细胞</td>
			<td>[71]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD133</td>
			<td>神经干细胞 </td>
			<td>[27]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD184</td>
			<td>神经干细胞和胶质细胞</td>
			<td>[25]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD200</td>
			<td>神经元细胞</td>
			<td>[38]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD271</td>
			<td>神经嵴干细胞</td>
			<td>[25]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A2B5</td>
			<td>胶质细胞</td>
			<td>[31]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CORIN</td>
			<td>多巴胺能前体细胞</td>
			<td>[35, 36]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FORSE1</td>
			<td>神经干细胞 (NSC)</td>
			<td>[72 ]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GLAST</td>
			<td>胶质细胞</td>
			<td>[33]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NG2</td>
			<td>胶质细胞</td>
			<td>[32]</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表2. 神经细胞表面抗原的选择。 本表列出了在多种神经细胞类型中发现表达的细胞表面表位，用以说明目前用于表征神经谱系的细胞表面抗原种类日益丰富。需注意的是，此列表远未穷尽所有抗原，且其中大多数标记物也在其他多种神经及非神经细胞中表达。因此，需要联合使用多种标记物才能更准确地定义和分离特定的神经细胞亚群。
<ol start="4">
	<li>在避光条件下，于旋转摇床（200 rpm）上孵育 30 分钟。</li>
	<li>流式缓冲液洗涤
	<ol>
		<li>向各管中加入 1 ml 流式缓冲液，在 4 °C 下以 380 × g 离心 4 分钟。</li>
		<li>弃去上清液，保留沉淀。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>重复洗涤步骤一次。</li>
	<li>第二次洗涤后，倾去上清液，并将细胞重悬于流式缓冲液中，终体积为 100 µl。</li>
	<li>用于流式细胞术分析。或者，继续进行第 4 节和第 5 节操作。 
	注意：如果细胞需在流式细胞分选后（i.e., 未经固定或透化处理的活细胞悬液）重新培养，请在收获、染色及分析过程中采用无菌操作技术。</li>
</ol>
4. 固定与通透处理38
<ol>
	<li>使用多聚甲醛（PFA）进行固定：
	<ol>
		<li>配制含有2% PFA的PBS固定缓冲液。 
		注意：PFA对人体和环境有害。请使用适当的个人防护装备，并根据当地法规处理废弃物。</li>
		<li>向100 µl细胞悬液中加入500 µl固定缓冲液。</li>
		<li>将离心管置于摇床（100 rpm）上，在室温避光条件下孵育15分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>PBS洗涤：
	<ol>
		<li>向离心管中加入1 ml PBS，在4 °C下以380 × g离心3分钟。</li>
		<li>弃去上清液（或倾倒除去），管内残留约100 µl液体即可。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用Tween-20进行透化处理：
	<ol>
		<li>配制含有0.7% Tween-20的PBS透化缓冲液。</li>
		<li>向100 µl细胞悬液中加入500 µl透化缓冲液。</li>
		<li>将离心管置于摇床（100 rpm）上，在室温避光条件下孵育15分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用PBS洗涤细胞一次（如第4.2节所述），并彻底移除上清液，仅保留沉淀。</li>
</ol>
5. 胞内抗原染色38（图4）
<ol>
	<li>一抗溶液的配制：
	<ol>
		<li>用含1%牛血清白蛋白和10%血清的稀释缓冲液稀释一抗例如， 正常驴或山羊血清）和0.5% Tween-20 的PBS溶液。 
		注意：根据制备二抗所用的物种选择相应的血清。</li>
		<li>或者，根据制造商说明书，使用Zenon荧光素标记一抗。
		<ol>
			<li>准备 1 µg 在适当稀释度的 PBS 中加入一抗（总体积 ≤ 20 µl).</li>
			<li>添加 5 µl 加入Zenon荧光素IgG标记试剂（组分A）至抗体溶液中。</li>
			<li>在室温下孵育混合物5分钟。</li>
			<li>添加 5 µl 加入Zenon封闭试剂（组分B）至反应混合物中。</li>
			<li>室温孵育混合物5分钟。在30分钟内将抗体加入样本。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>一抗染色：
	<ol>
		<li>添加 100 µl 将一抗溶液加入细胞沉淀中，轻轻吹打混匀。</li>
		<li>或者，将Zenon荧光素标记的抗体以适当的稀释比例加入细胞悬液中。</li>
		<li>在室温下于摇床（200 rpm）中避光孵育试管30分钟。用PBS洗涤细胞一次（如第4.2节所述），并彻底移除试管中的上清液，仅保留沉淀。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>二抗染色（Zenon 荧光素标记抗体无需此步骤）：
	<ol>
		<li>用 PBS 将二抗稀释至适当浓度。</li>
		<li>添加 100 µl 向细胞沉淀中加入二抗溶液，轻轻吹打混匀。将离心管置于摇床中，室温避光孵育30分钟（200 rpm）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用 PBS 清洗样品两次（如前所述） 第4.2节).</li>
	<li>用流式缓冲液洗涤一次（参见 第3.5节).</li>
	<li>将细胞重悬于约 150 µl 加入流动缓冲液，然后在流式细胞仪上进行分析。</li>
</ol>
<img alt="使用FITC与APC进行流式细胞术数据分析；六张MAP2和CD24标记的散点图。" src="/files/ftp_upload/52241/52241fig4highres.jpg" width="700" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图4"> 
图4. 表面蛋白与细胞内蛋白的共染色。 流式细胞术数据显示了基于一抗+二抗的细胞内染色与Zenon荧光素法细胞内染色结合表面染色的比较结果。y轴上的单独阳性信号（左上象限）和x轴上的单独阳性信号（右下象限）分别显示了针对MAP2和CD24染色的细胞。共染色后，MAP2和CD24的共同表达可见于右上象限（右侧面板）。使用Alexa Fluor 488（上方；AF488）与Zenon荧光素（下方）对MAP2进行标记的比较结果显示相似的染色效果。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52241/52241fig4highres.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
6. 流式细胞术分析
<ol>
	<li>染色程序完成后，立即使用配备适当信号检测滤光片的流式细胞仪进行流式细胞术分析。采用488 nm蓝色激光和640 nm红色激光，搭配FL-1（533/30）、FL-2（585/40）和FL-4（675/25）带通滤光片。</li>
	<li>根据前向散射光和侧向散射光设置初始门控，排除碎片和死亡细胞。</li>
	<li>根据未染色样本及单染对照样本进行荧光补偿，设置表面抗原和细胞内抗原的荧光门控，使阴性信号≤0.5%。</li>
</ol>

作者声明不存在潜在的利益冲突。

本文所述方案已广泛应用于源自人类干细胞的神经细胞培养，同样也可适用于其他神经细胞来源，包括原代组织或神经细胞系。除了胚胎来源外，还可从成年脑的神经发生区域分离获得神经干细胞或前体细胞27。此外，流式细胞术和荧光激活细胞分选技术（FACS）可用于定量、分析和分离多种细胞群体，包括成熟神经元54、星形胶质细胞33、小胶质细胞55、少突胶质细胞56以及出生后脑组织中的内皮细胞57。
无论来源如何，每种细胞类型的固定和透化最佳条件均需通过实验确定，因为其中任一步骤过度进行均可能导致散射特性发生显著改变，从而影响流式细胞术的检测结果。该方案的效率还取决于透化后表面分子的稳定性。需要注意的是，不同的表面表位在操作过程中可能受到不同程度的影响。此外，例如使用胰蛋白酶替代物或Liberase-1进行酶法消化，可能会影响一系列细胞表面表位，但相较于使用Accutase或木瓜蛋白酶，其影响程度较轻7。
<p class="jove_conte...

流式细胞术已在免疫学、血液学和肿瘤学中得到广泛应用，通过细胞固有的散射特性、细胞表面抗原表达以及其他荧光参数来定义细胞群体1-3。我们对血液谱系发育及疾病的认识在很大程度上得益于该方法自首次应用以来的持续优化4,5。近年来，随着对流式细胞术定量能力及整体分析潜力的认识不断提高，其在干细胞研究中的应用日益广泛，有望在更短时间内推动产生同样深远的进展6。然而，将流式细胞术专门用于分析和分离神经细胞群体长期以来被认为具有挑战性。与天然处于悬浮状态的造血细胞不同，神经细胞通常来源于极为复杂的组织，其中可能包含胶质细胞及多种其他周围细胞，以及由具有突起的神经元构成的复杂网络。因此，神经生物学尚未在日常研究实践中充分发挥流式细胞术的多功能性。然而，只要能够制备出可行的单细胞悬液（已有针对此目的设计并优化的实验方案7），流式细胞术和荧光激活细胞分选（FACS）即可被视为神经生物学分析工具库中的重要组成部分8-11。
<img alt="Flow cytometry diagram: single-cell suspension, hydrodynamic focusing, laser excitation, scatter detection." src="/files/ftp_upload/52241/52241fig1highres.jpg" width="600" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 1"> 
图1. 流式细胞术分析原理及流式细胞仪的组成部件 流式细胞仪包含三个主要系统：流体系统、光学系统和电子系统。悬浮液中的细胞以层流形式流动（样品来源于原代组织或 体外 通过鞘液的流体动力学聚焦作用，样品被限制在其中心核心区域。光学部件由激光器和光学滤光片组成，激光器用于照射细胞流，光学滤光片则将信号引导至相应的检测器。所检测到的光信号被转换为电子信号，随后由计算机处理，并在显示器上呈现，用于数据分析和设门。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52241/52241fig1highres.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
使用流式细胞术方法的研究人员至少应具备一些基本理论知识，包括了解流式细胞仪的构成组件（综述见12,13；另请参见 图1）。一束激光与包含悬浮细胞的流体射流在流体动力学聚焦下相交，细胞依次以“单列”形式通过激光束。当细胞（或其他任何颗粒）穿过激光时，会在检测点产生光散射。散射光可在激光传播方向的前方（前向散射，反映颗粒大小）以及与其方向垂直的方向（侧向散射，反映颗粒/细胞的颗粒度）被检测到。上述散射特性无需特定标记即可检测，因此未标记的样本（或细胞碎片、气泡等） 等等。）将在常用的双变量前向散射与侧向散射图（用于初始设门）上产生信号（事件）。通过使用针对相应激发和发射光谱的特定激光器和滤光片，可分析细胞对荧光标记物的阳性表达、强度水平或阴性情况。大多数流式细胞术应用主要集中于通过细胞表面抗原进行细胞表征。与造血细胞谱系不同，神经谱系在表面表位表达模式方面的界定仍相对有限。5利用表面抗原的一个优势在于，活细胞可直接用于细胞分选策略，例如流式细胞分选（FACS）。相比之下，细胞内抗原染色需要经过固定和透化步骤以实现表位与抗体的结合，从而无法保留细胞活性，限制了后续依赖活细胞的实验应用。值得注意的是，此类方法仍可兼容多种定量检测分析。14 以及用于RNA和蛋白质表达的下游分析15血液学、免疫学和肿瘤学通常联合使用十余种标志物来定义特定亚群16此外，质谱流式细胞术（CyTOF）目前可用于同时分析多达30个参数17,18.
用于神经干细胞应用以及原代培养14,19,20 细胞的异质性 体外 是一种常见现象21-23不代表目标感兴趣细胞群体的细胞是实验读数中一个潜在的混杂因素24,25方便的是，异质性细胞悬液中存在的不同细胞亚群具有独特（已知或尚待解析）的抗原表达谱，可利用这些特征来界定各种细胞群体。因此，流式细胞术在解析细胞异质性方面可发挥关键作用，从而促进生物医学应用体外 检测、细胞治疗）并通过关注最相关的子集来优化定量读出24,26近年来已鉴定出多种表面抗原组合，可用于定量和分离特定的神经细胞类型，其中包括使用CD133富集神经干细胞27CD15/CD24/CD29表面抗原组合用于分离神经干细胞、分化神经元及神经嵴细胞28 或使用 CD15/CD24/CD44/CD184/CD271 分选神经细胞和胶质细胞亚群25以及其他特征29,30除了神经元外，胶质细胞标记物还包括 A2B531CD4425，NG232 和GLAST33近期一项研究利用了中脑底板前体细胞标志物CORIN34,35 以富集帕金森病细胞移植范式中的多巴胺能前体细胞36CD分子不仅是标记物，而且是细胞间相互作用以及细胞对细胞外基质分子和生长因子信号产生应答能力的功能相关介质37进一步增强用于表征神经谱系发育的组合性CD抗原工具库的一种策略，是利用已知的细胞内标志物筛选并确定特定目标细胞类型的CD抗原组合。我们近期采用这一方法，鉴定了CD49f–/CD200高 组合表达模式作为从神经分化诱导多能干细胞培养体系中富集神经元亚群的新方法38在此，我们介绍并讨论后一种方案（及其可选的变体），该方案可同时结合表面染色与细胞内染色，用于通过流式细胞术鉴定神经细胞亚群。
<img alt="神经细胞培养流程图、CFSE染料标记、流式细胞术分析、FACS分选。" src="/files/ftp_upload/52241/52241fig2highres.jpg" width="300" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图2"> 
图2. 实验方案选项的流程图。 该图示意性地展示了本实验方案所涉及的主要步骤。可选步骤（CFSE染料标记或细胞内抗原标记）以浅灰色方框表示。收获细胞后，在进行细胞表面染色前，必须评估神经细胞悬液的活力和细胞数量。除目标样本外，还需设置阳性对照和阴性对照。样本可用于流式细胞术分析和/或细胞分选实验。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52241/52241fig2highres.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
尽管我们此前曾联合使用一抗和二抗进行细胞内染色38，但现在我们引入一种略有不同的方法，即通过荧光Fab片段（Zenon标记法）对一抗进行非共价标记，从而减少细胞操作步骤39。此外，为进一步体现本方案的灵活性，我们可选择在表面抗原染色前，使用羧基荧光素琥珀酰亚胺酯（CFSE）对其中一个实验亚群进行可选标记。这种CFSE预标记可在单个样品管内直接比较两种细胞系或实验条件（CFSE标记组 vs. 未标记组），减少孵育时间上的差异或细微偏差，并节省抗体用量。CFSE是一种成熟的荧光染料，广泛用于细胞示踪40、增殖分析41,42以及条形码实验43,44。最后，尽管实际分选步骤（如流式细胞分选、免疫磁珠分选或免疫贴壁分选）不属于本方案内容，但原则上，此处所述的收获与标记程序所获得的样品可用于基于表面抗原或细胞内标记的分选应用15,25,28。
本文旨在：总结一种可行的表面抗原染色方案25,28，总结一种用于检测细胞内靶标以及联合进行表面与细胞内抗原分析的方案38，介绍一种细胞内CFSE染料标记步骤41,45，作为神经细胞群体比较分析的实验选择，并总结流式细胞术分析的方法（包括适当的对照13,46、设门策略及数据呈现方式47）。

<table><tbody><tr><td>DMEM/F12 (1:1)（Dulbecco 改良 Eagle 培养基/营养混合物 F-12）</td><td><a href="http://www.lifetechnologies.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Life Technologies</a></td><td>11330057</td><td></td></tr><tr><td>不含 Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; 和 Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; 的 DPBS</td><td><a href="http://www.lifetechnologies.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Life Technologies</a></td><td>14190169</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清，经鉴定合格，欧盟批准，南美来源（FBS）</td><td><a href="http://www.lifetechnologies.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Life Technologies</a></td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>MEM 非必需氨基酸（100 倍浓缩液）</td><td><a href="http://www.lifetechnologies.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Life Technologies</a></td><td>11140035</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express</td><td><a href="http://www.lifetechnologies.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Life Technologies</a></td><td>12604013</td><td></td></tr><tr><td>台盼蓝溶液，0.4%</td><td><a href="http://www.lifetechnologies.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Life Technologies</a></td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td><a href="http://www.carlroth.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Carl Roth</a></td><td>335.3</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA）第五组分</td><td><a href="http://www.gelifesciences.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> PAA Laboratories, Coelbe</a></td><td>K41-001</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20 去垢剂</td><td><a href="http://www.merckmillipore.de" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Calbiochem</a></td><td>655205</td><td></td></tr><tr><td>羧基荧光素琥珀酰亚胺酯（CFSE）</td><td><a href="http://www.ebioscience.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> eBioscience</a></td><td>65-0850-84</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td><a href="http://www.applichem.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> AppliChem</a></td><td>A1584</td><td></td></tr><tr><td>瓶顶滤器 Express Plus 0.22 &amp;micro;m，250 ml</td><td><a href="http://www.millipore.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Millipore</a></td><td>SCGPU02RE</td><td></td></tr><tr><td>细胞培养处理过的培养瓶（T 25）</td><td><a href="http://www.thermoscientific.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> NUNC</a></td><td>156367</td><td></td></tr><tr><td>细胞培养处理过的培养瓶（T 75）</td><td><a href="http://www.thermoscientific.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> NUNC</a></td><td>156499</td><td></td></tr><tr><td>锥形管（15 ml）</td><td><a href="http://www.greinerbioone.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Greiner Bio-One</a></td><td>188271</td><td></td></tr><tr><td>锥形管（50 ml）</td><td><a href="http://www.greinerbioone.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Greiner Bio-One</a></td><td>227261</td><td></td></tr><tr><td>巴斯德移液管，玻璃材质（150 mm）</td><td><a href="http://www.stein-labortechnik.de" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> STEIN Labortechnik, Remchingen</a></td><td>S03710150</td><td></td></tr><tr><td>移液器吸头（0.1–10 &amp;micro;l）</td><td><a href="http://www.corning.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Corning</a></td><td>4125</td><td></td></tr><tr><td>移液器吸头（1–200 &amp;micro;l）</td><td><a href="http://www.corning.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Corning</a></td><td>4126</td><td></td></tr><tr><td>移液器吸头（100–1000 &amp;micro;l）</td><td><a href="http://www.corning.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Corning</a></td><td>4129</td><td></td></tr><tr><td>血清移液管，5 ml</td><td><a href="http://www.corning.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Corning</a></td><td>4051</td><td></td></tr><tr><td>血清移液管，10 ml</td><td><a href="http://www.corning.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Corning</a></td><td>4101</td><td></td></tr><tr><td>血清移液管，25 ml</td><td><a href="http://www.corning.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Corning</a></td><td>4251</td><td></td></tr><tr><td>微量离心管（0.5 ml）</td><td><a href="http://www.sarstedt.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Sarstedt</a></td><td>72,699</td><td></td></tr><tr><td>微量离心管（1.5 ml）</td><td><a href="http://www.greinerbioone.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Greiner Bio-One</a></td><td>616201</td><td></td></tr><tr><td>微量离心管（2.0 ml）</td><td><a href="http://www.sarstedt.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Sarstedt</a></td><td>72,695,500</td><td></td></tr><tr><td>抗人 CD24 APC 单克隆抗体</td><td><a href="http://www.ebioscience.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> eBioscience</a></td><td>17-0247-42</td><td>工作稀释度 1:50</td></tr><tr><td>抗人 CD54 PE 单克隆抗体</td><td><a href="http://www.ebioscience.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> eBioscience</a></td><td>12-0549-42</td><td>工作稀释度 1:50</td></tr><tr><td>神经元 III 类 &amp;beta;-微管蛋白（Tuj1）多克隆抗体</td><td><a href="http://www.covance.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Covance</a></td><td>PRB-435P</td><td>工作稀释度 1:2,000</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 驴抗兔抗体</td><td><a href="http://www.lifetechnologies.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Life Technologies</a></td><td>A21206</td><td>工作稀释度 1:2,000</td></tr><tr><td>Zenon&amp;reg; 荧光素兔 IgG 标记试剂盒</td><td><a href="http://www.lifetechnologies.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Life Technologies</a></td><td>Z-25342</td><td></td></tr><tr><td>改进型 Neubauer 计数板</td><td><a href="http://www.marienfeld-superior.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Marienfeld</a></td><td>0640010</td><td></td></tr><tr><td>涡旋振荡器</td><td><a href="http://www.scientificindustries.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Scientific Industries</a></td><td>G560E</td><td></td></tr><tr><td>Thermomixer comfort 恒温混匀仪</td><td><a href="http://www.eppendorf.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Eppendorf</a></td><td>5355 000.001</td><td></td></tr><tr><td>Accuri C6 流式细胞仪</td><td><a href="http://www.bdbiosciences.com/instruments/accuri" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Becton Dickinson (BD)</a></td><td>653118</td><td></td></tr><tr><td>带制冷功能的微量离心机，PerfectSpin 24 R</td><td><a href="http://www.peqlab.de" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Peqlab</a></td><td>91-PSPIN-24R</td><td></td></tr><tr><td>轨道摇床，Unimax 1010</td><td><a href="http://www.heidolph-instruments.de" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Heidolph</a></td><td>543-12310-00</td><td></td></tr><tr><td>带制冷功能的离心机，Rotanta 96 RC</td><td><a href="http://www.hettichlab.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Hettich</a></td><td>4480-50</td><td></td></tr><tr><td>II 级生物安全柜 Safe 2020</td><td><a href="http://www.thermoscientific.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Thermo Scientific</a></td><td>51026640</td><td></td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 培养箱，Heracell 240i</td><td><a href="http://www.thermoscientific.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Thermo Scientific</a></td><td>51026331</td><td></td></tr><tr><td>真空系统，Vacusafe comfort</td><td><a href="http://www.integra-biosciences.de" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Integra Biosciences</a></td><td>158320</td><td></td></tr><tr><td>显微镜，Axiovert 40 CFL</td><td><a href="http://www.zeiss.de" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Zeiss</a></td><td>451212</td><td></td></tr><tr><td>移液控制器，accu-jet pro</td><td><a href="http://www.brand.de" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Brand</a></td><td>26303</td><td></td></tr><tr><td>微量移液器，Pipetman neo P20N（2–20 &amp;micro;l）</td><td><a href="http://www.gilson.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Gilson</a></td><td>F144563</td><td></td></tr><tr><td>微量移液器，Pipetman neo P200N（20–200 &amp;micro;l）</td><td><a href="http://www.gilson.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Gilson</a></td><td>F144565</td><td></td></tr><tr><td>微量移液器，Pipetman neo P1000N（100–1000 &amp;micro;l）</td><td><a href="http://www.gilson.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Gilson</a></td><td>F144566</td><td></td></tr></tbody></table>

神经细胞类型表面与细胞内抗原分析的流式细胞术方案

Flow Cytometry Protocols for Surface and Intracellular Antigen Analyses of Neural Cell Types

流式细胞术已广泛应用于免疫学、血液学和肿瘤学中细胞群体的定义。本文详细描述了用于神经细胞类型中分化簇（CD）表面抗原及细胞内抗原流式细胞分析的实验方案。我们对方法步骤的逐步说明包括：神经细胞的收集 体外 培养物，可选的羧基荧光素琥珀酰亚胺酯（CFSE）标记步骤，随后使用偶联CD抗体进行表面抗原染色（例如， CD24、CD54）以及通过一抗/二抗或荧光标记的Fab片段（Zenon标记法）进行后续的胞内抗原检测。视频展示了其中最关键的实验步骤。此外，本文简要介绍了实验设计的基本原则、关键对照的设置以及流式细胞术分析的基础知识（包括目标细胞群的识别与碎片排除、设门策略、光谱重叠的补偿），旨在帮助神经生物学领域中对流式细胞术缺乏前期知识或专门训练的研究人员评估该技术的适用性，并更充分地利用这一强大方法。

本文所展示的实验方案具有多种应用方式（图2）。在最简版本（步骤1、3和6）中，该方案可作为细胞表面抗原简单染色的操作指南。&#160; 在更复杂的流程中，可结合多种胞内抗原进行共标记实验（可选步骤2和/或步骤4至5）。此外，CFSE标记步骤展示了该方法在细胞亚群标记与追踪研究中的实用性，适用于细胞间相互作用研究或流式细胞术条形码实验（步骤2）。通过（步骤2和/或3）获得的活细胞群体可用于细胞分选（FACS）及后续分析，包括分选后细胞培养。另一方面，联合进行胞内与表面抗原染色（步骤3至5）本身即可提供有效的分析读出结果。例如，识别特定神经细胞亚群上某些CD抗原的共表达情况（我们已在Turaç et al.38中应用此方法，用于鉴定神...

我们提供了一种用于神经细胞类型表面抗原和/或细胞内抗原流式细胞术分析的实验方案的详细描述。文中阐述了实验设计的关键要点、逐步的操作方法以及流式细胞术的基本原理，旨在帮助神经生物学家充分利用这一强大技术。

流式细胞术已广泛应用于免疫学、血液学和肿瘤学中细胞群体的鉴定。本文中，我们详细描述了……

本实验的总体目标是利用流式细胞术分析神经细胞表面及细胞内抗原的表达。首先，从体外培养物或原代神经组织中分离获取神经细胞。随后，可选择性地对细胞进行非特异性细胞内染色。随后，目标表面抗原立即用一抗进行标记，而目标细胞内抗原则在细胞固定和通透后进行标记。最终，可通过流式细胞术分析由细胞内标记所定义的特定神经亚群中表面抗原的共表达情况，从而获得结果。本方案将演示如何制备组织培养来源的神经细胞，以利用多色流式细胞术检测其表面抗原和细胞内抗原。首先用五毫升室温的无镁无钙 PBS 轻柔洗涤 T75 培养瓶中的贴壁神经细胞一次，开始收获细胞。然后加入三毫升胰蛋白酶替代液，37 摄氏度孵育 2 至 5 分钟，使细胞从培养瓶壁上脱离。通过移液吹打细胞悬液数次以分散细胞团块，随后加入六毫升流式缓冲液终止酶消化反应，并将全部细胞悬液转移至一个新的 15 毫升离心管中以分离细胞。将离心管放入离心机中，在室温下离心5分钟以沉淀细胞，随后吸除上清液，为细胞内染料标记做准备。用5 mL含0.1% BSA的PBS重悬细胞沉淀。或者，根据标准台盼蓝染色方案，加入5 mL流式缓冲液。使用血细胞计数板估算有效活细胞数量。用上一步所用的相同缓冲液，将现有细胞悬液的浓度调整至每毫升含100万个活细胞。这些细胞现在可用于两种染色方案：一种是表面抗原抗体染色，另一种是可选的羧基荧光素荧光细胞内染色，随后进行前述的表面抗原染色。使用羧基荧光素CIN酯染料进行细胞内标记时，首先向每毫升细胞悬液中加入10微升CFSE储备液。将试管置于200转/分钟的摇床上，室温孵育5分钟。为防止光漂白，操作过程中应避免试管直接暴露于光照下。通过加入五倍体积含血清的流式缓冲液来淬灭所有未反应的染料，并轻轻吹打混匀数次。然后在室温下离心五分钟，沉淀细胞，并吸除上清液以去除残留的未反应染料。用五倍体积的流式缓冲液重悬细胞沉淀进行洗涤。然后在室温下离心5分钟，再次沉淀细胞，弃去上清液。最后用流式缓冲液重悬细胞沉淀，使最终细胞浓度为每毫升100万个活细胞。对于多重实验，向CFSC染色的细胞悬液中加入来自不同实验条件的等量未染色的目标细胞。细胞现已准备好进行表面抗原标记，可开始细胞表面染色。将100微升含或不含CFSC标记的细胞悬液转移至新的1.5毫升离心管中。根据先前通过抗体滴定实验确定的用量，向细胞悬液中加入荧光四号偶联抗体。将离心管置于室温摇床中，以100 RPM转速振荡，孵育混合物30分钟。在避光条件下，加入1毫升流式缓冲液稀释抗体混合物。轻轻吹打混匀，然后在预冷至4 °C的微量离心机中以4分钟离心沉淀细胞。吸弃上清液以去除未结合的抗体，重复此洗涤离心和吸弃步骤一次。将之前染色的细胞沉淀重悬于 100 µL 流式缓冲液中。向 100 微升细胞悬液中加入 500 微升固定缓冲液。将试管置于室温摇床中，以 100 RPM 转速在避光

flow-cytometry-protocols-for-surface-intracellular-antigen-analyses

Research

科研

JoVE Journal

Neuroscience

神经科学

神经细胞类型的流式细胞仪协议的表面和细胞内抗原分析

本视频方案展示了一种基于流式细胞术技术，利用神经干细胞（NSCs）的物理特性（大小和内部粒度）及荧光特性，从可再生的神经干细胞来源中生成并随后纯化神经祖细胞的新方法。...

神经母细胞检测：一种利用流式细胞术从分化中的神经干细胞后代中生成并富集神经祖细胞的检测方法

来源：Becker-Kojić, Z. A.，等.，无转基因方法生成血液来源神经元细胞。J. Vis. Exp.

外周血来源细胞分化神经细胞的免疫荧光显微镜检测

来源： Hidmark, A. S., 等. 利用流式细胞术分析单只小鼠单侧坐骨神经和背根神经节中的免疫细胞. J. Vis. Exp. (2017).

利用流式细胞术分析小鼠神经系统组织中的免疫细胞

近年来，基于活细胞的检测方法已成功用于检测针对细胞表面和构象性抗原的抗体。本文介绍了一种利用高通量流式细胞术的方法，可实现对大规模患者队列的分析。新抗体的发现将有助于改善免疫介导性疾病的确诊与治疗。...

高通量流式细胞术细胞检测法用于检测人血清中抗N-甲基-D-天冬氨酸受体或抗多巴胺-2受体抗体

本实验方案的目的是利用荧光激活细胞分选（FACS）技术分选出特定类型的神经细胞，以便后续分析细胞类型特异性的基因表达、表观遗传标记和/或蛋白质表达。...

利用荧光激活细胞分选技术分析大鼠脑组织中特定细胞类型的基因表达

本方案通过流式细胞术分析成年小鼠中枢神经系统中的巨噬细胞亚群，有助于研究这些细胞表达的多种标志物。...

通过流式细胞术分析中枢神经系统中的小胶质细胞和单核细胞来源的巨噬细胞

我们介绍一种流式细胞术方法，可同时鉴定从小鼠脑或脊髓中分离的不同细胞类型。该方法可用于在神经退行性疾病中分离或表征纯化的细胞群体，或用于定量评估在体内给予病毒载体或纳米颗粒后对细胞的靶向程度。...

通过不同匀浆方法从小鼠脑/脊髓中分离多种细胞类型的同步流式细胞术表征

本文提供了一种在小鼠中诱导主动实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）的实验方案。同时介绍了一种分离和表征中枢神经系统（CNS）中浸润性淋巴细胞的方法，以展示淋巴细胞在CNS自身免疫性疾病发生过程中的作用。...

实验性自身免疫性脑脊髓炎期间中枢神经系统淋巴细胞浸润的流式细胞术分析

我们开发了一种方法，可从新鲜冷冻组织中富集并分离人星形胶质细胞群体，用于后续分子分析。...

利用荧光激活细胞核分选技术从新鲜冷冻皮层中分离成人人类星形胶质细胞群体

迄今为止，尚无能够从同一只小鼠中同时分离出所有主要中枢神经系统常驻细胞类型的实验方案。本方案适用于正常小鼠及实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠，可用于研究神经炎症期间复杂的细胞网络，同时减少所需实验小鼠的数量。...

从成年自身免疫性脑脊髓炎小鼠中同时分离主要的中枢神经系统常驻细胞类型

本文介绍了两种利用流式细胞术定量分析小胶质细胞吞噬vGLUT1阳性突触以及pHRodo Red标记的粗制突触体的实验方案。...

利用流式细胞术定量小胶质细胞对突触物质的吞噬作用

学习利用流式细胞术分析神经细胞表面与胞内抗原的实验方法。本方案涵盖细胞收获、荧光标记、固定通透及多色检测步骤，适用于体外培养或原代神经组织，助力神经生物学研究者精准鉴定特定神经亚群的功能状态。

神经细胞类型表面与细胞内抗原分析的流式细胞术方案

探索更多视频