微创大鼠视神经注射技术

本操作的总体目标是提供一种微创方法，用于向活体大鼠的视神经注射药物或干细胞。首先将大鼠麻醉，将其固定在解剖台上，并在结膜处插入缝线以操控眼球。随后，第二步是解剖眼球后方的眶嵴，以暴露视神经。

接下来，将玻璃移液管插入视神经，注射药物或干细胞后，关闭手术部位并使大鼠从麻醉中复苏。最终，在经过一定时间后，处死大鼠，解剖视神经，通过显微镜观察手术注射或移植的效果。该技术相较于现有方法的主要优势在于其微创性，能够使大鼠存活所需的时间长度。

研究外科注射或移植的效果。演示该操作的是来自我实验室的学生技术员 Kate Schwartz。所有外科手术均须在 2% 至 3% 异氟烷麻醉下进行。

通过脚趾夹捏和呼吸频率确认麻醉程度是否适当。检查大鼠对脚趾夹捏无退缩反应。必要时固定动物，以避免操作过程中头部移动。

然后在手术眼处滴一滴利多卡因。麻醉期间每10分钟使用一次人工泪液，以防止眼睛干燥。术前皮下注射布托啡诺，剂量为0.01毫克/千克，之后根据需要每六至八小时注射一次。

使用加热垫保持动物温暖。用酒精润湿头皮毛发，注意避免接触眼睛。

务必使用无菌器械并采用无菌技术，以最大限度降低术后感染风险。接下来，在外侧结膜处放置4-0缝线，并用足够长度的缝线打结，以便进行轻柔牵引。在眶嵴上方的皮肤处做一个约2.5厘米长的切口。

使用10号手术刀。牵开皮肤及下方筋膜，并仔细分离筋膜组织。在牵开的皮肤上缝合一针，以暴露眶上囊，防止术区出血过多。

解剖筋膜时应避免损伤血管。轻柔牵拉结膜，将眼球向下并拉出眼眶，即可显露上眼眶肌。为暴露视神经，需去除眶后脂肪，并切断该肌肉。

脂肪组织可以弃去，注射后不应再替换。至此，视神经筋膜应可见，表现为视神经本体束及其周围包裹着硬脑膜的血管。为了进行更深层的解剖，可使用手术刀或31号斜面针头在DRA上做一小切口，以减少穿刺时的创伤；同时应预先准备好拉制的玻璃微细移液管，其直径为50至100微米，以提供操作稳定性。

将微量移液器安装在显微操作仪上，并连接一个 20 cc 的塑料注射器。用 1 cc 注射器和 30 号针头，将重悬于 0.5 至 1 微升液体中的微珠或干细胞逆行吸入微量移液器中，在玻璃移液器加载染料前后，分别吸入 0.5 微升的甲基蓝溶液。使用 1 cc 注射器和 30 号针头，将微量移液器的尖端缓慢下降至视神经表面，位置位于破损的硬脑膜上方。

将玻璃尖端轻微而迅速地插入视神经，同时对柱塞施加缓慢且恒定的压力，可将损伤降至最低。伊文思蓝染料应使注射部位的视神经显色。染料应局限在视神经内，不得渗漏至蛛网膜下腔。

通过追踪伊文思蓝染料的第二条带，确定干细胞注射是否完成。当所需体积的液体注入视神经后，松开注射器推杆。注射完成后，将微量移液器静置在视神经内五分钟，以防止撤出时因压力过高导致液体喷出。

移除用于止血的微量移液器及任何棉签。使用 3.0 丝线缝合皮肤，并拆除结膜缝线。将大鼠置于加热垫上保持温暖，直至其从麻醉状态中苏醒。

在动物恢复足够的意识以维持胸卧位之前，不得使其无人看管。若动物出现疼痛症状，包括过度嗜睡、共济失调或呼吸困难，应给予肌肉注射布托啡诺镇痛，每日最多三次。实验结束后，处死大鼠并用帕拉尔dehyde进行灌注。

视神经被小心地解剖并制备用于冰冻切片。此处显示的是大鼠完整视神经在低倍镜下的示例，其中注射了伊文思蓝染料。为便于观察注射部位，箭头标示了染料注射的精确位置。该解剖在注射后数天内完成，染料沿神经的扩散范围有限，表明其扩散程度受限。

该技术为再生神经学领域的研究人员探索再生视神经以及在此脱髓鞘疾病大鼠模型中恢复丧失视力的新方法铺平了道路。