Name: 对专为递送治疗因素的神经保护策略成人干细胞高通量表征 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 19 s
Description: 了解如何利用高内涵筛选系统对小鼠间充质干细胞进行高通量表征，通过活细胞成像和免疫标记分析细胞增殖与死亡，为神经保护治疗策略提供可靠的细胞行为数据。

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本研究由美国陆军医学研究与物资司令部（资助账号编号：W81XWH-11-1-0700）和干细胞研究基金提供资助。PAB 和 EMP 获得了埃姆斯实验室暑期本科生实验室实习项目（SULI）的资助。

1. 96 孔板的底物准备
<ol>
	<li>创建96孔板的示意图，标明待检测的不同底物和细胞类型（图&#160;1）。</li>
	<li>准备不同底物的储存液［聚-L-赖氨酸、纤连蛋白、I型胶原、层粘连蛋白以及entactin-collagen IV-laminin（ECL）］、96孔板，并在无菌细胞培养操作台中设置工作区域。</li>
	<li>用无菌磷酸盐缓冲液（PBS）将各底物储存液稀释至终浓度为5 µg/ml（该浓度此前已通过细胞生长与增殖的底物浓度依赖性实验确定）。在加入无菌储液槽前，使用涡旋振荡器充分混匀。</li>
	<li>根据96孔板示意图（图1），向各孔中加入100 µl底物溶液（使用12通道或8通道微量移液器可方便地向96孔板加样）。用Parafilm封口膜将板盖密封，并于4 °C过夜孵育。</li>
</ol>
2. 细胞铺板与延时成像
注意：小鼠间充质干细胞（MSCs）分离自成年C57BL/6小鼠的骨髓，并以贴壁细胞系形式进行培养。使用慢病毒载体感染MSCs，使其能够分泌脑源性神经营养因子（BDNF；人cDNA）和胶质细胞源性神经营养因子（GDNF；人cDNA），所用慢病毒载体分别编码BDNF（LV-BDNF；CMV-BDNF-IRES-GFP）、GDNF（LV-GDNF；CMV-GDNF-IRES-GFP）以及绿色荧光蛋白（GFP，LV-GFP；CMV-GFP）。 
注意：小鼠间充质干细胞（MSCs）的培养基为Iscove改良的Dulbecco培养基，含有10%杂交瘤细胞合格胎牛血清、10%马血清、2 mM L-谷氨酰胺、10,000 U/ml青霉素和10 mg/ml链霉素。五种不同类型的小鼠MSCs（MSCs、GFP-MSCs、BDNF-GFP-MSCs、GDNF-GFP-MSCs和BDNF/GDNF-GFP-MSCs）以约30%汇合度接种于T75细胞培养瓶中。
<ol>
	<li>细胞铺板
	<ol>
		<li>次日，用移液枪吸除各孔中的底物溶液，每孔用约 200 µl 无菌 PBS 洗涤两次。最后一次 PBS 洗涤后，向每孔加入细胞培养基（200 µl/孔）。将 96 孔板置于设定为 37 °C 和 5% CO₂ 的细胞培养箱中2 用于平衡。</li>
		<li>在96孔板于培养箱中平衡的同时，收集T75培养瓶中的细胞（收获/铺板时，间充质干细胞在T75培养瓶中的汇合度应约为70%），将生长培养基（称为条件培养基）从T75培养瓶中收集，并在无菌条件下储存于15 ml锥形管中（该条件培养基将在后续步骤2.1.4中使用）。</li>
		<li>向培养瓶中加入 8 ml 无菌 PBS，轻轻摇晃后吸去 PBS，然后加入 1 ml 0.05% 胰蛋白酶和 0.01% EDTA 溶液，以使细胞从 T75 培养瓶的培养表面脱落。使用配备相差光学系统的倒置显微镜观察培养瓶，监测细胞脱落情况。</li>
		<li>当细胞脱落后，立即向培养瓶中加入 8 ml 预先收集的条件培养基（步骤 2.1.2 中收集）。收集细胞悬液并转移至 15 ml 圆锥形离心管中，在 450 × g 条件下离心 4 分钟以沉淀细胞。</li>
		<li>吸除上清液，将细胞沉淀重悬于200 µl新鲜且预热至37 °C的细胞培养基中。</li>
		<li>使用血细胞计数板通过台盼蓝染色活细胞计数法测定细胞悬液中的细胞数量。将细胞以每孔约300个细胞的密度接种至96孔板的相应孔中。</li>
		<li>对每一群细胞重复上述步骤。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>延时成像
	<ol>
		<li>待所有MSCs接种完成后，将96孔板放入培养箱中孵育2小时，以使MSCs贴附于基质。</li>
		<li>启动HCS系统，等待2小时使系统平衡。将环境控制器设置为37 °C，并连接含有5% CO的混合气体钢瓶2 向HCS系统环境箱供应恒定气源。</li>
		<li>将96孔板从培养箱中取出，结束2小时的平衡期后，直接放入HCS系统的细胞培养腔内。静置30分钟以平衡因温度变化引起的孔板热膨胀，随后启动成像与分析软件，配置孔板参数设置。</li>
		<li>选择20倍物镜进行成像。每种条件选择两个孔即， 纤连蛋白上的GFP-MSCs 等等。 （6种底物 × 5种MSC亚型，共30种条件 × 2个重复 = 总计60个孔），用于设置延时成像。在每个孔内选择两个成像位点。</li>
		<li>选择成像的合适光波长。 
		注意：选择两个不同的波长（相差和GFP荧光）进行延时成像。</li>
		<li>使用激光自动对焦聚焦于孔板底部，并对多个位点和多个孔进行试拍成像，以找到最佳焦平面。</li>
		<li>确定焦点后，对全部60个孔（120个位点）每5分钟采集一次图像，持续48小时。</li>
		<li>每隔24小时更换一次细胞培养液，将96孔板从HCS系统中取出。从每孔中移除75 µl培养基，并向每孔中加入100 µl预热至37 °C、5% CO₂平衡的新鲜培养基。2).</li>
		<li>延时实验结束后，从高内涵筛选系统中取出96孔板。在无菌条件下，从每个孔中收集条件培养基样本，并将这些样本转移至另一块96孔板中。 
		注意：这些样本可用于进一步分析，可通过ELISA检测神经营养因子。</li>
		<li>为后续实验（如Ki67细胞增殖检测或碘化丙啶活/死细胞染色检测）准备接种有培养MSC的96孔板（详见下文）。</li>
		<li>按照所述方法进行细胞迁移/细胞示踪的延时成像分析 第5节 如下。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Ki67 细胞增殖与碘化丙啶活/死细胞检测
<ol>
	<li>Ki67 细胞增殖检测（免疫细胞化学）
	<ol>
		<li>用 0.1 M 磷酸盐（PO4）缓冲液冲洗细胞培养物，每次 1 分钟，共冲洗两次。在室温下用 4% 多聚甲醛（PFA）固定培养物 20 分钟。去除 PFA，并用 PBS 冲洗孔板，每次 7 分钟，共三次。</li>
		<li>最后一次冲洗后，向每孔加入 100 µl 阻断液（磷酸盐缓冲液，5% 正常驴血清，0.4% 牛血清白蛋白，0.2% Triton X-100），在室温下孵育 1 小时。将兔抗 Ki67 一抗用阻断液按 1:200 的工作比例稀释后备用。</li>
		<li>去除阻断液，向每孔加入 100 µl 一抗溶液。盖上 96 孔板，在 4 °C 下过夜孵育。</li>
		<li>次日，去除一抗溶液，用 PBS 冲洗 7 分钟，重复三次。</li>
		<li>将二抗（驴抗兔 Cy3）用阻断液按 1:500 的工作比例稀释，并在二抗溶液中加入 DAPI 核染液，稀释比例为 1:100。最后一次 PBS 冲洗后，向每孔加入 100 µl 二抗/DAPI 混合溶液。在室温下避光孵育 90 分钟。</li>
		<li>去除二抗/DAPI 溶液，用 PBS 冲洗每孔，每次 7 分钟，共三次。盖上 96 孔板，于 4 °C 保存直至成像。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>碘化丙啶活/死细胞检测
	<ol>
		<li>采用碘化丙啶（PI）排除法检测细胞死亡，具体步骤如下所述。</li>
		<li>在培养基中配制浓度为 1.5 µM 的碘化丙啶染色液。</li>
		<li>向一孔间充质干细胞（MSCs）中加入 100 µl 70% 乙醇，处理 2 分钟以杀死细胞。该孔作为 PI 染色的阳性对照。大多数 MSCs 将被 PI 染色，表明细胞死亡。随后去除乙醇溶液。</li>
		<li>向每孔加入 100 µl 碘化丙啶染色液，在 37 °C、5% CO2 培养箱中孵育 20 分钟。</li>
		<li>用 0.1 M 磷酸盐缓冲液冲洗细胞，每次 1 分钟，共两次。在室温下用 0.1 M PO4 缓冲液中的 4% PFA 固定细胞 20 分钟。去除 PFA 后，用 PBS 冲洗三次，每次 7 分钟。</li>
		<li>将 DAPI 溶液（1:50 稀释于阻断液中）加入各孔，在室温下孵育 1 小时。用 PBS 冲洗所有孔，每次 7 分钟，共三次。</li>
		<li>去除 DAPI 溶液，用 PBS 冲洗每孔，每次 7 分钟，共三次。盖上 96 孔板，于 4 °C 保存直至成像。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 自动化成像与多波长评分分析
<ol>
	<li>将已进行 Ki67 免疫标记或碘化丙啶染色处理的 96 孔板载入高内涵筛选（HCS）系统，静置平衡 20 分钟，然后打开 HCS 系统的图像采集与分析软件。</li>
	<li>选择 10X 物镜的采集参数，相机 binning 设置为 1，增益设置为 2。利用自动曝光功能确定细胞所在的 Z 平面，并计算每个目标波长的偏移量。本分析中需采集 DAPI（W1）、Cy3（W2）和 FITC（W3）的图像。选择在阴性对照孔无信号时的最大强度水平进行图像采集，并确认该设置适用于阳性孔。</li>
	<li>开始采集整块板的图像，并将图像存储至图像采集与分析软件的数据库中。</li>
	<li>图像采集完成后，打开 HCS 系统的离线图像分析软件，调阅并查看上述采集的图像数据。</li>
	<li>选择多波长评分分析模式，为每个波长设置最小和最大强度阈值。 
	注意：DAPI 检测应标记每个可见细胞核周围的染色区域。Cy3 应检测出具有 Ki67 免疫反应性（IR）的阳性细胞，而在阴性对照条件下不应出现免疫反应信号。对于 Cy3 标记的 Ki67 免疫反应性，其近似最小宽度为 7 µm，近似最大宽度为 30 µm，信号强度需高于局部背景 150 个灰度级，最小染色面积为 50 µm2。</li>
	<li>对所有位置运行分析，将结果数据导出至电子表格中进行查看。</li>
</ol>
5. 细胞追踪
<ol>
	<li>打开图像采集与分析程序，点击“Review Plate Data [DB]…”，选择目标孔板。</li>
	<li>以“时间 vs. 孔”形式查看数据。</li>
	<li>在“Sites”部分中，通过左键点击选择其中一个位点。在“Wavelengths:”下选择“Transmitted…”。在96孔板模板中右键点击目标孔，然后点击“Load Images”。</li>
	<li>点击“Apps”，然后选择“Track Objects”，以追踪细胞。</li>
	<li>使用“动态数据交换 (DDE)”选择数据导出格式，e.g., Microsoft Excel。</li>
	<li>选择要导出的追踪数据，e.g., 经过时间、对象编号、移动距离、时间间隔、速度、绝对角度、距原点距离、Δx 和 Δy。</li>
	<li>按住“Ctrl键”并左键点击目标细胞，为每个感兴趣的细胞添加标签。</li>
	<li>开始细胞追踪。如有必要，按“Esc”键暂停或更正错误的追踪路径，然后调整设置。</li>
	<li>细胞追踪完成后，使用“Log Data”保存数据。</li>
</ol>

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</ol>

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成体间充质干细胞（MSCs）是一种理想的细胞类型，可用于开发结合细胞治疗与基因递送治疗的实验策略。MSCs具有多向分化潜能，能够分化为中胚层谱系的细胞，并表现出显著的可塑性，在适当的诱导条件下可分化或转分化为神经元和胶质细胞谱系17,18。此外，MSCs已在多种疾病的临床前研究中被移植并证明有效，包括神经退行性疾病19。MSCs的治疗效果广为人知，主要归因于其有益的抗增殖、抗炎和抗凋亡活性20。MSCs还被证实能够产生并分泌多种神经营养因子和生长因子，这可能有助于在损伤或疾病部位移植后，未修饰MSCs所表现出的神经保护特性21。重要的是，MSCs可通过基因修饰实现神经营养因子的持续递送，从而用于细胞治疗与基因治疗相结合的应用，并已在多种中枢神经系统损伤或疾病的动物模型中得到应用11,19,22。
在开发联合细胞治疗与基因治疗策略的过程中，至关重要的是在细胞广泛用于体外（in vitro）尤其是体内（in vivo）应用之前，仔细评估其健康状态。作为概念验证，我们研究了多种经基因工程改造的间充质干细胞（MSC）系及对照组MSC系，以利用高内涵筛选（HCS）方法评估基因修饰对细胞健康与适应性的影响。通常而言，HCS指基于细胞成像的高通量筛选14。该筛选方法可在多种实验条件下，对细胞表型在空间（从细胞到亚细胞水平）和时间（从毫秒到数天）尺度上进行定量评估。通过该方法，我们检测了不同培养基质对以下参数可能产生的影响：细胞增殖、绿色荧光蛋白（GFP）表达、细胞死亡以及细胞运动性/迁移能力。实验采用96孔细胞培养板设计。在单个培养板内，我们常规性地比较了不同慢病毒转导的MSC群体在各参数上可能存在的基质相关差异，并将基因工程改造的MSC与原始未转导的MSC进行对比。这使得我们能够通过一系列体外（in vitro）检测方法直接比较不同MSC亚型的结果，例如利用Ki67免疫标记检测细胞增殖、采用碘化丙啶染色进行活/死细胞活力检测，以及通过延时数字成像分析细胞行为。在此HCS基础上，还可对从各个孔中收集的条件培养基样本进行ELISA检测，以定量测定神经营养因子的分泌水平。不同MSC亚型的条件培养基也可用于体外（in vitro）生物活性检测，以评估分泌因子的生物学功能11,23。此类HCS平台还可用于检测原代神经元培养物及神经干细胞系的体外（in vitro）神经突生长情况24。总体而言，我们的结果表明，经基因修饰的MSC亚群在行为表现上与未经修饰的MSC相似。不同MSC亚型之间，以及不同培养基质之间，对细胞生长和迁移的影响并无显著差异。因此，所测试的细胞外基质基质似乎并未在调控这些工程化MSC细胞行为方面发挥关键作用。
本研究展示了利用高内涵筛选（HCS）系统分析细胞行为不同方面的应用。然而，在图像分析过程中遇到某些局限性也是常见现象。在分析荧光图像时，有时难以确定准确的阈值，即免疫标记或染色细胞被判定为阳性标记/染色的最低信号强度。因此，为尽量减少主观偏差，阈值的设定依赖于与对照组的比较（在所有处理过程中，均平行设置荧光成像的阴性对照，即省略一抗或二抗）。另一个局限性出现在利用延时数字成像分析细胞迁移时。在某些情况下，成像软件无法区分细胞的随机布朗运动与实际发生的极短距离迁移。当多个细胞彼此非常接近时，分析软件难以识别其为多个独立细胞，这一问题也较为明显。为克服此局限性，在分析过程中需采用手动选择细胞的方式，而非完全自动化的分析。细胞接种密度也可能导致数据分析偏差，例如倾向于成簇生长的细胞群体与倾向于孤立生长的细胞群体之间的迁移数据差异。这类差异部分可能反映了细胞对细胞-基质相互作用与细胞-细胞相互作用的不同偏好性。
使用高内涵筛选（HCS）系统获取图像并进行数据分析，可高效快速地评估多种细胞参数。此外，在环境培养箱中，常规采集了30种不同条件（6种基质和5种不同的间充质干细胞亚型）下的延时数字视频，时间跨度从数小时至数天（最长48小时）。随后利用这些数据计算并确定不同细胞系在各种细胞外基质分子上的细胞迁移速率差异。
在本报告中，我们重点介绍了一种高内涵筛选平台的实施，用于评估细胞健康与功能。此类分析有助于合理设计细胞类型以及聚合物基底，以促进定向细胞生长和神经再生。这是在采用细胞移植策略进行广泛的体内临床前研究之前，实现基于干细胞的治疗因子递送的关键步骤。

在治疗神经系统疾病方面，实施有效疗法的一个主要难题在于开发出既能防止进一步退化又能促进功能恢复的有效方法。一种创新的策略是通过基因工程改造干细胞 离体，以产生神经保护因子，然后再进行移植。这种细胞治疗与基因治疗相结合的方法，为治疗神经系统中由疾病或损伤引起的神经元死亡提供了一种强有力的手段。
神经营养因子对于发育中神经元的生长和存活以及成熟神经元的维持和可塑性至关重要。大量研究已证明，神经营养因子在促进中枢和周围神经系统（CNS 和 PNS）中神经元的初始生长和分化方面具有重要作用，并且还能在体外以及神经损伤的动物模型中刺激再生in vitro和在神经损伤的动物模型中1。脑源性神经营养因子（BDNF）在中枢神经系统中高表达，在调控神经发育、突触可塑性和修复过程中发挥重要作用2。胶质细胞系源性神经营养因子（GDNF）可促进多种类型神经元的存活，包括多巴胺能神经元和运动神经元3。因此，一种重要的神经修复策略是向神经系统受损或病变区域提供外源性的神经营养因子。
多能骨髓来源的间充质干细胞（MSCs）在向受损或病变的神经系统递送治疗性蛋白方面具有巨大潜力。由于MSCs具有多种优势，其移植在开发患者兼容的细胞治疗策略中已受到广泛关注，这些优势包括：1）分离和培养相对简便；2）具有多向分化潜能；3）伦理问题较少；4）移植后能够存活并迁移；以及5）具备自体移植的潜力4,5。在多种神经退行性疾病的动物模型中，使用未经修饰的和基因工程改造的MSCs已报道出令人鼓舞的结果，包括脊髓损伤6,7、脑卒中8,9、髓鞘缺乏10以及视网膜变性11-13。将细胞移植与基因工程干细胞递送神经营养因子相结合，是一种新颖且重要的神经修复策略。
开发基于细胞的治疗因子递送系统时，一个关键步骤是确定工程化细胞的正常健康状况。因此，本研究的主要目的是评估基因工程成体干细胞的一般生长参数。一种快速评估多个细胞参数的重要方法是采用基于细胞成像的高通量筛选（HTS），通常称为高内涵筛选（HCS）技术14。该技术可实现自动化的图像采集与分析，特别适用于干细胞研究的应用。在本项目中，我们建立了一个分析平台，利用高内涵筛选系统对基因工程成体干细胞的细胞基质偏好性和细胞功能进行快速表征与优化。

<table><tbody><tr><td>96 孔板</td><td>Greiner Bio One</td><td>655090</td><td>用于 ImageXpress 的 96 孔板</td></tr><tr><td>牛血清白蛋白 (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)</td><td>A9647</td><td></td></tr><tr><td>兔抗 Ki67 抗体</td><td>Abcam (Cambridge, MA)</td><td>Ab16667</td><td>1:200 稀释</td></tr><tr><td>I 型胶原蛋白</td><td>Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)</td><td>C7661</td><td>来自大鼠尾部的胶原蛋白</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen (Carlsbad, CA)</td><td>D3571</td><td></td></tr><tr><td>驴抗兔 Cy3</td><td>Jackson Immuno Res Lab (West Grove, PA)&amp;nbsp;</td><td>711-165-152</td><td>1:500 稀释</td></tr><tr><td>ECL（层粘连蛋白-胶原蛋白-巢蛋白）</td><td>Millipore/Chemicon (Temecula, CA)</td><td>08-110</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清 (FBS)</td><td>Hyclone (Logan, UT)</td><td>SH30071.03</td><td></td></tr><tr><td>马血清</td><td>Hyclone (Logan, UT)</td><td>SH3007403</td><td></td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Chemistry Store (Ames, IA)</td><td>12003510</td><td>100%，200 证明</td></tr><tr><td>纤连蛋白</td><td>Fisher Scientific (Hampton, NH)</td><td>CB-40008</td><td></td></tr><tr><td>Iscove&amp;rsquo;s 改良杜尔贝科培养基 (IMDM)</td><td>Hyclone (Logan, UT)</td><td>SH30396.03</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Scientific (Hampton, NH)</td><td>P285</td><td>用于 PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; 缓冲液</td></tr><tr><td>K&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Scientific (Hampton, NH)</td><td>P288</td><td>用于 PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; 缓冲液</td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>Gibco/Invitrogen (Grand Island, NY)</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>小鼠层粘连蛋白（小鼠来源）</td><td>Trevigen (Gaithersburg, MD)</td><td>3400-010-01</td><td></td></tr><tr><td>成年 C57BL/6 小鼠的骨髓间充质干细胞 (MSCs)</td><td>Tulane 基因治疗中心 (New Orleans, LA)</td><td></td><td>从骨髓中分离获得</td></tr><tr><td>基因修饰的间充质干细胞 (GFP, BDNF, GDNF, BDNF/GDNF)</td><td>这些细胞来自我们之前的研究：Ye 等（待发表）</td><td></td><td></td></tr><tr><td>正常驴血清 (NDS)</td><td>Jackson Immuno Res Lab (West Grove, PA)&amp;nbsp;</td><td>017-000-121</td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛 (PFA)</td><td>Fisher Scientific (Hampton, NH)</td><td>O4042</td><td>0.1 M PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; 缓冲液中的 4% PFA</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)</td><td>P0781</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液 (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>聚-L-赖氨酸</td><td>Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)</td><td>P4707</td><td></td></tr><tr><td>碘化丙啶 (PI)</td><td>Invitrogen (Carlsbad, CA)</td><td>P1304MP</td><td></td></tr><tr><td>吐温 X-100</td><td>Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>0.05% 胰蛋白酶 (EDTA 1x)</td><td>Invitrogen (Carlsbad, CA)</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Iscove 改良杜尔贝科培养基</td><td>Invitrogen (Carlsbad, CA)</td><td>12440&amp;ndash;046</td><td></td></tr><tr><td>杂交瘤专用 FBS</td><td>Hyclone (Logan, UT)</td><td>SH30396.03</td><td></td></tr><tr><td>马血清</td><td>Hyclone (Logan, UT)</td><td>SH3007403</td><td></td></tr><tr><td>ImageXpress Micro</td><td>Molecular Devices (Sunnyvale, CA)</td><td>ImageXpress micro</td><td>高内涵筛选系统</td></tr><tr><td>MetaXpress 4.0</td><td>Molecular Devices (Sunnyvale, CA)</td><td>MetaXpress 4.0</td><td>图像采集与分析软件</td></tr></tbody></table>

用于神经保护策略中治疗因子递送的成体干细胞工程化高通量表征

High Throughput Characterization of Adult Stem Cells Engineered for Delivery of Therapeutic Factors for Neuroprotective Strategies

骨髓来源的间充质干细胞（MSCs）是一种强大的细胞资源，已被众多研究用作开发多种疾病治疗策略的潜在候选细胞。本研究的目的是开发并表征经过基因工程改造、可递送治疗因子的MSCs，作为保护受损或病变神经系统的神经保护策略的一部分。在本研究中，我们使用了经慢病毒载体进行基因修饰的小鼠MSCs，该载体编码脑源性神经营养因子（BDNF）或胶质细胞源性神经营养因子（GDNF），同时编码绿色荧光蛋白（GFP）。
在继续进行之前 体内 移植研究中，表征经基因改造的细胞至关重要，以确定基因修饰是否改变了细胞正常行为的某些方面。本研究考察了不同培养基质对四种基因工程间充质干细胞亚群的细胞黏附、增殖、存活及迁移能力的支持作用。进行了高内涵筛选（HCS），并进行了图像分析。 
所检测的基质包括：聚-L-赖氨酸、纤连蛋白、I型胶原、层粘连蛋白、 entactin-collagen IV-laminin（ECL）。采用Ki67免疫标记法检测细胞增殖，使用碘化丙啶染色法检测细胞活力。使用高内涵筛选系统上的透射光/环境培养箱系统进行活细胞延时成像。
我们的结果表明，经基因修饰的MSC不同亚群表现出相似的行为，且总体上与原始的未修饰MSC具有可比性。在不同MSC亚型以及培养基质之间，不同培养基质对细胞生长和细胞迁移的影响并无显著差异。
本研究提供了一种实验策略，可在工程化干细胞应用于长期研究之前，快速表征这些细胞及其行为 体内 用于神经系统挽救与修复的移植研究

通过在不同基质上培养不同群体的间充质干细胞（MSCs），检测了MSC的生长参数。如图1所示，将五种不同类型的MSC亚群（MSCs、GFP-MSCs、BDNF-GFP-MSCs、GDNF-GFP-MSCs和BDNF/GDNF-GFP-MSCs）接种至预先包被不同基质的96孔组织培养板中。培养四天后，固定培养板，并使用适当的试剂进行免疫标记和/或染色，随后利用高内涵筛选（HCS）系统进行观察，并通过图像采集与分析软件程序进行数据分析。
<img alt="细胞培养实验设置示意图，多孔板具有不同涂层和细胞类型。" src="/files/ftp_upload/52242/52242fig1highres.jpg" width="650" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 1"> 
图 1：实验设计用 96 孔板模板。 如模板所示，96 孔板用不同基质包被，并接种工程化干细胞。作为示例，本实验仅使用了 B 至 F 行的孔；A、G 和 H 行保持空白。缩写 – MSCs：间充质干细胞；GFP-MSCs：表达绿色荧光蛋白的间充质干细胞；BDNF-GFP-MSCs：表达脑源性神经营养因子-绿色荧光蛋白的间充质干细胞；GDNF-GFP-MSCs：表达胶质细胞源性神经营养因子-绿色荧光蛋白的间充质干细胞；BDNF/GDNF-GFP-MSCs：同时表达 BDNF 和 GDNF-绿色荧光蛋白的间充质干细胞；ECL：层粘连蛋白-IV型胶原-连蛋白复合物（Entactin-Collagen IV-Laminin）。
采用抗Ki67免疫标记结合DAPI复染的方法，评估不同基质是否影响各类型基因工程间充质干细胞（MSCs）的增殖能力（图2A）。Ki67抗原的表达主要出现在细胞周期的晚G1期、S期、G2期和M期，而在静止期（G0）细胞中不可检测，因此可作为细胞增殖的有效标志物15。4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）是一种常用的细胞核和染色体复染剂，与DNA的AT富集区结合后可发出蓝色荧光16。通过计数DAPI染色的细胞核数量，可确定视野中的细胞总数。如图2B所示，尽管不同MSC亚型中增殖细胞的比例存在差异，但所有基质均能支持各亚型MSC的显著增殖。
<img alt="Fluorescent microscopy, Ki67-labeled MSCs, bar chart comparison of cell substrate interactions." src="/files/ftp_upload/52242/52242fig2highres.jpg" width="700" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 2"> 
图2：Ki67细胞增殖检测。(A) Ki67免疫标记（红色）与DAPI（蓝色）核染色的融合双荧光图像。许多间充质干细胞被Ki67抗体（红色）标记。比例尺 = 50 µm. (B) 条形图显示在聚苯乙烯（PS）、聚-L-赖氨酸（PLL）、纤连蛋白、I型胶原、层粘连蛋白或内联蛋白-IV型胶原-层粘连蛋白（ECL）基质上培养5天的Ki67免疫标记MSC亚型所占百分比 体外 （体外培养天数）。N = 一次实验。每根柱代表每种条件下来自2个孔中8个成像位点的平均汇总数据。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52242/52242fig2highres.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
采用碘化丙啶（PI）染色法评估不同基质是否影响细胞存活（图3）。碘化丙啶是一种常用的红色荧光细胞核和染色体复染剂。由于碘化丙啶不能穿透细胞膜，通常被活细胞排斥，因此可用于检测群体中的死细胞。当与DAPI等通用细胞核标记物联合使用时，可识别视野内所有细胞，从而确定特定条件下死细胞所占比例。在所有检测的基质上，PI阳性细胞的比例均较低（图3）。为验证PI试剂的有效性，将部分含有MSCs的孔板在70%乙醇中孵育作为阳性对照（已知该条件可杀死大多数细胞），结果显示PI标记细胞比例显著升高，如图3B和3C所示（乙醇处理的阳性对照）。
<img alt="细胞染色分析：荧光显微镜图像（A, B）及PI染色的MSCs三维图表。" src="/files/ftp_upload/52242/52242fig3highres.jpg" width="700" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图3"> 
图3：碘化丙啶细胞死亡检测。（A）碘化丙啶（红色）与DAPI（蓝色）染色的融合双荧光图像。尽管所有活细胞的细胞核均被DAPI（蓝色）染色，但在间充质干细胞（MSCs）中未检测到碘化丙啶染色。（B）经70%乙醇处理后，几乎所有MSCs均被碘化丙啶染色。A和B中的比例尺 = 100 µm。（C）柱状图显示体外培养5天（DIV）的MSC亚型在聚苯乙烯（PS）、聚-L-赖氨酸（PLL）、纤维连接蛋白、I型胶原、层粘连蛋白或ECL（entactin-collagen IV-laminin）基质上的PI染色百分比。乙醇对照：该条件作为PI染色试剂的阳性对照。经乙醇处理后接受PI染色的大多数细胞已死亡，因此对PI试剂呈阳性染色。N = 1次实验。每根柱代表每种条件下2个孔中8个成像位点的合并数据平均值。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52242/52242fig3highres.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
为了研究不同基质对基因工程改造的间充质干细胞（MSCs）行为的可能影响，采用延时数字显微镜结合HCS系统上的透射光/环境培养箱系统分析细胞迁移（参见补充视频1）。对每个孔中的多个位点进行延时成像，并利用图像采集与分析软件，计算在不同基质上生长的MSC各亚群的细胞迁移速率。总体而言，如图4C所示，所有MSC亚型在细胞外基质包被的表面（纤连蛋白、胶原蛋白、层粘连蛋白和ECL）上迁移速度最快，而在未包被的聚苯乙烯表面上迁移最慢。
<img alt="Cell migration analysis; live-cell microscopy; 3D bar chart; MSCs migration rate on substrates comparison." src="/files/ftp_upload/52242/52242fig4highres.jpg" width="700" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 4"> 
图4：细胞示踪与迁移 使用图像采集与分析软件追踪MSCs。透射光与荧光图像的叠加图像 (A) 延时成像的开始 (B) 29 小时后，在延时成像实验结束时（参见 补充视频 1）。细胞迁移轨迹由彩色线条标示。比例尺： 50 µm. (C) 柱状图显示平均迁移速率（以 µm/hr在聚苯乙烯（PS）、聚-L-赖氨酸（PLL）、纤连蛋白、I型胶原、层粘连蛋白或 entactin-collagen IV-laminin（ECL）基质上培养2天的MSC亚型 体外 （体外培养天数）。N = 一次实验。每组条件下每个时间点的数据来自2个孔中至少10个成像细胞的平均值。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52242/52242fig4highres.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
综上所述，这些结果初步表明，这些基因工程改造的间充质干细胞亚群具有相似的生长特性。这些结果提供了有力证据，表明通过慢病毒介导的遗传修饰对这些间充质干细胞进行改造后，在本筛选平台上所检测的生长参数中未引起明显可察觉的有害影响。
补充视频 1。 使用图像采集与分析软件程序对间充质干细胞（MSC）进行追踪的延时数字视频。图中展示了两个间充质干细胞的迁移路径［分别标记为 1（绿色追踪线）和 2（蓝色追踪线）］。视频记录时长为 29 小时，每 5 分钟采集一次图像。制备该视频时采用表达绿色荧光蛋白（GFP）的间充质干细胞的荧光图像进行延时成像。标尺 = 50 µm。此类分析可用于研究细胞行为，包括细胞迁移和细胞分裂。

本研究描述了一个实验平台，可用于在工程化干细胞应用于长期研究之前，快速表征这些细胞及其行为 体内 用于神经系统挽救与修复的移植研究

骨髓来源的间充质干细胞（MSCs）是一种强大的细胞资源，已在众多研究中被用作潜在的候选细胞以……

本实验的总体目标是利用高内涵筛选（HCS）系统快速表征基因工程改造的干细胞。首先设计并准备96孔板的实验，随后接种不同群体的基因工程干细胞。接着，准备高内涵筛选系统以进行活细胞成像，然后启动指定时间范围内的延时成像。完成延时成像后，将培养板进行细胞染色处理，例如碘化丙啶染色以检测细胞死亡，或KI 67免疫标记以表征细胞增殖。最后，将96孔板重新装入高内涵筛选系统，进行荧光成像和图像采集。最终，利用图像分析软件对数据进行分析，以确定不同的细胞生长参数。该方法有助于解决干细胞生物学领域中的关键问题，例如鉴定和表征能够促进干细胞分化的因子。由于在将细胞用于体内之前明确其细胞类型至关重要，该技术的应用前景可延伸至基于细胞的治疗策略。该方法可为细胞行为提供深入见解，并可应用于几乎所有在培养条件下生长良好的其他细胞类型。此外，这些方法还可应用于完整的生物体，例如斑马鱼幼体。首先，在无菌培养罩内，按照图示创建一个96孔板的布局图，标明将要检测的不同底物和细胞类型。准备一个配备不同底物和96孔板的工作站。根据图谱，向每个孔中加入 100 µL 底物溶液。然后使用一条 perfil 封板条密封盖子，并在 4°C 下过夜孵育。在按照文本方案分离小鼠间充质干细胞并用慢病毒载体感染后，从 96 孔板中移除底物溶液，使用约 200 µL 无菌 PBS 洗涤孔两次。最后一次清洗后，移除 PBS，每孔加入 200 µL 细胞培养基，并将板置于 37°C、5% CO₂ 的细胞培养孵箱中平衡。在此期间，在无菌条件下，首先将培养基从培养瓶中收集至15毫升锥形管中，此时该培养基称为条件培养基。然后向培养瓶中加入8毫升无菌PBS，轻轻晃动后吸去缓冲液。为使细胞从培养瓶壁脱离，加入1毫升0.05%胰蛋白酶和0.01%EDTA溶液。待细胞脱落后，加入8毫升条件培养基，混匀后收集细胞悬液，并将细胞重悬后以每孔约300个细胞的密度重新接种。根据文本方案，将培养板孵育两小时，以使间充质干细胞（MSCs）贴附于基质上；在细胞孵育的同时，启动高内涵筛选（HCS）系统，并等待两小时使其达到平衡。将环境控制器设置为37摄氏度，并小心打开向HCS系统环境室供气的混合气瓶（其中含有5%二氧化碳的空气），以提供持续的气源。接下来，在两小时的孵育期结束后，将96孔板从孵箱中取出，并直接放入HCS系统的环境培养室中。待孔板平衡30分钟后，启动软件以配置孔板设置。根据文本方案设定成像参数后，使用激光自动对焦功能对焦至孔底，并从多个位点和多个孔中采集测试图像，以确定最佳的焦平面。确定焦点后，对所有60个孔每5分钟拍摄一次图像，持续48小时。实验结束时，在无菌条件下将96孔板从高内涵筛选系统（HCS）中取出，收集每个孔中的条件培养基样品，并转移至新的96孔板中。这些样品后续可用于ELISA，以进行KI-67细胞增殖检测。使用 0.1 摩尔磷酸盐缓冲液冲洗细胞培养物 1 分钟。重复洗涤一次后，在室温下使用 4% 多聚甲醛（PFA）固定培养物 20 分钟。固定完成后，去除 PFA，并用 PBS 每次 7 分钟，共冲洗 3 次。根据文本方案封闭细胞后，向每个孔中加入100微升一抗溶液。用封板膜覆盖培养板，并在4摄氏度下孵育过夜。随后将细胞洗涤三次，每次七分钟。每次洗涤后加入二抗。将细胞置于避光环境中，室温孵育90分钟，然后再进行三次洗涤。用封板膜封好后，于4摄氏度保存，直至成像。 为进行自动成像，将免疫标记的培养板装入高内涵筛选（HCS）系统，并让培养板平衡20分钟。打开HCS系统的图像采集与分析软件。选择使用10倍物镜的采集参数，相机增益设为1，增益设置为2。使用自动曝光功能确定细胞所在的 Z 平面，并计算本实验中各目标波长的偏移量。采集 DAP、EGFP 和 S3 的图像。选择阴性对照孔无信号时的最大强度水平进行图像采集，阳性孔使用相同的阈值设置。最后，采集图像并将其保存至数据库，然后进行图像分析。根据文本方案，如图所示，将五种不同亚群的间充质干细胞（MSC）接种到预先用不同基质包被的96孔组织培养板中。本实验使用抗KI67抗体标记以鉴定增殖细胞，同时使用DAPI染色，以评估不同基质是否影响各工程化MSC亚群的增殖能力。如图所示，尽管不同MSC亚群中增殖细胞的比例存在差异，但所有基质均能支持每种MSC亚型的显著增殖。该图显示，在所有检测的基质上，经碘化丙啶（PI）染色呈阳性的细胞比例（用于识别群体中的死亡细胞）均较低；而经70%乙醇处理的细胞（可杀死大多数细胞）表现出高水平的PI标记，作为阳性对照，用于研究MSC在不同基质上的行为。使用延时数字显微镜分析了细胞在29小时内的迁移情况。细胞一和细胞二的迁移路径分别用绿色和蓝色线条标出。如图所示，所有间充质干细胞亚型在包被了细胞外基质的表面迁移速度最快，而在未包被的聚苯乙烯表面迁移最慢。在进行该实验操作时，重要的是要牢记需仔细规划并设计适用于多孔板格式（例如96孔板）的实验方案。此外，在工程化干细胞构建完成后，还可对条件培养基采用其他方法（如ELISA法）进行检测，以进一步探究这些细胞产生和分泌治疗因子的相关问题。高内涵筛选技术的发展，为干细胞生物学和药物发现领域的研究人员探索复杂的生物系统提供了高通量的研究途径。

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科研

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医学

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我们描述了一种将人皮肤来源的成纤维细胞重编程为诱导性神经前体细胞（iNPCs），并进一步将其分化为诱导性星形胶质细胞（iAs）的实验方案。该方法可快速、可重复地大量生成iNPCs和iAs。...

利用成纤维细胞直接转化为神经祖细胞并分化为星形胶质细胞的体外神经疾病建模

本文介绍了一种核转染系统，旨在提高从成年小鼠脑室下区分离获得的扩增神经干细胞（NSCs）的基因递送效率。研究结果表明，该方法显著改善了神经干细胞的基因调控效果，优于传统转染方案，并提高了细胞存活率。...

从小鼠成年脑室下区分离、扩增及核转染神经干细胞

本文介绍了一种工程化化学重编程干细胞的方案，通过将这些细胞分化为多巴胺能前体细胞，移植到帕金森病小鼠模型中，并评估其行为学和电生理学结果，以验证移植细胞的成功整合及其功能有效性。...

化学遗传学调控重编程干细胞来源的前体细胞在治疗神经退行性疾病中的应用

了解如何利用高内涵筛选系统对小鼠间充质干细胞进行高通量表征，通过活细胞成像和免疫标记分析细胞增殖与死亡，为神经保护治疗策略提供可靠的细胞行为数据。

用于神经保护策略中治疗因子递送的成体干细胞工程化高通量表征

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