小鼠胚胎耳蜗外植体培养及电穿孔介导的基因转导

本实验的目的是培养并进行小鼠胚胎耳蜗的离体电生理操作。为了研究耳蜗发育的各个方面，包括形态发生、分化和生长过程，首先获取第13天小鼠胚胎的头部。接着，通过移除脑组织暴露内耳，并从颅底分离以脱离发育中的颞骨，从而将内耳分离出来。

然后去除上方的软骨，打开耳蜗管以获取耳蜗的感觉上皮。最后一步是将分离出的耳蜗组织进行培养，可选择是否进行电穿孔处理，培养时间最长可达一周。最终可对植入的组织进行活细胞成像分析，或经固定后进行免疫染色，并通过共聚焦成像进行分析。小鼠胚胎耳蜗的培养。

耳蜗上皮是研究器官发生多个方面的理想系统，例如在发育中的耳蜗内研究细胞增殖、细胞命运决定以及极性建立，以及这些事件如何促进组织生长与细胞分化。该技术可用于在体外进行药理学干预并监测基因功能。结合电穿孔介导的基因转移技术，可调控目的基因的表达，并在单细胞水平上观察其功能。

开始此操作时，将一个E13小鼠胚胎头部置于含有冷解剖液的无菌Sogar培养皿中。在解剖显微镜下，用精细镊子固定眼周区域以固定胚胎头部。然后使用两对无菌镊子，沿中线小心去除皮肤并从背侧打开颅骨。

随后，将脑组织从颅腔中取出。位于颞骨内的内耳可通过其周围血管壁的走行进行识别。接下来，用镊子置于组织下方，将内耳从颞骨中分离，并从颅底分离出内耳结构。

随后，将解剖好的内耳转移至一个新的培养皿中，其中含有冷的解剖溶液。现在调整内耳的方向，使其腹侧朝上。通过将微型图钉的尖端轻轻插入前庭部分来固定内耳。

使用超细镊子，在卵圆窗附近切开覆盖的软骨。注意镊子插入软骨的深度不宜过深，因为覆盖的软骨有时会与耳蜗管融合。然后小心地将软骨从耳蜗上移除。

接下来，将镊子置于耳蜗管的基部或顶端，轻轻拉出耳蜗管的顶部，以暴露感觉上皮。最后一步是小心地从暴露的感觉上皮下方去除结缔组织，使耳蜗标本的基底保持平坦。随后，将已解剖的耳蜗从内耳的前庭部分分离出来。

使用1.5毫米无菌刮勺将分离的耳蜗感觉上皮转移至已包被基底膜基质的培养孔中；若需进一步清理以去除多余组织，可在该阶段进行。随后将耳蜗组织块放置成上皮腔面朝上。吸除基底膜基质与DMEM溶液，轻柔地压平组织，然后向培养皿中缓慢加入150微升新鲜培养基。

确保每个x explan a紧密贴附于包被的玻璃盖玻片上，未在培养基中漂浮。接着，将显微解剖的耳蜗轻轻转移至无菌的150毫米培养皿中，并置于组织培养孵育箱内，在37摄氏度、5%二氧化碳条件下培养3至6天体外培养时间（DIV）。

在1D IV后，使用解剖显微镜检查培养物，以确保耳蜗外植体已良好贴附于培养皿上。随后将培养物在体内继续孵育所需的时间，然后进行免疫组织化学处理，为电穿孔实验做准备。首先，通过高压灭菌或在70%乙醇中浸泡约20分钟，对一个100毫米的玻璃培养皿进行灭菌。

然后在使用前将其置于洁净台面上自然晾干。现在，使用合适的大量或中量质粒提取试剂盒，从选定的表达载体中提取DNA。本实验方案中使用的表达载体为H one表达构建体和neuro D one表达构建体。

最终DNA浓度应在无菌的DNA和RNA酶自由水中至少达到1微克/微升，以便将DNA电转染至耳蜗外植体中。取10微升质粒DNA溶液加入一个新的100毫米细胞培养皿中，该培养皿预先涂有基质胶。然后将完全分离的耳蜗外植体转移至DNA溶液中，使上皮的腔面朝上。

轻微倾斜耳蜗，使其与培养皿平面垂直。接着使用电转仪将负极电极板置于感觉上皮一侧，正极电极板置于耳蜗基部附近。施加9至10次电脉冲，每次脉冲电压为24毫伏，持续时间为30毫秒。

随后向电转染的耳蜗中加入100微升预热的培养基。在将电转染的耳蜗转移至包被有基底膜基质的培养皿进行接种之前，需对所有耳蜗组织样本以及所有目的基因的DNA重复上述操作步骤。然后将所有电转染的耳蜗置于37°C、5% CO₂的湿化培养箱中培养所需时间，之后用于免疫细胞化学分析。

这些图像显示了野生型 CD-1 小鼠在胚胎第 13 天的耳蜗切片，小鼠胚胎耳蜗经电穿孔导入 TH1、EEG FP 或 NeuroD1 EGFP 报告基因构建体。切片使用毛细胞特异性标记物抗 Myo7A 或神经元标记物 Tuj1（红色）进行免疫荧光染色。通过 EGFP 表达可见的电转染细胞分布在较大的上皮嵴、较小的上皮嵴以及感觉上皮细胞中。

神经D转染的耳蜗上皮细胞在培养五天后获得神经元表型，并长出树突样突起，其中大多数细胞对Tuj1或Atoh1呈阳性。转染的细胞表达myo7a。一旦掌握该技术，每批处理8至10个样本可在三到四小时内完成。

这将为组织块的解剖培养、电穿孔以及接种提供充足的时间。