Name: 检测真正的IgE的表达小鼠B系细胞 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 40 s
Description: 学习使用胰蛋白酶处理和流式细胞术检测小鼠B细胞中真正的IgE表达。该方法通过去除表面结合的IgE，实现准确的类别转换重组分析，为免疫学研究提供可靠工具。

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D.R.W. 获得美国国立卫生研究院（NIH）资助项目 AI089972 和 AI113217、黏膜免疫学研究团队以及伯纳姆医学科学家职业奖基金的支持。

注意：此处描述的所有实验均遵循机构动物照护与使用委员会（IACUC）指南，并已获得马萨诸塞州波士顿儿童医院动物研究委员会（ARCH）的批准。
1. 试剂的准备
<ol>
	<li>1,000倍IL-4储存液：将IL-4细胞因子用H稀释至20 µg/ml2O 或 0.1% 牛血清白蛋白（BSA）。分装为每管 200 µl 至 1.5 ml 微量离心管中，于 -20 °C 保存。</li>
	<li>1,000倍抗CD40抗体：从生产商处获取，浓度为1.0 mg/ml，4 °C保存。</li>
	<li>B细胞刺激培养基：向425 ml RPMI-1640培养基中加入75 ml 新鲜解冻的胎牛血清（FCS）、10 ml 1.0 M HEPES缓冲液、5 ml L-谷氨酰胺储备液、5 ml 青霉素-链霉素储备液、5 ml 最低必需培养基非必需氨基酸（MEM-NEAA）以及3.5 µl 2-巯基乙醇。培养基可在4 ˚C保存最多一周。使用前仅向所需体积的培养基中加入IL-4（20 ng/ml）和抗CD40抗体（1.0 µg/ml）。</li>
	<li>2% FCS-FACS缓冲液：将10 ml FCS加入490 ml 1x PBS中。4 °C保存。</li>
	<li>2×胰蛋白酶-EDTA溶液：将5 ml 10×胰蛋白酶-EDTA储备液（每升含5.0 g胰蛋白酶和2.0 g EDTA）用20 ml 1×PBS稀释。将胰蛋白酶-EDTA以2×工作浓度分装，于4 °C保存。使用前恢复至室温。</li>
	<li>胎牛血清：解冻后的FCS可在4 ˚C保存最多两周。细胞质染色实验前15分钟将其置于冰上。</li>
	<li>中性缓冲福尔马林：配制10%福尔马林溶液（含3.7%多聚甲醛）。福尔马林具有毒性，操作时须在通风橱内进行，并穿戴适当的个人防护装备。将福尔马林于室温下储存于化学品储存柜中。</li>
	<li>甲醇：将纯甲醇（100%）储存于 -20 °C，待细胞准备进行通透处理时使用。注意甲醇易燃，应存放于适当的冰箱中。</li>
</ol>
2. B细胞的纯化与活化
<ol>
	<li>从新鲜收获的小鼠脾脏中，通过使用3 ml注射器的推杆将组织轻轻压过70 µm细胞筛，制备单细胞悬液。在15 ml圆锥形离心管中用10 ml 1× PBS收集细胞，并在4 °C下以300 × g离心5分钟。</li>
	<li>弃去上清液，将沉淀重悬于1 ml红细胞裂解缓冲液中，孵育5分钟。加入13.5 ml 1× PBS中和反应，然后在300 × g下离心5分钟。</li>
	<li>（可选）根据制造商说明，按照MACS纯化方案，使用抗CD45R(B220)标记的磁珠对B细胞进行磁分离。</li>
	<li>将纯化的B细胞以1.0 × 106 个细胞/ml的密度接种于预温的B细胞刺激培养基中，培养基于37 °C孵育5天，其中添加IL-4（20 ng/ml）和抗CD40抗体（1.0 µg/ml）。起始培养体积为8 ml，分装至6孔培养板中的2个孔（每孔4 ml）。</li>
	<li>每天观察培养情况，维持细胞密度为1.0 × 106 个细胞/ml。根据需要将细胞分至其他孔中，并用含有新鲜IL-4和抗CD40抗体的B细胞刺激培养基稀释，以调整细胞浓度。</li>
</ol>
3. 胰蛋白酶消化、固定与通透处理
<ol>
	<li>胰蛋白酶消化
	<ol>
		<li>将最多 1.0 × 107 个培养细胞收集至 15 ml 圆锥形离心管中，在 300 × g 条件下离心 5 分钟，弃去上清液。</li>
		<li>用 10 ml 磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤，以去除细胞收集培养基中的残留蛋白。重复离心步骤后弃去上清液。</li>
		<li>将细胞沉淀重悬于倾倒后残留的液体中（约 100 μl）。</li>
		<li>小心加入 800 μl 室温 0.1%（2×）胰蛋白酶-EDTA 溶液至细胞中。沿离心管壁以 45° 角缓慢滴加。</li>
		<li>盖紧管盖，通过倾斜试管使液体沿管壁缓慢流动 5–6 次，轻柔混匀。溶液中可能出现丝状白色沉淀。胰蛋白酶消化时间应控制在 1 分钟以内。</li>
		<li>加入 1 ml 冷的胎牛血清（FCS）终止胰蛋白酶反应。立即加入 10 ml 冷 PBS 稀释 FCS。</li>
		<li>在 4 °C 条件下以 300 × g 离心 5 分钟，弃去上清液，将离心管放回冰上。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>固定
	<ol>
		<li>将细胞重悬于倾倒后残留的液体中。如有需要，可用冷 PBS 将体积补至 100 μl。</li>
		<li>在通风橱内，向细胞中加入 800 μl 10% 中性缓冲甲醛溶液，并上下吹打混匀。加入甲醛后试管会升温。在 37 °C 下孵育 10 分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>透化
	<ol>
		<li>将台式涡旋混合器调至轻柔振荡速度。</li>
		<li>用 10 ml 血清移液管吸取 9 ml 冷（-20 °C）甲醇。</li>
		<li>将含有细胞的试管置于涡旋混合器上方，轻轻开始振荡细胞。</li>
		<li>在试管持续振荡的同时，将冷甲醇逐滴加入试管，使甲醇直接滴落在细胞上，确保持续混合。加入前 2 ml 甲醇后，可将滴加速率提高至缓慢连续流速。</li>
		<li>将试管置于冰上静置 30 分钟，以完成透化过程。或者，细胞可在 -20 °C 下保存长达一个月。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. IgG1 和 IgE 类别转换的荧光染色
<ol>
	<li>将样品在 300 x g 条件下离心 5 分钟，并弃去甲醇溶液。可能会有白色沉淀与细胞一同形成沉淀。</li>
	<li>加入 10 ml 室温 1x PBS，以 300 x g 离心 5 分钟以洗涤细胞。重复一次。注意：用室温 PBS 洗涤沉淀可溶解在步骤 4.1 后可能形成的额外沉淀物。</li>
	<li>用 10 ml 2% FCS-FACS 缓冲液再进行一次洗涤。</li>
	<li>将样品分装至 96 孔圆底板中，在 300 x g 条件下离心 5 分钟。弃去上清液，并将板置于冰上。</li>
	<li>每孔使用 60 µl 2% FCS-FACS 缓冲液，加入以下抗体稀释液进行染色：Anti-IgM RPE/Cy7（1:200）、Anti-IgG1 PE（1:600）、Anti-IgE FITC（1:100）、Anti-CD45R(B220) PerCP-Cy5.5（1:200）</li>
	<li>染色 5 分钟后，用 150 µl 2% FCS-FACS 缓冲液洗涤平板，并在 300 x g 条件下离心 5 分钟。</li>
	<li>重悬于 400 µl 2% FCS-FACS 缓冲液中，通过 40 µm 尼龙细胞滤网转移至 5 ml FACS 管中。</li>
</ol>
5. 使用以下设门策略：
<ol>
	<li>从FSC/SSC图中位于爆裂淋巴细胞群的CD45R(B220)阳性细胞中分离出该细胞群（图1）。</li>
	<li>从B220阳性细胞中，利用IgE和IgG1图谱识别相应的细胞亚群。</li>
</ol>

<ol><li>Chaudhuri, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+the+immunoglobulin+heavy+chain+class+switch+recombination+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+immunology%22%5BJournal%5D)">Evolution of the immunoglobulin heavy chain class switch recombination mechanism.</a> Advances in immunology. 94, 157-214 (2007).</li>
<li>Gould, H. J., Sutton, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IgE+in+allergy+and+asthma+today%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Immunology%22%5BJournal%5D)">IgE in allergy and asthma today.</a> Nature reviews. Immunology. 8, 205-217 (2008).</li>
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<li>Ozcan, E., Notarangelo, L. D., Geha, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+immune+deficiencies+with+aberrant+IgE+production%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Allergy+and+Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">Primary immune deficiencies with aberrant IgE production.</a> Journal of Allergy and Clinical Immunology. 122, 1054-1062 (2008).</li>
<li>Bacharier, L. B., Geha, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+IgE+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+allergy+and+clinical+immunology%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of IgE regulation.</a> The Journal of allergy and clinical immunology. 105, 547-558 (2000).</li>
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<li>Perez, O., Krutzik, P., Nolan, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+analysis+of+kinase+signaling+cascades%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+molecular+biology+%28Clifton%2C+N.J.%29%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric analysis of kinase signaling cascades.</a> Methods in molecular biology (Clifton, N.J.). 263, Clifton, NJ. 67-94 (2004).</li>
<li>Jamur, M., Oliver, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+fixatives+for+immunostaining%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+molecular+biology+%28Clifton%2C+N.J.%29%22%5BJournal%5D)">Cell fixatives for immunostaining.</a> Methods in molecular biology (Clifton, N.J.). 588, 55-61 (2010).</li>
<li>Ishizaka, T., Ishizaka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+passive+sensitization.+IV.+Dissociation+of+IgE+molecules+from+basophil+receptors+at+acid+pH%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+immunology+%28Baltimore%2C+MD.+%3A+1950%29%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of passive sensitization. IV. Dissociation of IgE molecules from basophil receptors at acid pH.</a> Journal of immunology (Baltimore, MD. : 1950). 112 (3), 1078-1084 (1950).</li>
<li>Erazo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unique+Maturation+Program+of+the+IgE+Response+In+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Unique Maturation Program of the IgE Response In Vivo.</a> Immunity. 26, 191-203 (2007).</li>
<li>Xiong, H., Dolpady, J., Wabl, M., Curotto de Lafaille, M. A., Lafaille, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+class+switching+is+required+for+the+generation+of+high+affinity+IgE+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Sequential class switching is required for the generation of high affinity IgE antibodies.</a> Journal of Experimental Medicine. 209, 353-364 (2012).</li>
<li>Yang, Z., Sullivan, B., Allen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+in+vivo+detection+reveals+that+IgE%28%2B%29+B+cells+are+restrained+by+an+intrinsic+cell+fate+predisposition%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Fluorescent in vivo detection reveals that IgE(+) B cells are restrained by an intrinsic cell fate predisposition.</a> Immunity. 36 (5), 857-872 (2012).</li>
<li>Berkowska, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+IgE%28%2B%29+B+cells+are+derived+from+T+cell-dependent+and+T+cell-independent+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+allergy+and+clinical+immunology%22%5BJournal%5D)">Human IgE(+) B cells are derived from T cell-dependent and T cell-independent pathways.</a> The Journal of allergy and clinical immunology. , (2014).</li>
<li>He, J. -S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+distinctive+germinal+center+phase+of+IgE%2B+B+lymphocytes+limits+their+contribution+to+the+classical+memory+response%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+experimental+medicine%22%5BJournal%5D)">The distinctive germinal center phase of IgE+ B lymphocytes limits their contribution to the classical memory response.</a> The Journal of experimental medicine. 210 (12), 2755-2771 (2013).</li>
<li>Keegan, A., Fratazzi, C., Shopes, B., Baird, B., Conrad, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+new+rat+anti-mouse+IgE+monoclonals+and+their+use+along+with+chimeric+IgE+to+further+define+the+site+that+interacts+with+Fc+epsilon+RII+and+Fc+epsilon+RI%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+immunology%22%5BJournal%5D)">Characterization of new rat anti-mouse IgE monoclonals and their use along with chimeric IgE to further define the site that interacts with Fc epsilon RII and Fc epsilon RI.</a> Molecular immunology. 28 (10), 1149-1154 (1991).</li>
</ol>

作者无披露信息。

在体外培养中，使用抗CD40抗体和IL-4刺激小鼠脾脏B细胞可模拟辅助性T细胞2型（TH2）的相互作用，促进抗体类别转换为IgG1和IgE5。B细胞可在总脾细胞悬液的背景下12，或在纯化的脾脏B细胞条件下11进行类别转换重组（CSR）激活。如本实验方案第2.3步所述，B细胞富集为可选步骤，是否进行应由实验人员根据实际需要自行决定。本实验采用CD45R(B220)标记的磁珠对B细胞进行阳性磁分离。分离后，建议通过流式细胞术（FACS）检测细胞纯度，以便将B细胞浓度调整至1.0 × 106 个细胞/ml，从而确保细胞因子和抗体刺激的适当条件。此外需注意，经历多次冻融循环的IL-4蛋白其活性可能下降。
在固定和通透之前对细胞进行胰蛋白酶消化，可实现通过流式细胞术准确测量类别转换（图2）。正确的细胞胰蛋白酶消化对该实验步骤的成功应用至关重要。由于胎牛血清（FCS）可抑制胰蛋白酶活性，因此在胰蛋白酶消化步骤前需用1×PBS洗涤细胞。我们发现室温下孵育...

在小鼠和人类的免疫球蛋白重链（IgH）类别转换重组（CSR）过程中，IgH 的 μ 恒定区外显子（Cμ）被删除，并被下游多个恒定区外显子（CHs）中的一组所取代（例如 Cγ、Cε 和 Cα），从而导致抗体从产生 IgM 转变为产生其他 Ig 类别（例如 IgG、IgE 或 IgA）。CSR 发生在转换（S）区，这些区域是位于每组 CHs 上游 5’端的 1–10 kb 序列1。活化诱导的胞苷脱氨酶（Activation-Induced Cytidine Deaminase, AID）通过胞苷脱氨活性启动 CSR。
IgE 是过敏性疾病的关键介质2，更深入地了解 IgE 的产生与调控机制，可能为特应性疾病的治疗开辟新的途径。在小鼠和人类中，IgE 是受到最严格调控的免疫球蛋白同种型。正常情况下，IgE 的检测水平比其他 IgH 同种型低数千倍3，但在疾病状态下可显著升高4。然而，向 IgE 的类别转换重组（CSR）过程尚未完全阐明。体外使用 IL-4 联合抗 CD40 抗体或 LPS 激活 B 细胞，可诱导其向 IgG1 和 IgE 发生类别转换5。活化的 B 细胞表达低亲和力 IgE 受体 FcεRII/CD232,6，该受体可结合类别转换后在培养中分泌的可溶性 IgE。因此，在流式细胞术分析时，受体结合了 IgE 的 B 细胞与内源性表达 IgE 的 B 细胞染色结果相似7。尽管已知小鼠 B 细胞表达低亲和力 IgG 受体 FcγRIIB1（CD32）8，但根据我们的经验，其似乎不会干扰向 IgG1 类别转换的检测。然而，在检测 B 细胞体外激活后向 IgE 的转换时，非特异性结合于细胞表面的 IgE 可能会干扰分析结果。采用常规染色方法时，不表达 IgE 的细胞也可能呈现 IgE 阳性染色。
本文概述了一种用于开展CSR检测并从小鼠中鉴定真正表达IgE的B细胞的策略9–11。使用胰蛋白酶（一种常见的用于蛋白质消化的实验室试剂）处理活化的B细胞，可去除细胞亲和性IgE及膜结合的表面IgE。随后进行通透化处理，并对胞浆内IgE进行染色，从而揭示真正产生IgE的细胞。

<table><tbody><tr><td>抗小鼠 IgE FITC</td><td>BD Pharmingen</td><td>553415</td><td>克隆号 R35-72</td></tr><tr><td>大鼠抗小鼠 IgG1 PE</td><td>BD Pharmingen</td><td>550083</td><td>克隆号 A85-1</td></tr><tr><td>甲醇</td><td>BDH</td><td>BDH1135-4LP</td><td>保存于 -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Falcon 细胞滤筛 40 &amp;micro;m 尼龙</td><td>Corning</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 细胞滤筛 70 &amp;micro;m 尼龙</td><td>Corning</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>抗人/小鼠 CD45R(B220) PerCP-Cy5.5</td><td>eBioscience</td><td>45-4052-82</td><td>克隆号 RA3-6B2</td></tr><tr><td>抗小鼠/大鼠 CD40</td><td>eBioscience</td><td>16-0402-85</td><td>克隆号 HM40-3</td></tr><tr><td>RPMI 1640 培养基</td><td>Gibco</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (1 M)</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>MEM-NEAA (100 倍)</td><td>Gibco</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液 (10 倍)</td><td>Lifetechnologies (Corning)</td><td>46-013-CM</td><td></td></tr><tr><td>MACS CD45R (B220) 磁珠&amp;nbsp;</td><td> Miltenyi Biotec</td><td>130-049-501</td><td></td></tr><tr><td>MACS 纯化柱</td><td> Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>IL-4</td><td>PeproTech</td><td>214-14</td><td>用蒸馏水或 0.1% BSA 溶解</td></tr><tr><td>中性缓冲福尔马林溶液 (10%)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>HT501128-4L</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA 溶液 (10 倍)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T4174-100 ml</td><td>每升 0.9% NaCl 溶液含 5.0 g 胰蛋白酶、2.0 g EDTA&amp;#8226;4 Na</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P0781-100 ml</td><td>10,000 U 青霉素；10 mg/ml 链霉素 (100 倍)</td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺 200 mM</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>2-巯基乙醇 (99%)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M6250-100 ml</td><td></td></tr><tr><td>红细胞裂解缓冲液</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R7757</td><td></td></tr><tr><td>大鼠抗小鼠 IgM RPE/Cy7</td><td>SouthernBiotech</td><td>1140-17</td><td>克隆号 1B4B1</td></tr><tr><td>HyClone 胎牛血清</td><td>Thermo</td><td>SH30910.03</td><td></td></tr><tr><td>B 细胞刺激培养基</td><td></td><td></td><td>B 细胞刺激培养基由 RPMI 培养基添加胎牛血清 (15%)、20 mM HEPES、1 倍 MEM-NEAA、2.0 mM L-谷氨酰胺、&amp;nbsp;1 倍青霉素-链霉素 (青霉素：100 U/ml，链霉素：100 &amp;micro;g/ml)、β-巯基乙醇 (7 &amp;micro;L/L)、IL-4 (20 ng/ml) 和抗-CD40 (1 &amp;micro;g/ml) 组成</td></tr></tbody></table>

检测真正表达ige的小鼠b系细胞

Detection of True IgE-expressing Mouse B Lineage Cells

B淋巴细胞免疫球蛋白重链（IgH）类别转换重组（CSR）是指最初表达的IgM转换为其他IgH同种型（如IgA、IgE和IgG）的过程。体外检测IgH类别转换重组是研究多种生物学过程的关键方法，涵盖从DNA重组与修复到分子及细胞免疫学的多个方面。体外CSR检测通常涉及通过流式细胞术测定活化B细胞表面的免疫球蛋白表达。虽然IgA和IgG亚类的检测较为直接，但通过该方法检测IgE存在困难，原因是可溶性IgE会结合于活化B细胞表面表达的FcεRII/CD23。本文介绍一种独特的方法，可准确检测在培养中发生类别转换重组后产生IgE的小鼠B细胞。该方法基于胰蛋白酶介导的细胞表面IgE-CD23复合物的裂解，从而通过胞质染色检测IgE产生的B系细胞。该方案为IgE类别转换重组的流式细胞术分析提供了便捷的解决方案。

该方案已成功用于研究小鼠B细胞中向IgE的类别转换重组（CSR）。为证明CSR检测的效率，我们采用抗CD40抗体和IL-4刺激小鼠脾脏B细胞，具体方法如前所述11。刺激5天后，收集细胞并按照上述方案进行处理，随后用荧光标记的IgM、IgG1、IgE以及B220（CD45R）抗体进行染色。在活化淋巴细胞设门（图1）后，若不进行胰蛋白酶处理，则无法清晰区分出明显的IgE阳性细胞群（图2a）。然而，在固定和通透前对细胞进行胰蛋白酶处理，可有效分离出IgE产生细胞（图2b），其原理在于去除了细胞表面结合的IgE。
<img alt="流式细胞术散点图；细胞群体分析；FSC-A 与 SSC-A；蓝色门控区域。" src="/files/ftp_upload/52264/52264fig1highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt...

体外 小鼠中类别转换重组的分析因B细胞表面Fc受体结合的亲细胞IgE分子而具有挑战性。本文描述了一种IgE检测方法：在固定和透化以进行胞质荧光染色之前，先通过胰蛋白酶介导裂解细胞表面结合的IgE。

检测真正表达IgE的小鼠B系细胞

B淋巴细胞免疫球蛋白重链（IgH）类别转换重组（CSR）是一种最初表达的IgM转换为其他IgH……的过程

以下实验的总体目标是区分真正表达IgE的B细胞与表达其他IgE同种型或分泌型IgE的B细胞。在体外类别转换检测中，IgE会结合到B细胞表面蛋白，从而阻碍对IgE类别转换的准确测量。本实验通过在分析前使用胰蛋白酶去除受体结合的IgE分子，实现这一目标。胰蛋白酶可非特异性地切割细胞表面蛋白，同时保持细胞内源性产生的免疫球蛋白分子完整。其次，通过甲醛固定B细胞并用甲醇进行细胞通透，使细胞内蛋白暴露。接着，使用荧光标记的抗体对细胞进行染色，以显示细胞内的免疫球蛋白。结果显示存在明显的IgE阳性B细胞群体。如果基于流式细胞术分析使用胰蛋白酶，则由于难以检测产生IgE的细胞，导致针对IgE生物学的研究受到限制。该方法提供了一种便捷的解决方案，实验室可轻松采用，从而加快我们对这种重要分子的理解。与现有方法相比，该技术的优势在于能够消除受体结合型IgE的干扰作用。例如，该方法比使用抗IgE抗体阻断表面IgE更具成本优势，也比酸洗处理更温和。尽管该方法有助于分析小鼠B细胞类别，但在染色前使用胰蛋白酶处理去除IgE的方法也可应用于其他需要从新鲜分离的小鼠脾脏中去除表面蛋白的实验方案。请制备单细胞悬液。使用3毫升注射器的推杆轻轻将器官压过70微米细胞滤筛。将细胞收集至含有10毫升1×PBS的15毫升圆锥形离心管中。随后在4°C下以300 ×g离心5分钟。弃去上清液，将沉淀重悬于1毫升红细胞裂解缓冲液中。裂解反应5分钟后，加入13.5毫升1×PBS终止反应。然后以300 ×g离心5分钟，将沉淀重悬于残留液体中。现在向细胞中加入含有白细胞介素-4和抗CD40的温热B细胞刺激培养基。起始培养体积为8毫升，分装至6孔培养板的两个孔中，在37摄氏度条件下刺激细胞5天。每天观察培养情况，维持细胞密度在每毫升100万个。通过将培养物分装至其他孔中，并用含新鲜IL-4和抗CD40的B细胞刺激培养基稀释，来调整细胞浓度。首先，在15毫升锥形管中收集最多1000万个经刺激的B细胞。然后以 300 × g 离心 5 分钟，倾去上清液，以去除细胞收集培养基中的残留蛋白质。用 10 毫升 PBS 洗涤 B 细胞，随后再次离心并倾去上清液。倾去上清液后，将细胞沉淀重悬于约 100 微升的残留液体中，小心沿管壁缓慢加入 800 微升室温的含 EDTA 的 0.1% 胰蛋白酶溶液。沿管壁缓慢加入该溶液。加入斜面，然后盖紧管盖，轻轻混匀，使液体沿试管长度方向流动。五到六次后，溶液中可能在一分钟内形成丝状白色沉淀。用一毫升冷FCS终止反应。将细胞置于冰上。此时细胞仍然存活，能够表达新的表面蛋白。立即加入10毫升冷的PBS，稀释FCS。用移液管去除任何漂浮的碎屑。在 4°C 下离心细胞。立即倾倒上清液，并将细胞重悬于残留液体中。如有需要，在通风橱中迅速加入冷 PBS，将体积补至 100 微升，并加入 800 微升 10% 中性缓冲甲醛，用移液器将混合液在管中上下吹打，混合后管子将开始升温，在 37 摄氏度下用固定剂孵育细胞 10 分钟。同时，将台式涡旋振荡器设置为轻柔振荡速度，并准备好预冷至负 20 摄氏度的甲醇备用。当细胞完成孵育后。用血清移液管吸取九毫升甲醇。然后在轻轻涡旋试管的同时，逐滴加入甲醇。逐滴加入两毫升甲醇后，加快速度至缓慢流速。现在将离心管置于冰上静置 30 分钟，以透化细胞。或者，细胞可在负 20 摄氏度下保存长达一个月。开始染色步骤时，首先离心透化后的细胞，并倾倒掉甲醇。可能会有白色沉淀随细胞一同沉淀。随后，加入10毫升室温的1×PBS重悬细胞，离心并弃去上清液。此洗涤步骤重复进行两次。接着，用10毫升含2% FCS的FACS缓冲液进行一次额外洗涤，并将沉淀重悬于残留液体中。将样品加入96孔圆底板的一个孔中，开始后续操作。通常需要平行处理多个样品。使用平板离心机加载20至50微升，以300 ×g离心细胞5分钟。然后倾去上清液，将板置于冰上。接下来对细胞进行染色：向每个孔中加入60微升含有四种不同抗体的2% FCS封闭缓冲液。染色后，将细胞在染色液中孵育5分钟。加入150 µL含2% FCS的FACS缓冲液洗涤细胞。然后按之前步骤离心培养板，弃去上清液，并重新悬浮细胞。使用 400 µL 含 2% FCS 的流式缓冲液。现在将细胞通过 40 µm 尼龙细胞滤网，用移液器转移至 5 mL 流式管中，用于流式分选。通过首先在 FSC-SSC 图上从活化淋巴细胞群中分离 CD45R 阳性细胞（也称为 B220 阳性细胞），然后从 B220 阳性细胞中进一步分选目标细胞。使用IgE和IgG单图，通过该实验流程揭示相应的细胞群体。本研究采用基于活化淋巴细胞设门策略，在小鼠B细胞中分析了向IgE的类别转换重组。在未进行细胞胰蛋白酶消化的情况下，无法清晰区分出明确的IgE阳性细胞群；而在固定和通透前进行胰酶处理后，由于去除了细胞表面结合的IgE，从而实现了IgE产生细胞的有效分离，此步骤一旦掌握即可获得理想结果。如果操作得当，这种染色技术大约可在一小时内完成。甲醛和甲醇的使用可能存在危险，因此在进行该操作时，必须始终使用通风橱，并穿戴适当的个人防护装备。

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