用于神经保护策略中治疗因子递送的成体干细胞工程化高通量表征

本实验的总体目标是利用高内涵筛选（HCS）系统快速表征基因工程改造的干细胞。首先设计并准备96孔板的实验，随后接种不同群体的基因工程干细胞。接着，准备高内涵筛选系统以进行活细胞成像，然后启动指定时间范围内的延时成像。

完成延时成像后，将培养板进行细胞染色处理，例如碘化丙啶染色以检测细胞死亡，或KI 67免疫标记以表征细胞增殖。最后，将96孔板重新装入高内涵筛选系统，进行荧光成像和图像采集。最终，利用图像分析软件对数据进行分析，以确定不同的细胞生长参数。

该方法有助于解决干细胞生物学领域中的关键问题，例如鉴定和表征能够促进干细胞分化的因子。由于在将细胞用于体内之前明确其细胞类型至关重要，该技术的应用前景可延伸至基于细胞的治疗策略。该方法可为细胞行为提供深入见解，并可应用于几乎所有在培养条件下生长良好的其他细胞类型。

此外，这些方法还可应用于完整的生物体，例如斑马鱼幼体。首先，在无菌培养罩内，按照图示创建一个96孔板的布局图，标明将要检测的不同底物和细胞类型。准备一个配备不同底物和96孔板的工作站。

根据图谱，向每个孔中加入 100 µL 底物溶液。然后使用一条 perfil 封板条密封盖子，并在 4°C 下过夜孵育。在按照文本方案分离小鼠间充质干细胞并用慢病毒载体感染后，从 96 孔板中移除底物溶液，使用约 200 µL 无菌 PBS 洗涤孔两次。最后一次清洗后，移除 PBS，每孔加入 200 µL 细胞培养基，并将板置于 37°C、5% CO₂ 的细胞培养孵箱中平衡。

在此期间，在无菌条件下，首先将培养基从培养瓶中收集至15毫升锥形管中，此时该培养基称为条件培养基。然后向培养瓶中加入8毫升无菌PBS，轻轻晃动后吸去缓冲液。为使细胞从培养瓶壁脱离，加入1毫升0.05%胰蛋白酶和0.01%EDTA溶液。待细胞脱落后，加入8毫升条件培养基，混匀后收集细胞悬液，并将细胞重悬后以每孔约300个细胞的密度重新接种。

根据文本方案，将培养板孵育两小时，以使间充质干细胞（MSCs）贴附于基质上；在细胞孵育的同时，启动高内涵筛选（HCS）系统，并等待两小时使其达到平衡。将环境控制器设置为37摄氏度，并小心打开向HCS系统环境室供气的混合气瓶（其中含有5%二氧化碳的空气），以提供持续的气源。

接下来，在两小时的孵育期结束后，将96孔板从孵箱中取出，并直接放入HCS系统的环境培养室中。待孔板平衡30分钟后，启动软件以配置孔板设置。根据文本方案设定成像参数后，使用激光自动对焦功能对焦至孔底，并从多个位点和多个孔中采集测试图像，以确定最佳的焦平面。

确定焦点后，对所有60个孔每5分钟拍摄一次图像，持续48小时。实验结束时，在无菌条件下将96孔板从高内涵筛选系统（HCS）中取出，收集每个孔中的条件培养基样品，并转移至新的96孔板中。这些样品后续可用于ELISA，以进行KI-67细胞增殖检测。

使用 0.1 摩尔磷酸盐缓冲液冲洗细胞培养物 1 分钟。重复洗涤一次后，在室温下使用 4% 多聚甲醛（PFA）固定培养物 20 分钟。固定完成后，去除 PFA，并用 PBS 每次 7 分钟，共冲洗 3 次。

根据文本方案封闭细胞后，向每个孔中加入100微升一抗溶液。用封板膜覆盖培养板，并在4摄氏度下孵育过夜。随后将细胞洗涤三次，每次七分钟。

每次洗涤后加入二抗。将细胞置于避光环境中，室温孵育90分钟，然后再进行三次洗涤。用封板膜封好后，于4摄氏度保存，直至成像。

为进行自动成像，将免疫标记的培养板装入高内涵筛选（HCS）系统，并让培养板平衡20分钟。打开HCS系统的图像采集与分析软件。选择使用10倍物镜的采集参数，相机增益设为1，增益设置为2。

使用自动曝光功能确定细胞所在的 Z 平面，并计算本实验中各目标波长的偏移量。采集 DAP、EGFP 和 S3 的图像。选择阴性对照孔无信号时的最大强度水平进行图像采集，阳性孔使用相同的阈值设置。

最后，采集图像并将其保存至数据库，然后进行图像分析。根据文本方案，如图所示，将五种不同亚群的间充质干细胞（MSC）接种到预先用不同基质包被的96孔组织培养板中。本实验使用抗KI67抗体标记以鉴定增殖细胞，同时使用DAPI染色，以评估不同基质是否影响各工程化MSC亚群的增殖能力。如图所示，尽管不同MSC亚群中增殖细胞的比例存在差异，但所有基质均能支持每种MSC亚型的显著增殖。该图显示，在所有检测的基质上，经碘化丙啶（PI）染色呈阳性的细胞比例（用于识别群体中的死亡细胞）均较低；而经70%乙醇处理的细胞（可杀死大多数细胞）表现出高水平的PI标记，作为阳性对照，用于研究MSC在不同基质上的行为。

使用延时数字显微镜分析了细胞在29小时内的迁移情况。细胞一和细胞二的迁移路径分别用绿色和蓝色线条标出。如图所示，所有间充质干细胞亚型在包被了细胞外基质的表面迁移速度最快，而在未包被的聚苯乙烯表面迁移最慢。

在进行该实验操作时，重要的是要牢记需仔细规划并设计适用于多孔板格式（例如96孔板）的实验方案。此外，在工程化干细胞构建完成后，还可对条件培养基采用其他方法（如ELISA法）进行检测，以进一步探究这些细胞产生和分泌治疗因子的相关问题。高内涵筛选技术的发展，为干细胞生物学和药物发现领域的研究人员探索复杂的生物系统提供了高通量的研究途径。