测量生活中的斑马鱼胚胎蛋白质稳定性使用荧光衰减光转化后（FDAP）

以下实验的总体目标是测量活斑马鱼胚胎的细胞内和细胞外蛋白质稳定性。这是通过用光转换荧光蛋白标记目标蛋白质，并将编码融合和荧光染料的 mRNA 注射到斑马鱼胚胎中来实现的。接下来，光转化融合蛋白进行光转化，脉冲标记蛋白质。

在这个例子中，分泌融合蛋白，然后随着时间的推移监测细胞内和细胞外光转换荧光强度的衰减，并拟合指数递减的功能，以确定融合蛋白的细胞内和细胞外半衰期。结果表明，基于荧光信号随时间衰减的光转换融合蛋白的体内稳定性。这种方法可以帮助回答细胞和发育生物学领域的关键问题。

例如，稳定性如何影响蛋白质分布和可用性。我们正在使用我们的软件 EP 来分析 FD DP 数据。EP 可在我们的网页上免费获得编码编码的加帽 mRNA 后，编码感兴趣的绿色到红色光可转换融合蛋白，将大约 31 个细胞阶段斑马鱼胚胎转移到一个直径为 5 厘米的玻璃或琼脂玫瑰涂层塑料培养皿中，该培养皿含有大约 8 毫升胚胎培养基。

向培养皿中加入 2 毫升预先制备并解冻的 pro nay 储备液，并在室温下孵育 5 至 10 分钟。用胚胎培养基填充玻璃扬声器，在避免胚胎暴露在空气或塑料中的同时，通过倾斜培养皿将胚胎转移到烧杯中，同时将其浸入培养基中。胚胎沉降到烧杯底部后，倒出大部分培养基并使用新鲜培养基小心更换。

新鲜培养基的轻微旋转会导致胚胎失去其虚弱的冠状体。重复洗涤后，使用带有火焰尖端的玻璃 PE 移液器将涂层的胚胎转移到琼脂糖涂层的注射皿中。然后将 mRNA 和 3 道尔顿 Alexa 4 88 DExT 链偶联物直接注射到细胞中心，以确保 mRNA 和染料的均匀分布。

卵裂开始，将注射的胚胎转移到装满胚胎、培养基的六孔塑料培养皿的 1% 至 2% 琼脂糖涂层孔中，并在 28 摄氏度的黑暗中孵育，直到胚胎用立体显微镜达到晚期球体阶段，识别 1 到 5 个健康胚胎，并使用带有火焰尖端的玻璃 PE 移液器将它们从培养皿中取出。将胚胎轻轻弹出到微量离心管中，该离心管在 1 x danios 胚胎培养基中含有大约 1 毫升熔化的 1% 低熔点 aros。接下来，将胚胎与一些 aros 一起拉回移液器中。

然后轻轻地将 aros 和 embryos 弹出到盖子上。玻璃底盘的玻璃杯。要重复使用玻璃移液器，请快速上下移液胚胎培养基，在 aros 凝固之前快速工作，以清除残留的 aros 以防止堵塞。

使用金属探针定位胚胎，使动物杆面向立体显微镜下的盖玻片。监测胚胎位置并根据需要重新调整，直到 agarro 变硬。当 agarro 凝固后，使用 1 x danios 胚胎培养基填充玻璃底培养皿。

为了准备照片转换，请将培养箱设置为 28 摄氏度，并在物镜上滴一大滴浸油，以确保物镜和盖玻片之间的油膜不会在载物台移动到不同的胚胎位置时破裂。在安全成像过程中，将玻璃底培养皿放在载物台上，这样当载物台移动时培养皿就不会移动。接下来，在共聚焦显微镜的软件包中，定义每个胚胎的位置。

调整每个胚胎的 Z 深度，并尝试使用 4 88 和 5 43 纳米激光在每个胚胎中瞄准大致相同的平面。获取照片转换前的图像。然后配置共聚焦显微镜软件，以适当的成像条件对先前定义的每个位置进行成像。

每 10 或 20 分钟或 5 小时一次，将融合蛋白开关光转换为 10 倍物镜，并将胚胎组暴露在来自汞灯的紫外线下，使用大约 300 至 400 纳米滤光片以 100% 输出保持两分钟。沿 Z 轴移动焦点，以促进照片转换后的照片转换均匀。立即切换回 25 x 或 40 x 物镜，并确认先前定义的位置仍然准确。

如果培养皿在照片转换过程中移动，请重新定义胚胎的位置。开始成像时间课程，并让它运行 5 小时。注意每个胚胎的照片转换和成像开始之间经过的时间。

偶尔检查实验并监测 Danielle 培养基的水平，必要时添加更多。首先目视检查每个胚胎的时间过程数据集。丢弃在成像过程中死亡的胚胎的数据集，这些胚胎发生了显著的变化，这些胚胎的光转换信号水平非常低，或者包含看起来不寻常且已停止移动和分裂的细胞区域。

使用基于 Python 的软件包，PI F DAP 使用 Alexa 4 88 信号创建掩码，该信号严格位于细胞内。为了分离细胞内和细胞外光转换的信号，将掩码应用于相应的红色通道图像，以防止考虑细胞内像素。当计算平均细胞外强度以测量平均细胞内强度时，反转掩模，显示生成的掩模图像，并目视检查它们并丢弃掩模无法准确区分细胞内和细胞外空间的数据集。

使用 PI F DAP 计算每个图像的平均细胞外和细胞内荧光强度。然后根据文本方案中的指南拟合此处所示的荧光数据，并计算细胞外和细胞内蛋白质。半衰期 tau 来自清除率。

Constance K 斜视是一种分泌蛋白，在斑马鱼胚胎发生过程中诱导 mis 内胚层基因的表达。在本实验中，胚胎共注射 Alexa 4 88 葡聚糖和编码斜视 DENDRA 2 的 mRNA，并进行 F DAP 测定。如图所示，细胞外光转换的信号强度随着时间的推移而降低。

使用 PI F dap，生成来自 23 个胚胎的细胞外强度曲线，并使用一阶清除模型拟合数据。结果表明平均半衰期 tau 为 116 分钟。相似的强度谱和蛋白质。

当成像间隔为 10 或 20 分钟时，获得半衰期。表明照片漂白或无意中的照片转换对强度变化没有显着影响。看完这个视频，你应该对照片转换后如何使用荧光衰减有了很好的了解。

在体内测量。活斑马鱼胚胎中光转换融合蛋白的半衰期。