利用多细胞和单细胞成球实验评估人卵巢癌细胞中的干细胞特性

本实验的总体目标是利用多细胞和单细胞成球实验，评估人卵巢癌细胞的干细胞特性。首先，通过嘌呤霉素处理，筛选出携带SOX2报告基因RFP慢病毒的转导细胞；第二步，分离RFP阳性与RFP阴性细胞，并以每孔单细胞或多细胞的形式进行分选接种。随后，在显微镜下观察初次成球情况，接着将初次形成的球状结构解离后重新接种，以分析二次成球能力。

最终，这些成球实验可用于计算具有成球能力的卵巢癌干细胞亚群的比例。该方法有助于回答肿瘤干细胞研究领域中的关键问题，例如哪些可能是潜在的肿瘤干细胞群体，以及它们在整体肿瘤组织中的出现频率。尽管该方法可为卵巢癌干细胞的鉴定提供依据，也可用于分离其他实体瘤（如乳腺癌）中的肿瘤干细胞。

用慢病毒颗粒转导人卵巢癌细胞24小时后，移除病毒上清液，并用PBS培养液洗涤细胞。将细胞置于完全培养基中培养48小时。然后更换培养基，并在第五天加入浓度为10微克/毫升的嘌呤霉素。

第二天用防护剂以1:1000的稀释度处理培养物。用PBS洗涤细胞，然后用0.05%胰蛋白酶EDTA消化细胞使其脱离。孵育3分钟后，加入完全培养基终止反应。

计数细胞，并在室温下以300 × g离心5分钟。将细胞小心重悬于0.5至1毫升无菌PBS中，然后通过40 µm滤器过滤细胞悬液。将细胞调整至5 × 10⁶ 个细胞/毫升的浓度，随后在超低吸附96孔板的每个孔中加入100 µL成球培养基，用于单细胞成球实验。

使用单细胞模式将单个细胞分选至培养板的每个孔中。随后在显微镜下对细胞进行计数，以评估铺板效率。将细胞在新鲜的成球培养基中孵育，条件为37摄氏度、5% CO2，并每天补充基础成纤维细胞生长因子和表皮生长因子。

一周后，通过光学显微镜确定新生肿瘤球的数量，并通过荧光显微镜检测整合报告系统产生的荧光信号。将直径超过 100 微米的肿瘤球计为大球，将直径在 50 至 100 微米之间的肿瘤球计为小球。计数时需注意区分真实的肿瘤球与细胞团簇。

然后根据公式计算成球的RFP阳性或RFP阴性细胞的比例，并进行传代。开始成球时，将每个孔中的内容物转移至各自的1.5毫升微量离心管中。随后用PBS洗涤每个孔三到五次，以确保收集所有细胞球，并在300 × g、室温条件下离心10分钟，使细胞沉淀。

离心后，弃去上清液，将沉淀物在 37 摄氏度下用 200 微升含 0.05% 胰蛋白酶和 EDTA 的溶液在温和摇床上重悬 5 分钟。若 5 分钟后未见明显的大细胞球，则用 100 微升移液器枪头轻轻吹打细胞悬液，并加入 500 微升完全培养基以中和胰蛋白酶活性。离心细胞，小心地将沉淀物重悬于成球培养基中，并将所得细胞悬液通过 40 微米滤膜过滤，如前所述。

最后，对于单细胞的连续传代培养，将一个原代细胞球中的单细胞以每孔100微升细胞球培养基的体积，接种至新的超低吸附96孔板中。然后使用与原代细胞球实验相同的公式，评估继代细胞球中形成细胞球的细胞比例。在基于多细胞的细胞球实验中，约40%的RFP阳性人卵巢癌细胞在原代细胞球实验中能够形成单个肿瘤细胞球，而RFP阴性细胞仅占20%。

令人意外的是，在基于 MGEM 和 D-M-E-M-F 12 的培养基中，接种较少数量的细胞反而计数到更多的类球体，表明接种方式对该实验结果具有显著偏差。相比之下，当通过添加 1% 甲基纤维素使细胞固定后，多细胞类球体培养中类球体形成效率在很大程度上不受细胞密度的影响。约 35% 来自 RFP 阳性类球体的细胞在培养七天后失去红色荧光信号，提示这些细胞已发生分化；而超过 65% 的细胞仍保留 RFP 信号，提示其具有自我更新能力。

相比之下，由初始RFP阴性细胞形成的细胞球中的细胞仍保持RFP阴性，表明在这些条件下它们无法重新获得干细胞潜能。对由单个细胞生成的细胞球进行荧光显微镜观察，进一步证实了这些结果，显示来自RFP阳性细胞的单个细胞球中同时包含RFP阳性与RFP阴性细胞；而来自RFP阴性细胞的细胞球则在该操作后仍保持无红色信号。

还可以通过定量 PCR 进行抗体、染色或基因表达分析等其他检测，以进一步表征具有强成球能力的细胞。在进行该实验操作时，需要注意的是，必须在免疫缺陷小鼠体内进行体内移植实验，以验证成球起始细胞的肿瘤干细胞特性。