Name: 从外周血人类同种异体抗原特异性T细胞的生成 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 47 s
Description: 学习从外周血生成人类同种异体抗原特异性T细胞克隆的方法，通过密度梯度离心、磁珠分选和流式细胞术实现单细胞分离与扩增。该技术适用于免疫学、移植生物学和细胞治疗研究。

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作者感谢美国国立卫生研究院（NIH）四聚体核心实验室提供的四聚体制备服务。作者还感谢加州大学圣地亚哥分校（UCSD）人类胚胎干细胞核心实验室流式细胞术实验室的 E.D. O’Connor 和 K.E. Marquez 在细胞分选方面的协助。本研究由美国国立卫生研究院资助项目 K08AI085039（G.P.M.）提供经费支持。

注意：本方案需要使用来自人类志愿者的外周血样本。所有涉及人类受试者的研究均应经过人体研究机构审查委员会的审查和批准，以确保符合《赫尔辛基宣言》（2013年）和1996年《健康保险可携性与责任法案》的要求。
1. 从全血中分离T细胞
<ol>
	<li>开始前，将密度梯度介质预热至室温。将4 ml密度梯度介质分装至2–4个无菌的15 ml锥形离心管中（每10 ml稀释血液使用1根离心管）。</li>
	<li>使用1–2根含喷雾涂层肝素钠的绿色头盖静脉采血管采集10–20 ml血液。在经过培训的人员监督下，按照经机构审查委员会批准的方案采集人源样本。</li>
	<li>用70%乙醇擦拭采血管外壁。小心打开装满血液的采血管盖，将血液倾倒入一个无菌的50 ml离心管中。</li>
	<li>向每根采血管中加入10 ml无菌磷酸盐缓冲液（PBS）。收集残留的PBS，加入已倾倒的全血中，并轻轻混匀。</li>
	<li>每2 ml总体积加入25 µl人T细胞富集混合液。室温孵育20分钟。</li>
	<li>使用10 ml移液器，将最多10 ml的1:1稀释血液轻柔地叠加在密度梯度介质上方。注意不要破坏密度梯度介质的表面。</li>
	<li>将叠加后的血液与密度梯度介质在20 oC条件下以1,200 × g离心20分钟&#160;。</li>
	<li>从离心机中取出离心管，注意不要扰动密度梯度介质与位于其界面处的白细胞层。使用5 ml移液器小心吸取白细胞层，并转移至新的无菌50 ml锥形管中。</li>
	<li>加入PBS使所收集的外周血单个核细胞（PBL）体积达到50 ml，并轻轻混匀。</li>
	<li>在20 oC条件下以600 × g离心5分钟&#160;，弃上清。</li>
	<li>将沉淀细胞重悬于10 ml无菌流式细胞分选缓冲液中（含1% BSA的无菌过滤PBS）。取10 µl细胞悬液，按1:10稀释（加入90 μl台盼蓝），使用血细胞计数板进行细胞计数（预期产量为每管全血1–4 × 106个细胞）。
	<ol>
		<li>取出1 ml分装样品，转移至5 ml离心管中，置于冰上，用于未被四聚体标记的T细胞分析。细胞悬液全程保持在冰上。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 同种抗原特异性T细胞的磁珠富集
<ol>
	<li>将同种异体抗原pMHC四聚体用无菌分选缓冲液按1:100稀释。</li>
	<li>将细胞悬液（来自步骤1.11的9 ml）在20 oC下以600 × g离心5分钟&#160;，弃上清。</li>
	<li>向沉淀细胞（最多107个细胞）中加入50 µl稀释后的同种异体抗原pMHC四聚体，轻轻吹打混匀。转移至无菌5 ml离心管中，在室温下孵育30分钟&#160;。</li>
	<li>加入2 ml分选缓冲液，在20 oC下以600 × g离心5分钟&#160;，弃上清。</li>
	<li>用100 µl分选缓冲液重悬细胞，加入10 µl生物素分选混合液，在室温下孵育15分钟&#160;。</li>
	<li>加入5 µl磁性纳米颗粒，在室温下孵育10分钟&#160;。</li>
	<li>加入2.5 ml分选缓冲液，轻轻吹打混匀。取出100 µl等分试样，转移至5 ml离心管中，置于冰上保存，用于富集前细胞的分析。</li>
	<li>将含有细胞悬液的5 ml离心管放入细胞分离磁架中，管盖应松松地盖在管口上，在室温下孵育5分钟&#160;。</li>
	<li>轻轻取下管盖，手持离心管与磁架一起，将管内液体倾入新的5 ml离心管中。不要敲击或摇晃离心管以去除最后几滴液体。</li>
	<li>将离心管从磁架上取下，加入2 ml冷的分选缓冲液，轻轻吹打混匀。取10 µl细胞悬液，加入10 µl台盼蓝进行1:2稀释，使用血细胞计数板进行细胞计数。</li>
</ol>
3. 单细胞流式细胞术分选T细胞的制备
<ol>
	<li>向所有细胞管（未标记四聚体、标记但未富集四聚体、标记且富集四聚体）中加入冷分选缓冲液，使体积达到 3 ml。</li>
	<li>在 4 oC 下以 600 × g 离心 5 分钟&#160;，弃去上清液以回收细胞。</li>
	<li>将沉淀细胞重悬于 25 µl 冷分选缓冲液中，加入 5 µl 人源 Fc 封闭剂，冰上孵育 20 分钟。</li>
	<li>准备用于流式细胞分选的抗体。混合 15 µl 分选缓冲液、15 µl 抗-CD5、15 µl 抗-CD14 和 15 µl 抗-CD19。</li>
	<li>向每管细胞中加入 20 µl 抗体混合物，冰上孵育 20 分钟。</li>
	<li>向每管中加入 2 ml 冷分选缓冲液。</li>
	<li>在 4&#160;oC 下以 600 × g 离心 5 分钟&#160;，弃去上清液以回收细胞。</li>
	<li>将细胞以 1–2 × 106 个细胞/ml 的浓度重悬于分选缓冲液中。</li>
	<li>将 100 µl 人 T 细胞培养基（Iscove’s DMEM，添加 2 mM Glutamax、10 mM HEPES、50 µg/ml 庆大霉素、50 µM 2-巯基乙醇、10% 热灭活人 AB 血清和 2.5 ng/ml 重组人 IL-2）分装至 96 孔圆底细胞培养板的每个孔中，置于冰上保存。</li>
</ol>
4. 通过单细胞流式细胞术分选分离四聚体标记的T细胞
<ol>
	<li>建立流式细胞术设门参数，以鉴定同种异体抗原-pMHC 四聚体标记的 T 细胞（图 2.A）。利用富集前的四聚体标记组分建立设门策略，以排除双联体，圈选淋巴细胞，排除表达 CD19 的 B 细胞和表达 CD14 的单核细胞，并通过 CD5 表达鉴定 T 细胞。使用未标记四聚体的样本作为荧光减一对照，以设定用于鉴定四聚体结合 T 细胞的设门标准（未标记四聚体样本中 CD5+CD14-CD19- 细胞的比例应为 0%，且不应落入该门内）。 
	注意：设门策略若不够严格，可能导致非 T 细胞或非抗原特异性 T 细胞被分离；而过于严格的设门策略则会减少分离得到的 T 细胞数量。</li>
	<li>设定单细胞分选的孔板参数。指令分选仪将 1 个 CD5+CD14-CD19-四聚体+ 细胞分选至每个孔中。每行孔板设置应包含 1 个阴性对照孔（无细胞分选入孔）和 1 个阳性对照孔（分选 100 个 CD5+CD14-CD19-四聚体- 细胞）（图 2.B）。</li>
	<li>根据已建立的流式细胞术设门策略和孔板设置，使用流式细胞分选仪将单个四聚体结合 T 细胞直接分选至 96 孔板中。</li>
</ol>
5. 同种抗原特异性T细胞克隆的培养与扩增
<ol>
	<li>细胞分选完成后，在 20 oC 下以 600 ×g 离心 5 分钟&#160;。将培养板置于 37 oC、6% CO2 培养箱中。</li>
	<li>涡旋刺激性抗 CD3/抗 CD28 微珠 30 秒&#160;以重悬微珠。</li>
	<li>计算刺激收集的 T 细胞所需的激活微珠体积（每孔 0.5 µl 激活微珠）。将计算好的微珠体积转移至无菌 5 ml 离心管中，加入 1 ml 人 T 细胞培养基并涡旋混匀。</li>
	<li>将含有微珠悬液的离心管置于磁铁上，管盖应松松地盖在管口。在室温下孵育 2 分钟&#160;。</li>
	<li>轻轻取下管盖。手持离心管和磁铁，将管内液体倾倒至新的 5 ml 离心管中。切勿敲击或摇晃管内液体。</li>
	<li>将离心管从磁铁上取下，加入人 T 细胞培养基（每最初加入的 0.5 µl 微珠对应加入 100 µl 培养基）。</li>
	<li>将 100 µl 激活微珠悬液分装至 96 孔板的每一孔中。将培养板置于 37 oC、6% CO2 培养箱中孵育。</li>
	<li>每日通过显微镜检查监测细胞生长情况。培养 5–7 天后可在显微镜下观察到少量增殖细胞形成的微小细胞簇（图 3.A）。 
	注意：此时 T 细胞培养物的观察可能较为困难，此阶段未观察到细胞簇并不一定表明 T 细胞未在生长。</li>
	<li>细胞分离后第 14 天，通过小心吸去每孔培养液上层 100 µl，并替换为 100 µl 新鲜人 T 细胞培养基进行换液。继续将培养板置于 37 oC、6% CO2 培养箱中孵育。</li>
	<li>每日通过显微镜检查及培养基颜色变化评估细胞生长情况。换液后 2–3 天可在显微镜下观察到较大的细胞簇。宏观上，细胞沉淀应在换液后 14 天内变得可见。</li>
	<li>细胞分离后第 28 天，通过显微镜检查鉴定生长良好的克隆。将生长阳性孔中的 200 µl 培养物转移至含有 200 µl 人 T 细胞培养基的 48 孔组织培养板的独立孔中。</li>
	<li>加入含 12.5 µl 刺激性抗 CD3/抗 CD28 微珠的 100 µl 溶液（按第 5.2–5.6 节所述方法制备）。将培养板置于 37 oC、6% CO2 培养箱中孵育。</li>
	<li>每日通过显微镜检查及培养基颜色变化监测培养物生长情况。当 T 细胞培养密度达到 &#62;2×106/ml（通常为再次刺激后 3–5 天，可根据培养基开始变为浅黄色的时间估算）时，将培养物转移至 24 孔组织培养板的一孔中，并加入 500 µl 人 T 细胞培养基。</li>
	<li>再次刺激后 10–14 天，收集 200 µl T 细胞培养物，通过流式细胞术分析 pMHC 四聚体结合情况（采用第 3 节和第 4.1 节所述的标记与设门策略）以评估其同种异体抗原特异性。</li>
</ol>
6. T细胞克隆的长期再刺激与培养
<ol>
	<li>可每14天定期重新刺激并扩增具有目标特异性的克隆T细胞培养物。在上一次抗CD3/CD28微珠刺激后的第14天，将T细胞培养物收集至无菌的5 ml离心管中。将同一T细胞克隆的多个孔合并至同一管中，体积最多达2.5 ml。</li>
	<li>加入培养基，使最终体积达到2.5 ml，并通过移液轻轻混匀。</li>
	<li>将含有T细胞培养物的5 ml离心管放入细胞分离磁铁中，以去除培养物中残留的旧微珠。管盖应松松地盖在管口上。室温孵育5分钟&#160;。</li>
	<li>轻轻取下管盖。保持离心管与磁铁一起，将细胞悬液倾倒至新的5 ml离心管中。不要敲击或摇晃管内容物以去除最后几滴液体。</li>
	<li>加入培养基，使最终体积达到4 ml。取10 µl样品，使用血细胞计数板进行细胞计数。</li>
	<li>在室温下以600 × g离心5分钟&#160;，回收T细胞。</li>
	<li>弃去上清液。将T细胞重悬于人T细胞培养基中，密度为106 个细胞/ml。将1 ml分装至24孔组织培养板的每孔中。</li>
	<li>通过加入含12.5 µl刺激性抗CD3/抗CD28微珠的100 µl培养基重新刺激T细胞（如第5.2–5.6节所述）。在37 oC、6% CO2培养箱中孵育。</li>
</ol>

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</ol>

作者声明不存在竞争性财务利益。

T细胞同种反应性是一种长期被研究且具有临床相关性的现象。T细胞对同种异体刺激产生的强烈增殖和效应反应，使得通过相对简单的混合淋巴细胞反应，对人外周血T细胞在体外（in vitro）的T细胞应答进行广泛分析成为可能。然而，这些初始的同种反应性T细胞应答是寡克隆性的，由大量针对特定同种抗原发生反应的单个T细胞组成。这种T细胞应答的多样性阻碍了对驱动同种反应性T细胞应答的pMHC配体识别生化机制的深入研究。解决这一难题的常规方法是通过反复使用特定的同种异体细胞系进行刺激，并结合有限稀释分析，从而建立克隆性T细胞系。尽管该方法能够产生具有单一特异性的克隆性T细胞系，但它可能无法真实反映初始幼稚T细胞寡克隆应答的原始组成。此外，该方法并不能直接鉴定出被识别的特异性pMHC同种抗原（即使将应答限定于单个HLA分子，仍需从稳态条件下呈递的约2×104种内源性肽段中确定刺激性肽段），这使得对同种反应性中T细胞配体识别的生化特征鉴定变得复杂。
本文所述方案利用荧光标记的pMHC多聚体、磁珠富集及流式细胞术分选，以鉴定并分离针对单个同种异体pMHC配体的特异性人...

T 淋巴细胞是适应性免疫系统的关键组成部分。T 细胞不仅通过多种效应机制直接介导针对病原体的保护性免疫应答，还主动维持免疫自身耐受，并调控免疫系统中其他细胞的应答。这些功能由多种整合信号所调控，包括 T 细胞受体（TCR）结合、细胞因子和趋化因子以及代谢物1。在这些信号中，TCR 尤为重要，因为它提供了定义 T 细胞在适应性免疫中作用的特征性特异性。TCR 以高度特异且敏感的方式与主要组织相容性复合体（MHC，人类同源物为 HLA）分子呈递的线性肽抗原（pMHC 复合物）相互作用，从而传递启动 T 细胞效应功能的信号。TCR 与 pMHC 配体相互作用的生化参数不仅决定了 T 细胞活化的特异性，还对后续 T 细胞功能产生定性影响2。因此，研究 T 细胞功能通常需要分析具有明确抗原特异性的克隆性 T 细胞的应答。
人类T细胞库包含约1012个αβ T细胞，估计具有107–108种不同的αβ T细胞受体（αβTCR）3-4。这种高度多样性使得T细胞能够识别大量潜在病原体来源的肽段，从而启动T细胞应答以实现保护性免疫。据估计，在未发生过针对特定抗原的免疫应答时，能够响应由自身MHC分子呈递的某一外来抗原的T细胞频率约为10-4–10-75。初始T细胞库通过胸腺选择过程形成，以确保其能够识别由自身MHC分子呈递的肽抗原，同时限制对自身肽抗原的反应性，从而最大化介导保护性免疫的潜力2。然而，与这一设计的反应特异性相违背的是，来自免疫学上初始状态个体的T细胞中，有相对较高的频率（10-3–10-4）会响应同种异体细胞的刺激，识别外来的MHC分子及其所呈递的内源性肽段6。对同种异体pMHC配体的识别在结构上类似于对自身MHC呈递的外来抗原的识别；T细胞受体（TCR）与同种异体MHC分子以及所呈递的肽段均发生关键的生化相互作用7。T细胞对同种异体刺激产生强烈反应的原因在于同种异体细胞表面存在多种多样的pMHC复合物8。据估计，每个MHC分子可呈递约2×104种不同的内源性肽抗原9。这种对同种异体刺激的广泛反应性是临床上重要病理过程的关键因素，例如同种异体移植物排斥反应或移植物抗宿主病（GVHD），这些均源于T细胞的同种异体反应性。
对人类T细胞同种异体反应的研究传统上依赖于在异基因细胞刺激后，检测初始T细胞的多克隆反应。通过使用同一种异基因细胞系进行反复刺激，并结合有限稀释分析，可获得对特定异基因HLA10具有明确识别能力的克隆性T细胞。然而，这种方法在研究针对单个异基因pMHC配体的反应时存在困难，因为特定异基因HLA分子所呈递的内源性pMHC复合物种类繁多且丰度较高，会激活广泛多样的T细胞群体。采用这种群体刺激结合有限稀释的方法，需要筛选大量克隆，才能分离出对单一pMHC配体具有特异性反应的T细胞。此外，在初始T细胞群体中，针对单个异基因pMHC配体发生反应的T细胞频率相对较低，这构成了高效生成针对特定抗原的人类T细胞克隆的主要障碍。
多克隆群体中抗原特异性T细胞的鉴定与分离得益于荧光标记的pMHC多聚体技术的发展11。该方法利用将特异性肽抗原加载至重组可溶性生物素化MHC分子中，并通过与链霉亲和素标记的荧光染料结合进行标记。pMHC的多聚化可提高结合亲和力，弥补TCR对可溶性pMHC配体本身固有的低亲和力（µM级）。标记的细胞可通过流式细胞术进行鉴定和分离。然而，该方法仍受限于初始T细胞群体中抗原特异性T细胞频率极低的问题，通常远低于大多数流式细胞仪准确鉴定与定量的检测下限。为克服这一局限，已开发出一种pMHC四聚体标记结合磁珠富集四聚体标记细胞的方法12。该方法已证明可稳定实现对低频抗原特异性T细胞的检测、计数与分离。
本方案描述了一种有效生成人T细胞克隆的方法，这些克隆特异性地响应单个同种异体pMHC配体。该方案采用pMHC（HLA）多聚体标记与富集技术，结合流式细胞术细胞分选，以及一种高效的方法，用于分离针对同种异体抗原的特异性人T细胞 体外 人T细胞培养以实现从单个分选细胞生成T细胞克隆（概述） 图1).

<table><tbody><tr><td>钠肝素静脉采血管 16 x 100 mm</td><td>Becton, Dickenson and Company</td><td>366480</td><td></td></tr><tr><td>Lymphoprep</td><td>Stemcell Technologies</td><td>7801</td><td></td></tr><tr><td>Rosette Sep 人T细胞富集试剂盒</td><td>Stemcell Technologies</td><td>15061</td><td></td></tr><tr><td>不含钙和镁的1×杜尔贝科磷酸盐缓冲液</td><td>康宁</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E6635</td><td></td></tr><tr><td>荧光标记的pMHC四聚体</td><td>NIH 四聚体中心</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>EasySep 生物素选择试剂盒</td><td>Stemcell Technologies</td><td>18553</td><td></td></tr><tr><td>EasySep 分选磁铁</td><td>Stemcell Technologies</td><td>18000</td><td></td></tr><tr><td>TruStain FcX 人 Fc 封闭液</td><td>Biolegend</td><td>422301</td><td></td></tr><tr><td>抗CD5 PE-Cy7（克隆UCHT2）</td><td>Biolegend</td><td>300621</td><td></td></tr><tr><td>抗CD14 FITC（克隆HCD14）</td><td>Biolegend</td><td>325603</td><td></td></tr><tr><td>抗CD19 FITC（克隆HIB19）</td><td>Biolegend</td><td>302205</td><td></td></tr><tr><td>Iscove's DMEM，不含b-ME和L-谷氨酰胺</td><td>康宁</td><td>15-016-CV</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>康宁</td><td>25-060-CI</td><td></td></tr><tr><td>β-巯基乙醇&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Life Technologies</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>硫酸庆大霉素（50 mg/ml）</td><td>Omega Scientific</td><td>GT-50</td><td></td></tr><tr><td>人AB型血清，男性供体</td><td>Omega Scientific</td><td>HS-30</td><td></td></tr><tr><td>重组人IL-2</td><td>Peprotech</td><td>AF 200-02</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads 人 T 细胞激活剂 CD3/CD28</td><td>Life Technologies</td><td>11131D</td><td></td></tr><tr><td>培养基</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>细胞分选缓冲液</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS，pH 7.4</td><td>1 L</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>10 g</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EDTA（0.5 M）</td><td>2 ml</td><td></td><td></td></tr><tr><td>人T细胞培养基</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Iscove's DMEM</td><td>351.6 ml</td><td></td><td></td></tr><tr><td>热灭活人AB型血清</td><td>40 ml</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEPES (1 M)</td><td>4 ml</td><td></td><td></td></tr><tr><td>谷氨酰胺（100倍浓缩液）</td><td>4 ml</td><td></td><td></td></tr><tr><td>庆大霉素（50 mg/ml）</td><td>0.4 ml</td><td></td><td></td></tr><tr><td>β-巯基乙醇（14.3 M）</td><td>1.4 ml</td><td></td><td></td></tr><tr><td>重组人IL-2（1 mg/ml）</td><td>1 ml</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

从外周血中生成人同种异体抗原特异性t细胞

Generation of Human Alloantigen-specific T Cells from Peripheral Blood

人类T淋巴细胞生物学的研究通常涉及对激活配体反应的检测。T细胞通过T细胞受体（TCR）以高度敏感和特异的方式识别并响应由MHC（人类同源分子为HLA）分子呈递的加工后肽类抗原。尽管T细胞的主要功能是针对由自身MHC分子呈递的外来抗原介导保护性免疫应答，但T细胞也会对同种异体组织中的抗原差异产生强烈反应。T细胞对同种异体抗原的反应可分为直接或间接的同种反应性。在同种反应性中，T细胞通过高度特异性识别所呈递的肽段和MHC分子而产生应答。T细胞对同种异体刺激产生的强烈寡克隆反应，反映了同种异体组织中存在大量潜在的刺激性同种抗原。虽然同种反应性T细胞应答的广泛性在启动和介导与生物学相关同种反应（如移植物抗宿主病和同种移植物排斥反应）相关的病理过程中起着重要作用，但它也可能阻碍对T细胞针对同种异体配体反应的分析。为此，本方案描述了一种从初始人外周血白细胞（PBL）生成对已知肽-MHC（pMHC）同种抗原产生应答的同种反应性T细胞的方法。该方案结合pMHC多聚体标记、磁珠富集和流式细胞术，并与单细胞in vitro培养技术联用，以生成针对同种抗原特异性的T细胞克隆。这使得研究人员能够深入探究响应同种异体刺激的T细胞的生物化学特性与功能。

本方案描述了通过磁珠富集和单细胞流式分选策略，建立具有明确同种异体抗原特异性的克隆性人源T细胞培养物的方法。图1概述了该流程。
<img alt="T细胞富集过程示意图；流式细胞术、克隆培养、同种抗原特异性检测。" src="/files/ftp_upload/52257/52257fig1highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 
图1：实验方案概述。 本文所述方案提供了一种从外周血中可靠地生成同种抗原特异性人T细胞克隆的方法。单个T细胞的分离及细胞培养体系的建立预计耗时约4.5小时。T细胞克隆的扩增需要经过多轮非特异性T细胞刺激和培养，每轮持续14天。在细胞分离后28天可对克隆培养物进行同种抗原特异性检测，并可通过重复刺激进一步扩增培养物以进行额外检测。
同种抗原特异性T细胞的预期产量取决于供体...

本文介绍了一种用于产生和扩增特异性针对特定同种异体抗原的人T细胞克隆的方法。该方案可经调整后用于克隆针对多种肽-MHC复合物配体的特异性人T细胞。

从外周血中生成人同种异体抗原特异性T细胞

人类T淋巴细胞生物学的研究通常涉及对激活配体反应的检测。T细胞可识别并响应经过加工的肽段……

本实验的总体目标是鉴定、分离并克隆具有特定同种异体抗原特异性的T细胞。首先通过密度梯度离心法从全外周血中分离T淋巴细胞，完成第一步。在第二步中，使用荧光四聚体标记的肽-HLA复合物四聚体对具有同种异体抗原特异性的T细胞进行标记，并通过磁分离法富集这些细胞。接下来，通过单细胞流式细胞术分选标记的T细胞。最后，用抗CD3和抗CD28抗体刺激单细胞培养物。最终，可通过流式细胞术分析评估抗原特异性T细胞的同种反应性。与批量淋巴细胞刺激和有限稀释等其他技术相比，该技术的主要优势在于能够生成对明确界定的同种异体抗原具有特异性反应的T细胞克隆。通常，初次接触该方法的研究人员在T细胞克隆的培养与扩增过程中可能会遇到困难，因此在开始实验前需要对培养物进行仔细的每日监测。将4毫升室温密度梯度液分装至2至4个无菌的15毫升锥形离心管中。用70%乙醇擦拭1至2支装有健康志愿者血液的绿色盖头采血管外壁，小心打开管盖，将血液倾入一个无菌的50毫升离心管中，然后用10毫升磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗每支采血管。将冲洗液与倾出的全血合并，轻轻混匀，然后每2毫升稀释血液中加入25微升人T细胞富集混合液，混匀后孵育细胞。20分钟后，使用10毫升移液管将最多10毫升的血液样品轻柔地叠加在密度梯度液表面，注意避免破坏梯度液的界面。将细胞离心10分钟，然后使用5毫升移液器小心地将密度梯度与稀释血浆界面处的白细胞层转移至无菌的50毫升锥形管中。用PBS将收集的外周血淋巴细胞体积补至50毫升，并轻柔混匀细胞悬液。随后进行细胞计数，并取出1毫升等分试样用于分析。接下来，离心收集细胞后，将沉淀重悬于1毫升流式细胞术缓冲液中，并将50微升稀释后的异源抗原肽-MHC四聚体加入细胞悬液。将细胞转移至无菌的5毫升离心管中，室温孵育30分钟后，用2毫升分选缓冲液洗涤细胞。将细胞沉淀重悬于100微升分选缓冲液中，再加入10微升生物素分选试剂盒溶液，孵育15分钟。接下来，将细胞与5 µL磁性颗粒在室温下孵育10分钟，然后轻轻将细胞悬液与2.5 mL分选缓冲液混合。取100 µL用于分析富集前细胞的等分试样，随后将试管放入细胞分离磁铁中。5分钟后，连同磁铁一起握住试管，将上清液倾入一支新的5 mL试管中。然后将离心管从磁铁上取下，用两毫升分选缓冲液洗涤细胞，将细胞沉淀重悬于冷的分选缓冲液中，并按每种样品类型分装至含有两毫升冷分选缓冲液的离心管中。再次离心后，将沉淀重悬于25微升冷分选缓冲液中，加入5微升人源Fc阻断剂，在冰上孵育20分钟。接着，向各离心管中加入20微升相应的抗体混合液，进行孵育。20分钟后，用两毫升冷分选缓冲液洗涤细胞，并将细胞沉淀重悬于每毫升含100万至200万个细胞的缓冲液中。随后，向96孔圆底细胞培养板的每个孔中加入100微升人T细胞培养基，每孔加入量相同，并将该培养板置于冰上保存，直至分选完成。分选结束后，离心培养板，然后将细胞置于37摄氏度、6% CO2的培养箱中培养。接下来，通过涡旋振荡充分混匀适量的活化磁珠，并将适量磁珠转移至一个无菌的5毫升离心管中。将磁珠置于磁力架上洗涤后，弃去洗涤液，然后每0.5微升微珠加入100微升人T细胞培养基。随后，将100微升活化磁珠悬液分装至96孔板的每个孔中，并将细胞放回培养箱继续培养。培养 14 天（即细胞分离后 5 至 7 天）后，可在显微镜下观察到少量增殖细胞形成的细胞簇。小心地将培养物表面 100 微升培养基替换为 100 微升新鲜的人 T 细胞培养基。换液后 2 至 3 天，可在显微镜下观察到中等至较大的细胞簇；而在换液后的 14 天内，肉眼可见的细胞团块应逐渐显现。细胞分离后第28天，将生长阳性培养物的全部200微升体积转移至含有200微升人T细胞培养基的48孔组织培养板的各个孔中。然后，在100微升人T细胞培养基中加入12.5微升刺激性抗CD3、抗CD28微珠，重新刺激后3至5天将培养板放回培养箱。此时培养基应开始变为浅黄色。此时，将培养物转移至24孔组织培养板的各个孔中，并向每孔培养物中加入500 µL人T细胞培养基。最后，在再次刺激后的第10至14天，收集每份T细胞培养物中的200 µL，通过流式细胞术分析其肽段-MHC四聚体结合情况，以评估其同种异体抗原特异性。同种异体抗原特异性T细胞的预期产量取决于供体、所使用的同种异体抗原以及供体中相应反应性T细胞的频率。例如，一名平均健康的供体每毫升血液中含有 4,500,000 至 1,000 万白细胞，其中约 20% 为 T 淋巴细胞。这些散点图展示了来自 HLAD 四阴性供体的 T 细胞与特定同种异体抗原结合能力的检测结果。例如，在本实验中，从起始的 2,000 万白细胞中，计数出每 4,776 个细胞中即有 1 个针对该同种异体抗原的特异性 T 细胞。通过两轮微珠刺激和培养后，成功分离出88个单独的四聚体标记T细胞，并通过显微镜检查鉴定出两个生长呈阳性的培养物，其同种异体抗原特异性通过检测其与A23048 HLA-DR四聚体的结合能力来评估。在进行该实验过程中，需每日监测细胞培养情况，以防止细胞死亡和培养物过度生长。完成该流程后，这些T细胞克隆可用于进一步回答其他科学问题，例如研究同种异体配体识别的生化机制，以及该识别过程如何转化为有效的免疫应答。

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科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

从外周血人类同种异体抗原特异性T细胞的生成

本文介绍一种在人外周血单个核细胞中诱导同种抗原特异性无应答的简单技术。该技术可应用于临床，以产生非同种反应性供体细胞。输注这些细胞可改善异基因造血干细胞移植后的免疫重建，并降低毒性反应。...

通过共刺激信号阻断的同种抗原刺激诱导人外周血单个核细胞中同种抗原特异性无应答性

我们介绍一种从单一人血供体中分离获得调节性T细胞、记忆性T细胞和初始T细胞的方法。在遗传同质性的条件下，可将极化后的调节性T细胞与其他T细胞亚群在多种遗传学和功能学实验中进行比较，其中包括本文详细描述的抑制功能实验。...

从人初始T细胞和记忆T细胞诱导生成调节性T细胞

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使用液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）定量检测干血斑中的免疫抑制剂他克莫司

本文介绍一种利用诱导性多能干细胞（iPSCs）在小鼠模型中生成具有功能性的抗原（Ag）特异性调节性T细胞（Tregs）的方法，用于自身免疫性关节炎的免疫治疗。...

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学习从外周血生成人类同种异体抗原特异性T细胞克隆的方法，通过密度梯度离心、磁珠分选和流式细胞术实现单细胞分离与扩增。该技术适用于免疫学、移植生物学和细胞治疗研究。

从外周血中生成人同种异体抗原特异性T细胞

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