神经细胞类型表面与细胞内抗原分析的流式细胞术方案

本实验的总体目标是利用流式细胞术分析神经细胞表面及细胞内抗原的表达。首先，从体外培养物或原代神经组织中分离获取神经细胞。随后，可选择性地对细胞进行非特异性细胞内染色。

随后，目标表面抗原立即用一抗进行标记，而目标细胞内抗原则在细胞固定和通透后进行标记。最终，可通过流式细胞术分析由细胞内标记所定义的特定神经亚群中表面抗原的共表达情况，从而获得结果。本方案将演示如何制备组织培养来源的神经细胞，以利用多色流式细胞术检测其表面抗原和细胞内抗原。

首先用五毫升室温的无镁无钙 PBS 轻柔洗涤 T75 培养瓶中的贴壁神经细胞一次，开始收获细胞。然后加入三毫升胰蛋白酶替代液，37 摄氏度孵育 2 至 5 分钟，使细胞从培养瓶壁上脱离。通过移液吹打细胞悬液数次以分散细胞团块，随后加入六毫升流式缓冲液终止酶消化反应，并将全部细胞悬液转移至一个新的 15 毫升离心管中以分离细胞。

将离心管放入离心机中，在室温下离心5分钟以沉淀细胞，随后吸除上清液，为细胞内染料标记做准备。用5 mL含0.1% BSA的PBS重悬细胞沉淀。或者，根据标准台盼蓝染色方案，加入5 mL流式缓冲液。

使用血细胞计数板估算有效活细胞数量。用上一步所用的相同缓冲液，将现有细胞悬液的浓度调整至每毫升含100万个活细胞。这些细胞现在可用于两种染色方案：一种是表面抗原抗体染色，另一种是可选的羧基荧光素荧光细胞内染色，随后进行前述的表面抗原染色。

使用羧基荧光素CIN酯染料进行细胞内标记时，首先向每毫升细胞悬液中加入10微升CFSE储备液。将试管置于200转/分钟的摇床上，室温孵育5分钟。为防止光漂白，操作过程中应避免试管直接暴露于光照下。

通过加入五倍体积含血清的流式缓冲液来淬灭所有未反应的染料，并轻轻吹打混匀数次。然后在室温下离心五分钟，沉淀细胞，并吸除上清液以去除残留的未反应染料。用五倍体积的流式缓冲液重悬细胞沉淀进行洗涤。

然后在室温下离心5分钟，再次沉淀细胞，弃去上清液。最后用流式缓冲液重悬细胞沉淀，使最终细胞浓度为每毫升100万个活细胞。对于多重实验，向CFSC染色的细胞悬液中加入来自不同实验条件的等量未染色的目标细胞。

细胞现已准备好进行表面抗原标记，可开始细胞表面染色。将100微升含或不含CFSC标记的细胞悬液转移至新的1.5毫升离心管中。根据先前通过抗体滴定实验确定的用量，向细胞悬液中加入荧光四号偶联抗体。

将离心管置于室温摇床中，以100 RPM转速振荡，孵育混合物30分钟。在避光条件下，加入1毫升流式缓冲液稀释抗体混合物。轻轻吹打混匀，然后在预冷至4 °C的微量离心机中以4分钟离心沉淀细胞。

吸弃上清液以去除未结合的抗体，重复此洗涤离心和吸弃步骤一次。将之前染色的细胞沉淀重悬于 100 µL 流式缓冲液中。

向 100 微升细胞悬液中加入 500 微升固定缓冲液。将试管置于室温摇床中，以 100 RPM 转速在避光条件下孵育 15 分钟。甲醛将使彼此靠近的全部蛋白质和 DNA 分子发生交联，从而获得无活性的细胞悬液。

将固定液用一毫升 PBS 稀释，轻轻吹打混匀数次。随后将固定的细胞在预冷至 4°C 的离心机中离心 3 分钟。吸除上清液，保留约 100 微升液体覆盖在细胞沉淀上方，以通透细胞膜，便于后续细胞内抗原标记。

向100微升细胞悬液中加入500微升透化缓冲液。将离心管置于室温摇床中，以100 RPM转速在避光条件下孵育15分钟。通过加入1毫升PBS轻柔吹打混匀数次，稀释透化后的混合物，并在预冷至4°C的离心机中以3分钟离心沉淀固定后的细胞。

孵育前彻底吸除上清液。通过将抗体稀释于含0.5%吐温20的PBS缓冲液中，制备一抗工作液。该工作液可进一步添加1% BSA、10%驴血清或10%山羊血清进行优化。

然后用100微升的一抗工作液重悬膜通透性细胞沉淀。将离心管置于室温摇床，200 RPM避光孵育30分钟。加入1毫升流式缓冲液，稀释一抗混合物。

轻轻吹打数次以混匀，然后在预冷至4摄氏度的离心机中以4分钟离心沉淀细胞。吸除上清液，彻底去除未结合的抗体。接下来，用100微升二抗工作液重悬沉淀。

在避光条件下于室温孵育30分钟。在同一摇床上，加入1毫升流式缓冲液，稀释二抗混合物。重复相同的试管颠倒混匀操作，离心并去除上清液，以清除所有未结合的抗体。

用新鲜的 PBS 作为洗涤缓冲液，重复上述 1 毫升洗涤、离心及去除上清液的步骤，共额外进行两次。最终将获得一个干净的细胞沉淀，该沉淀已标记有细胞外或细胞内靶向的 CFSC 荧光抗体，或三种标记的任意组合。将标记后的细胞沉淀重悬于 150 微升流式缓冲液中。将细胞悬液转移至流式细胞仪，并根据每种荧光染料对应的适当激光激发波长和发射滤光片设置，开始分析。

以正向散射和侧向散射数据为参考，在流式细胞术分析软件中初步设置正向散射与侧向散射图，以排除细胞碎片和死细胞等非特异性数据点。接着，以未染色细胞悬液的原始数据作为阴性对照，设置多个荧光积分门，用于选择来自胞外和胞内抗原标记的阳性发射信号，以校正多色荧光的背景信号。利用单抗体染色对照的原始数据，调整荧光门以校正光谱重叠效应。

在多重流式实验中，羧基荧光素标记可作为基线信号，用于区分来自两种不同谱系或实验条件的细胞，而无需使用抗体。例如，在异质性细胞悬液中，仅通过观察绿色荧光通道中是否存在荧光信号，即可立即区分用CFSC标记的神经细胞与未标记的成纤维细胞。此外，结合CFSE乙酯标记，可使用不同颜色的荧光抗体，分析混合样本中CFSE标记与未标记细胞亚群之间表面抗原表达的差异。

例如，在绿色荧光通道中标记了CFSE的SHSY5Y神经母细胞瘤细胞高表达CD24表面抗原，但不表达成纤维细胞标志物CD54。相反，CFSE阴性的BJ成纤维细胞表达CD54，而CD24水平较低。神经表面抗原的组合分析也可与基于抗体的细胞内抗原检测联合进行。

在对表面抗原和细胞内抗原进行检测时，包含未染色样本以及单染色对照样本至关重要，这可作为针对细胞内抗原（例如此处所示的神经标记物 map2）采用一抗加二抗标记方法的替代策略。对一抗进行非共价荧光标记可在共表达分析中获得可比的结果，同时缩短实验流程。观看本视频后，您应能够充分理解如何采用多种替代性标记方法及其组合，为基本的流式细胞术分析制备神经细胞。