利用光转化后荧光衰减法（FDAP）测量活体斑马鱼胚胎中的蛋白质稳定性

以下实验的总体目标是测量活体斑马鱼胚胎中细胞内和细胞外蛋白质的稳定性。该目标通过将目标蛋白与一种可光转换的荧光蛋白进行标记，并向斑马鱼胚胎中注射编码该融合蛋白的 mRNA 以及一种荧光染料来实现。随后，对可光转换的融合蛋白进行光转换，从而实现对该蛋白的脉冲标记。

在此示例中，融合蛋白被分泌后，通过监测细胞内和细胞外光转化荧光强度随时间的衰减，并利用指数衰减函数进行拟合，以确定该融合蛋白在细胞内和细胞外的半衰期。实验结果展示了基于荧光信号随时间衰减的光转化融合蛋白在体内的稳定性。该方法有助于回答细胞生物学与发育生物学领域中的关键问题。

例如，稳定性如何影响蛋白质的分布和可用性。我们正在使用软件 EP 对 FD DP 数据进行分析。EP 可在我们的网页上免费获取。生成编码目的绿色至红色光可转换融合蛋白的加帽 mRNA 后，将约 31 细胞期的斑马鱼胚胎转移至直径 5 厘米的玻璃或塑料培养皿中，培养皿内含约 8 毫升胚胎培养基，并预先以琼脂糖包被。

向培养皿中加入 2 毫升预先配制并解冻的 pro nay 储存液，在室温下孵育 5 至 10 分钟。用胚胎培养基填充玻璃烧杯，在避免胚胎接触空气或塑料的情况下，将培养皿倾斜并浸入培养基中，将胚胎转移至烧杯内。待胚胎沉降至烧杯底部后，倒出大部分培养基，并用新鲜培养基小心地替换。

轻轻晃动新鲜培养基将导致胚胎失去其变弱的卵膜。重复洗涤后，使用尖端经火焰处理的玻璃移液管将包被的胚胎转移至经琼脂糖包被的注射皿中。随后将 mRNA 与一种分子量为三千道尔顿的 Alexa 488 DExT 链偶联物直接共注射到细胞中心，以确保 mRNA 和染料在细胞内均匀分布。

一旦开始卵裂，将已注射的胚胎转移至六孔塑料培养皿中一个经1%–2%琼脂糖包被的孔内，孔中应含有胚胎培养基，并在28摄氏度避光条件下孵育，直至胚胎发育至晚期球状期。使用体视显微镜鉴定出1至5个健康胚胎，用尖端经火焰处理的玻璃PEs移液管将这些胚胎从培养皿中吸出。随后，将胚胎轻轻排入含有约1毫升融化状态的1%低熔点琼脂糖（溶于1×斑马鱼胚胎培养基）的微量离心管中。接着，将胚胎连同部分琼脂糖重新吸入移液管中。

然后轻轻将拟南芥幼苗和胚胎吹打到玻璃底培养皿的盖玻片上。若需重复使用玻璃移液管，应在拟南芥幼苗凝固前迅速用胚胎培养基反复吹吸，以清除残留的拟南芥幼苗，防止堵塞。

使用金属探针在体视显微镜下调整胚胎位置，使动物极朝向盖玻片。监测胚胎位置，并在琼脂凝固前根据需要进行调整。当琼脂完全凝固后，用一份斑马鱼胚胎培养基填充玻璃底培养皿。

为进行光转换做准备，将培养箱设置为28摄氏度，并在物镜上放置一大滴浸油，以确保当载物台移动至不同胚胎位置时，物镜与盖玻片之间的油膜不会破裂。成像时，将玻璃底培养皿牢固地放置在载物台上，防止载物台移动时培养皿发生位移。接下来，在共聚焦显微镜的软件中定义每个胚胎的位置。

调整每个胚胎的Z轴深度，并使用488纳米和543纳米两种激光，尽量对每个胚胎中大致相同的层面进行成像。采集光转化前的图像。然后配置共聚焦显微镜软件，按照预先设定的成像条件，对之前定义的每个位置进行成像。

每10或20分钟，或在五小时的时间过程中，将物镜切换至10倍，使用汞灯通过波长约300至400纳米的滤光片，以100%输出功率对胚胎组照射紫外线两分钟，以实现融合蛋白开关的光转化。光转化后，沿Z轴方向调整焦距，以促进均匀的光转化。立即切换回25倍或40倍物镜，确认先前定义的位置仍然准确。

如果培养皿在光转换过程中发生移动，需重新定义胚胎的位置。启动成像时间序列，并持续运行五小时。记录每个胚胎从光转换完成到成像开始之间的时间间隔。

偶尔检查实验，监测 Danielle 培养基的液面高度，必要时添加更多培养基。首先目视检查每个胚胎的时间序列数据集。剔除在成像过程中死亡、发生显著位移、光转换信号水平极低，或包含形态异常且停止运动与分裂的细胞区域的胚胎数据集。

使用基于 Python 的软件包 PI F DAP，通过严格位于细胞内的 Alexa 488 信号创建掩膜。为了区分细胞内和细胞外的光转换信号，将该掩膜应用于对应的红色通道图像，以排除细胞内像素的干扰。在计算平均细胞外强度以测量平均细胞内强度时，需反转掩膜，显示生成的掩膜图像，并进行目视检查，剔除那些掩膜未能准确区分细胞内与细胞外空间的数据集。

使用PI F DAP计算每张图像的平均细胞外和细胞内荧光强度。然后根据文本方案中的指南对荧光数据进行拟合，并计算细胞外和细胞内蛋白的半衰期τ（来自清除率）。

Constance K 的 squint 是一种分泌蛋白，在斑马鱼胚胎发育过程中可诱导内胚层基因的表达。在本实验中，胚胎被共同注射了 Alexa 488 葡聚糖以及编码 squint DENDRA2 的 mRNA，并接受了 FDAP 检测。如图所示，细胞外光转化信号强度随时间推移而降低。

利用PI F dap，生成了23个胚胎的胞外强度分布，并使用一阶清除模型对数据进行拟合。结果表明，平均半衰期τ为116分钟。类似的强度分布和蛋白质。

当成像时间间隔为10或20分钟时，获得了半衰期数据，表明光漂白或意外的光转化对荧光强度变化的贡献不显著。观看本视频后，您应能够充分理解如何利用光转化后的荧光衰减进行分析。

为了测量活体中光可转换融合蛋白在中国斑马鱼胚胎内的半衰期。