Name: 插管介导气管内（IMIT）灌输：一种无创，龙专用输送系统 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min
Description: 了解插管介导气管内灌输技术，用于小鼠肺部细菌递送和呼吸道疾病研究。该方法无创、可重复性高，回收率超过98%，适用于药物输送和病理机制探索。

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作者感谢预测医学动物模型中心（Carol Vanover、Ashley Biller 和 Jennifer Kraenzle）以及微生物学核心设施（Daniel Cramer 和 Julie Sotsky）的支持。本研究获得了美国国立卫生研究院（NIH）的资助（项目编号 HHSN272201000033I，授予 M.B.L 和 J.M.W.）。

注意：本文所述所有操作程序均已通过路易维尔大学机构生物安全委员会（方案编号 #13-056）和机构动物护理与使用委员会（方案编号 #13-064）的审查和批准。
1. 染料的制备
<ol>
	<li>将0.1% (w/v) 考马斯亮蓝溶于磷酸盐缓冲液（PBS）中，并使用0.45 µm注射器滤器过滤除菌。</li>
</ol>
2. 准备 铜绿假单胞菌 培养
<ol>
	<li>接种前15小时，用单个细菌菌落接种3 ml液体培养基。</li>
	<li>在37 °C摇床（200 rpm）中培养15小时。</li>
	<li>取1 ml培养物于1.5 ml离心管中，以12,000 × g离心30秒。</li>
	<li>弃去上清液，将沉淀重悬于1 ml PBS中。</li>
	<li>取部分细菌储备悬液，用PBS按1:10稀释，测定稀释后菌悬液在OD600处的吸光度，以确定细菌浓度。</li>
	<li>用PBS将细菌储备悬液稀释至所需接种浓度，采用50 µl接种体积用于IMIT接种。</li>
</ol>
3. IMIT 灌注
<ol>
	<li>将一组小鼠放入异氟烷麻醉诱导室，使用 2–3% 异氟烷/氧气混合气体进行麻醉。</li>
	<li>在小鼠刚开始出现镇静状态时，捏住其颈背部皮肤，使小鼠保持直立姿势，用灌胃针向其咽喉后部给予 10 µl 的 2% 利多卡因溶液，使溶液自然流至会厌部位。随后将小鼠放回麻醉诱导室。
	<ol>
		<li>至少等待 5 分钟，以确保利多卡因充分发挥局部麻醉作用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>当小鼠达到理想的镇静程度（呼吸频率约为 60 次/分钟）时，将异氟烷浓度降低至 2%，以维持镇静状态。</li>
	<li>将染料或细菌接种物预装入一支配有 22 G 长钝针头的 250 µl 气密精密注射器中。
	<ol>
		<li>首先通过注射器的聚四氟乙烯活塞吸入 150 µl 空气，然后将活塞从注射器筒体上的 150 µl 刻度推进至 200 µl 刻度，吸入 50 µl 接种物。 
		注意：当样本注入已插管的小鼠时，50 µl 悬液将首先被注入，随后是 150 µl 的空气垫，空气垫可将接种物均匀分布至整个肺部。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>从诱导室中取出一只小鼠，仰卧置于插管平台上。用粘扣带上的 O 形环钩住小鼠门齿，并将粘扣带固定在平台上，以固定小鼠。将平台调整为 45° 倾斜。</li>
	<li>使用微型棉签，以主导手通过滚动动作向后牵拉小鼠舌头。</li>
	<li>用非主导手操作配有插管窥视镜的耳科显微镜，以维持舌头的牵拉状态并观察声门。</li>
	<li>用主导手将导丝穿过 20 G 导管，插入小鼠气管，使导管进入深度达 10 mm（导管配有硅胶套管，暴露长度为 10 mm）。随后移除耳科显微镜/窥视镜。</li>
	<li>用非主导手固定导管，同时短暂连接一段带有染料的 Luer 接头透明软管（直径 1/16”），以确认小鼠是否正确插管。 
	注意：染料会随着呼吸快速来回移动。</li>
	<li>若此时未能确认插管成功，则不得进行后续操作。若插管尝试失败，需重置导管和导丝，仅可再进行一次插管尝试。 
	注意：单次操作中对同一只小鼠尝试插管超过两次可能造成创伤，不建议进行。</li>
	<li>继续用非主导手固定导管，同时将装有液体悬液/空气垫的精密注射器/钝针插入导管。</li>
	<li>以单次流畅动作将液体/空气直接注入肺部，随后立即从小鼠体内拔出针头/导管。</li>
	<li>将小鼠放回笼中，使其从麻醉状态中恢复。</li>
</ol>
4. IMT 递送的表征
<ol>
	<li>接种IMIT后，在适当时间点通过CO2窒息法处死小鼠。</li>
	<li>将已处死的小鼠固定在解剖板上，使用喷瓶以70%乙醇浸润胸部和腹部。</li>
	<li>若需评估成像剂在肺部的分布情况，应采用无菌操作技术取出动物肺组织，并根据成像需要适当展示肺组织。 
	注：可通过适当的固定或冷冻保存方法对肺组织进行处理，以备后续组织学染色。</li>
	<li>若需评估感染肺组织中的细菌负荷，应采用无菌操作技术取出动物肺组织。将肺组织放入无菌、预先称重的1盎司样品袋中。称量并记录样品袋加肺组织的总重量。
	<ol>
		<li>向每个样品袋+组织中加入1 ml无菌1×PBS。重新密封样品袋。</li>
		<li>通过轻轻滚动25 ml血清移液管在样品袋+组织上来实现组织匀浆化。</li>
		<li>将肺匀浆液用无菌PBS进行系列稀释，并接种至琼脂平板（LB或适用于所研究细菌种类的培养基）：
		<ol>
			<li>使用多通道移液器在U型底96孔板中进行六倍系列稀释，然后通过多通道移液器将三复孔样品点样至琼脂平板。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>将琼脂平板在37 °C下孵育过夜，次日计数菌落形成单位。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Reznik, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+anatomy%2C+physiology%2C+and+function+of+the+upper+respiratory+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Health+Perspect%22%5BJournal%5D)">Comparative anatomy, physiology, and function of the upper respiratory tract.</a> Environ Health Perspect. 85, 171-176 (1990).</li>
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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

IMIT灌注技术在现有呼吸系统疾病模型的基础上实现了关键性改进，能够可重复地将试剂直接灌注至肺部。该方法操作迅速，非常适合由两名研究人员组成的团队协作：一人负责麻醉和笼具管理，另一人执行IMIT操作。使用IMIT可开展大规模研究，平均每只小鼠仅需2至3分钟。由于该方法采用异氟烷作为麻醉剂，小鼠从麻醉中恢复迅速，从而减少了动物恢复期间的监护和饲养时间。
IMIT 方法在技术上最具挑战性的环节是小鼠插管的初始步骤。学习实施 IMIT 的人员可以专注于导管放置的第一步，并通过观察染料移动来视觉确认插管是否成功。该方法的优势在于，通过确认插管成功，可确保肺部特异性灌注，从而提高新研究人员以及在处理难以插管动物时的专家操作信心。优化插管成功率的关键要素包括：i）实现充分的深度镇静，以提供充足的操作时间；ii）正确将开口器放置于口腔内，以便清晰观察会厌；iii）将开口器置于适当深度，使舌体在整个操作过程中保持回缩；iv）使用可倾斜平台支撑研究人员的手部，使操作过程更放松且动作稳定。
IMIT 操作的一个局限性与 IMIT 灌注操作的频率有关。由于插管失败可能带来潜在创伤，因此不建议在单次实验过程中进行超过两次的插管尝试（最多允许两次失败）。IMIT 在将治疗药物递送至小鼠肺部方面具有巨大潜力，但对于需要非常频繁向肺部递送试剂的治疗方案，可能并不适用于 IMIT 方法。理论上，由技术娴熟的研究人员操作时，可能可以每天使用 IMIT 向小鼠肺部递送试剂而不会造成显著创伤，因为与插管相关的大部分创伤被认为源于插管失败事件。此类高频次的 IMIT 操作应事先与当地兽医及实验动物护理与使用委员会（IACUC）进行讨论。
IMIT 的另一个潜在局限在于被插管小鼠的体型大小。上述描述的 IMIT 操作是针对体重约为 17–22 g 的小鼠建立的，在此体重范围内的小鼠，20 G 导管被证明适合其气管尺寸。在较年长的小鼠中已成功使用了更大的导管；IMIT 方法最初开发时在体重&#62;20 g 的 BALB/c 小鼠中采用了 18 G 导管。重要的是，如果使用其他规格的导管，则应选用与导管内径相匹配的钝头针头，并将其修剪至仅比导管尖端长出 1 mm 左右。对体重小于 17 g 的小鼠进行插管可能可行，但由于操作所需技术难度较高，不推荐进行，且需使用比上述描述更小的导管和窥器。
我们已采用IMIT技术递送多种呼吸道病原体，除此之外 P. aeruginosa，包括 B. pseudomallei9 和 肺炎克雷伯菌10. IMIT 模型对我们的研究取得了重要进展 B. pseudomallei 呼吸道疾病，已发现鼻内接种会导致小鼠出现早期以上呼吸道相关疾病为主的发病症状，而非人类疾病中观察到的全身性疾病的终末表现9. B. pseudomallei 是一种具有生物防御影响的一级选择性病原体，因此正在建立用于气溶胶暴露的呼吸道疾病模型，以模拟武器化病原体可能通过生物防御相关途径进入机体的方式。由于现有的气溶胶模型会导致上呼吸道和下呼吸道同时感染，因此在鼻内接种模型中我们所鉴定出的相同潜在早期发病表型 B. pseudomallei 呼吸系统疾病可能适用于气溶胶模型。未来对IMIT模型的一种改进可能是经气管插管介导的气溶胶递送（IMAD），即通过气管插管将气溶胶靶向递送至小鼠肺部。目前已有可维持异氟烷麻醉的机械通气设备，该设备可被改造用于递送气溶胶化而非液态的病原体攻击。
IMIT 最初被开发用于优化细菌向肺部的递送，也可用于将其他试剂递送至小鼠肺部。如上所述，通过鼻内途径将化合物递送至小鼠体内，会导致向肺这一靶器官递送的效率较低且变异度高。将正电子发射断层扫描（PET）成像试剂经鼻内递送至小鼠肺部时，递送效率仅为40%11，而我们已证明，IMIT 作为一种肺部递送方法，具有 &#62;98% 的递送效率和多肺叶分布，是现有方法的极佳替代方案。这种靶向肺部递送效率的提升，有望提高肺部疾病治疗中治疗剂递送的可重复性。IMIT 同样可为以下研究带来优势：i）环境性肺刺激物的影响研究，ii）肺癌表型研究，iii）肺特异性 siRNA 沉默研究。

小鼠已被用于模拟多种人类疾病表现，包括众多呼吸系统疾病。替代性疾病模型往往无法完全重现所模拟疾病的全部特征，通常是由于两种宿主模型之间存在重要的生理或免疫差异。因此，改进模型系统的一个目标是开发出能够使替代模型更紧密地模拟原始宿主系统中所观察到的疾病过程或宿主反应的方法。在小鼠与人类吸入空气的机制方面，存在若干关键的生理差异。这些差异包括上呼吸道（URT）与下呼吸道（LRT）之间显著的比例尺寸差异。据估计，按总肺容量标准化后，小鼠的上呼吸道表面积比人类高出&#62;100倍1,2。因此，小鼠鼻腔的鼻甲结构可对吸入空气进行更充分的过滤，从而支持更高的呼吸速率；如果鼻腔感染在疾病进展中起重要作用，这一特点可能对肺炎研究产生重大影响。
为了研究类似人类的呼吸道疾病，已采用多种不同方法将细菌接种至小鼠肺部。其中最常用的方法是经鼻接种，即将液体悬液滴入小鼠的一个或两个鼻孔。尽管该方法相对简单，但接种体积和所使用的麻醉类型等因素可能会影响经鼻接种将细菌送入下呼吸道（LRT）的效率3-5。具体而言，Miller et al. 研究表明，当接种体积小于 50 µl 时，Francisella tularensis 无法有效进入下呼吸道6。他们还发现，与注射氯胺酮/赛拉嗪相比，使用吸入式异氟烷进行麻醉时，下呼吸道的接种效果更佳。然而，我们使用Yersinia pestis进行经鼻接种的经验表明，与异氟烷相比，使用氯胺酮/赛拉嗪可实现更稳定的接种效果（MBL，未发表数据）。这些差异可能与所用病原体或实验室操作流程的差异有关，但更重要的是突显了该技术潜在的变异性。此外，经鼻接种后不久采集的肺组织显示，仅有较低比例的初始细菌接种量到达肺部（以Y. pestis为例，接种后1小时仅回收约10%的细菌7），提示大量细菌可能滞留在上呼吸道（或被吞入胃肠道）。在某些疾病模型中，若病原体可在小鼠鼻腔内定植，而这种定植方式与人类疾病不符，则上呼吸道黏膜上大量细菌的沉积可能会干扰对疾病进展的理解。例如，通过in vivo成像观察发现，Burkholderia pseudomallei在人类上呼吸道并不定植，但采用经鼻接种方式时，却在小鼠鼻腔内引发严重的机会性感染8。
在传染病研究中，也已采用其他方法将细菌接种至小鼠肺部。然而，与经鼻接种相比，这些方法通常需要更高的技术熟练度和/或更昂贵的设备，且仍无法消除在多个位点启动感染的可能性例如气溶胶（上呼吸道和下呼吸道）；经口途径（消化道和下呼吸道）；以及手术经气管途径（下呼吸道和血液）。鉴于继发感染部位可能带来潜在并发症，我们致力于开发一种经气管接种方法，该方法可绕过上呼吸道，将病原体直接递送至麻醉小鼠的肺部，同时尽量减少意外接种至血液或胃肠道的风险。为此，我们建立了插管介导的经气管（IMIT）滴注法，作为一种非手术操作，通过在滴注前增设一步验证导管正确位置的环节，确保接种物准确进入下呼吸道。本文以染料滴注为例，直观展示接种物在肺组织中的广泛分布情况， P. aeruginosa 灌注以证明高效递送（&#62;该方法可将接种物的98%递送至肺部。值得注意的是，尽管该技术最初是为细菌递送而开发，但IMIT还可有效用于：i）灌注多种分子以研究其他呼吸系统疾病模型；ii）肺部特异性治疗递送；iii）基础肺功能研究，包括向肺部靶向递送siRNA。

<table><tbody><tr><td>啮齿动物倾斜工作架</td><td>Hallowell EMC</td><td>000A3467</td><td>在生物安全柜内操作时应拆下底座</td></tr><tr><td>操作用耳镜头</td><td>Welch Allyn</td><td>21700</td><td></td></tr><tr><td>耳镜 3.5 V 锂电池</td><td>Welch Allyn</td><td>71900</td><td></td></tr><tr><td>小鼠插管用短型开口器，可高压灭菌</td><td>Hallowell EMC</td><td>200A3589S</td><td></td></tr><tr><td>门齿固定环</td><td>Hallowell EMC</td><td>210A3490A</td><td></td></tr><tr><td>细头棉签</td><td>Puritan</td><td>871-PC DBL&amp;nbsp;</td><td>用于舌部牵拉</td></tr><tr><td>静脉导管，20 G</td><td>Exel Int</td><td>26741</td><td>可选：安装硅胶套管，使导管暴露长度为 10 mm</td></tr><tr><td>气密注射器，250 µL</td><td>Hamilton</td><td>81120</td><td>用于通过 IMIT 递送液体接种物</td></tr><tr><td>钝头针头，22 G</td><td>Hamilton</td><td>91022</td><td>修剪至长度，使其从 20 G 导管中突出 1 mm</td></tr><tr><td>导丝（光纤导丝，0.5 mm）</td><td>TheFiberOpticStore.com</td><td>FOF .50</td><td>剪成 6&quot; 长度：用作插管导丝</td></tr><tr><td>结核菌素注射器，1 mL</td><td>Becton Dickinson</td><td>309659</td><td>与光纤导丝组装作为导丝使用</td></tr><tr><td>亮蓝 R（考马斯亮蓝）</td><td>Sigma</td><td>B0149</td><td></td></tr><tr><td>Tygon 管路，1/16&quot;</td><td>Saint Gobain</td><td>ALC00002&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>雄性鲁尔接头 1/16&quot; 接头</td><td>Cole Parmer</td><td>45503-22</td><td></td></tr><tr><td>雌性鲁尔接头 1/16&quot; 接头</td><td>Cole Parmer</td><td>45500-00</td><td></td></tr><tr><td>利多卡因，USP</td><td>Spectrum</td><td>LI102</td><td>将利多卡因调节 pH 至 2% (w/v) 溶液，pH 7.0</td></tr><tr><td>样品袋，1 盎司</td><td>Whirl-Pak</td><td>B01067</td><td></td></tr><tr><td>U 型底 96 孔板，无菌</td><td>Greiner</td><td>650161</td><td></td></tr></tbody></table>

经插管气管内（imit）灌注：一种非侵入性、肺部特异性的递送系统

Intubation-mediated Intratracheal (IMIT) Instillation: A Noninvasive, Lung-specific Delivery System

呼吸系统疾病研究通常采用小鼠模型作为替代系统。然而，小鼠与人类的呼吸系统在生理上存在显著差异，尤其是在上呼吸道（URT）方面。在使用经鼻滴注技术时，小鼠鼻腔结构的这些差异可能显著影响下呼吸道（LRT）的疾病进展和表现，从而限制了小鼠模型在研究此类疾病中的应用价值。基于这些原因，开发一种将细菌直接注入小鼠肺部的技术将具有明显优势，可在不涉及上呼吸道的情况下研究下呼吸道疾病。我们将这种肺部特异性递送技术称为经插管介导的气管内（IMIT）滴注。该非侵入性技术可最大限度地减少试剂进入血液循环的风险（该风险可能出现在更具侵入性的传统外科手术式气管感染方法中），并降低意外递送至消化道的可能性。IMIT是一种两步法操作：首先对小鼠进行插管，并通过中间步骤确认导管正确置入气管，随后将钝头针插入导管，以实现细菌向肺部的直接递送。该方法可实现&#62;98%的肺部递送效率，并使试剂在肺组织内实现优异的分布。因此，IMIT代表了一种研究下呼吸道疾病及肺部直接治疗递送的新型方法，提升了利用小鼠作为人类呼吸系统疾病研究模型的能力。此外，该递送系统的准确性与可重复性也使其适用于良好实验室规范标准（GLPS），并可用于多种需要高效肺部递送的试剂递送。

为了通过 IMIT 方法观察灌注物质的分布情况，向一只麻醉小鼠的肺部灌注了 50 µl 的 0.1% 考马斯亮蓝染料。随后立即处死小鼠，并通过无菌解剖取出肺组织。图1 显示染料已递送至肺的所有叶段。
为确定通过 IMIT 方法递送至小鼠肺部的细菌数量，将三组小鼠（n = 3）分别灌注三种不同浓度的细菌悬液 P. aeruginosa (1.21 × 108，1.21×107，以及 1.21 × 106 菌落形成单位 [CFU] 每 50 µl）。IMIT灌注后立即处死小鼠，取出肺组织，计数细菌数量，并与接种量进行比较（图2）。通过该方法接种，接种物的递送效率非常高， &gt;灌注动物肺部回收的接种物达到98%。此外，无论接种物浓度如何，IMIT灌注均具有高度可重复性（R2 = 0.9951).
<img alt="肺部染料渗透对比、实验结果、比例测量、科学分析。" src="/files/ftp_upload/52261/52261fig1highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 1"> 
图 1：IMIT灌注使接种物分布于整个肺部。 灌注50 µl 0.1% 考马斯亮蓝的小鼠肺组织显示蓝色染料分布于所有肺叶中。
<img alt="显示菌落形成单位回收率与递送量相关性的图表；R²=0.9951，回收率=98.1%。" src="/files/ftp_upload/52261/52261fig2highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图2"> 
图2：通过IMIT法将细菌接种至肺部。 将铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）接种至小鼠肺内，比较实际接种入肺的细菌数量（回收的Log10 CFU）与估计的接种剂量（递送的Log10 CFU）。每个圆点代表一只小鼠肺内的CFU数量（每种细菌剂量n = 3）。

经插管介导的气管内（IMIT）试剂灌注是一种研究呼吸系统疾病以及将治疗性试剂直接递送至肺部的优良非侵入性方法。该方法快速且具有高度可重复性，适用于临床前测试。

经插管气管内（IMIT）灌注：一种非侵入性、肺部特异性的递送系统

呼吸系统疾病研究通常采用小鼠模型作为替代系统。然而，小鼠与人类之间存在显著的生理差异……

本实验的总体目标是将细菌非侵入性地直接递送至小鼠肺部。首先，将150微升空气缓冲层注入气密注射器，随后加入50微升制备好的细菌悬液。第二步，使用导丝辅助，通过20号导管对麻醉小鼠进行插管。然后，使用简易流量计确认插管成功后，通过导管并借助22号长钝针将细菌接种物直接递送至肺部。最终，经插管介导的气管内接种或省略接种可用于研究小鼠下呼吸道疾病，避免上呼吸道的同步受累。与鼻内接种方法相比，气管内接种的主要优势在于该技术可将接种物准确且可重复地直接递送至肺部。由于IIT是一种非手术技术，因此也降低了与手术性气管内操作相关的并发症风险。尽管该方法可为将细菌递送至肺部以研究发病机制提供可靠手段，IMA也可用于递送其他试剂，例如递送环境化合物以研究肺损伤、靶向递送治疗药物、以及递送成像探针或SRNA以研究肺部基础生物学。通常，初次接触该方法的操作者在插管步骤中会遇到困难，因为该步骤需要对动物和喉镜进行精确的定位，以实现导丝的插入。该方法的可视化演示非常有帮助，因为对于新手研究人员而言，导丝初次置入气管的过程在概念上难以描述。在接种前15小时，取3毫升液体培养基，接种单个细菌菌落，并在37摄氏度、200转/分钟摇床条件下培养。15小时后，取1毫升菌液于1.5毫升微量离心管中离心，然后将沉淀重悬于1毫升磷酸盐缓冲液（PBS）中。接下来，在 OD 600 处测定细菌储备悬液 1 到 10 倍稀释液的吸光度，以确定细菌浓度。然后用 PBS 将细菌细胞稀释至每 50 微升接种物中含有所需浓度的细菌。对于 IIT 植入，需通过灌胃针向轻度麻醉的小鼠给予 2% 利多卡因溶液，以完成 IIT 植入前的小鼠准备。在利多卡因起效期间继续维持麻醉。现在，用一支带有22号长钝针头的250微升气体型注射器抽取150微升空气。然后，当注射器装入后，将聚四氟乙烯材质的推杆从注射器筒上的150微升刻度推进至200微升刻度处，以吸取50微升的细菌接种物。将一只麻醉后的小鼠仰卧固定在插管平台上，通过门齿将其固定在连接于平台的魔术贴条带上。将小鼠抬高至45度倾斜位置，然后用惯用手以棉签采用滚动动作回拉舌头。接着，用非惯用手持一个装有插管窥视镜的手术耳镜，以维持舌头的回拉状态并观察会厌。然后用惯用手持一根已穿过20号导管的导丝，将小鼠气管插管至气管内10毫米深度，随后取出耳镜。用非惯用手固定导管。接着，短暂连接一段带有颜色染料的1/16透明管路（连接诱饵）至导管末端。当动物成功插管后，染料应随着动物的呼吸迅速来回移动。将22号钝头针插入导管，以单次流体动作用直接将接种物注入肺部。随后立即从动物体内移除针头和导管，并将小鼠放回笼中，进行监测直至动物完全从麻醉中恢复。为评估感染肺组织中的细菌载量，需采用无菌技术取出肺组织，并将其置于无菌的预先称重的一盎司样品袋中。称量样品袋与肺组织的总重量后，向组织中加入一毫升无菌 PBS，并重新密封样品袋。随后，用一支 25 毫升血清学移液管轻轻在样品袋表面滚动，以匀浆组织。通过无菌的聚酯网壁过滤器去除结缔组织，并以终浓度1%的Triton X-100处理匀浆液，以释放细菌。接着，使用多通道移液器在UBO 96孔板中对匀浆液进行六倍系列稀释。然后使用八通道多通道移液器将匀浆液10微升等分试样以三复孔形式点种于LBA琼脂平板上。最后，将平板在37摄氏度下孵育过夜，并于次日计数菌落形成单位。在此代表性实验中，通过该方法递送细菌的效率非常高，从接种动物的肺部回收的恶臭假单胞菌接种物超过98%。此外，无论接种物浓度如何，IIT接种均具有高度可重复性。为了通过IIT方法观察灌注物质的分布情况，可将50 µL的0.1%Kumasi亮蓝染料按照前述接种物的操作方法注入肺部。请注意，一旦掌握该技术，染料可均匀分布至肺的所有叶段。该方法可由两名研究人员协作快速完成，包括麻醉、IMA接种及麻醉后恢复在内的整个过程平均仅需两到三分钟。进行此操作时，重要的是对小鼠插管尝试不应超过两次。插管失败可能导致导管误入食管而非气管，从而造成潜在的创伤。许多呼吸道病原体（包括需要三级生物安全防护的病原体）均可通过本方法有效递送，因为该操作可在生物安全柜内按所示方法进行，此外研究人员还可佩戴全面呼吸防护装置（包括面罩）来进一步保障安全。我们已证明，imit 是一种将物质直接递送至小鼠肺部的非常准确且高效的方法。这些特性使 imit 非常适用于需要高度可重复模型系统的 GLP 类型研究。

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