同时电生理记录和抑制剂在啮齿动物大脑微注射
2015年7月7日
在这里，我们制作了一个具有双重功能的玻璃移液器：通过显微注射药物来抑制大脑深部结构，并通过同步电生理记录实时监测其效果。
该程序的总体目标是构建一条经济实惠的注射途径，将神经递质显微注射到大鼠上丘中，同时监测多单位神经元活动。这是通过首先使用玻璃毛细管和立式微量移液器拉拔器创建玻璃移液器来实现的。第二步是将银丝插入毛细管中，其中一段丝从非锥形端伸出。
接下来使用胶水在玻璃移液器和皮下注射针头之间形成紧密密封。最后的步骤是将芝加哥天蓝色的 GABA 溶液填充到移液器中，该溶液连接到装满矿物油的微量注射器上，并固定在微量注射器上。最终，这种具有可及且负担得起的部件的注射结构可用于灭活深部脑结构，同时记录注射药物之前、期间和之后灭活区域的神经元活动。
与其他现有方法（例如基于气体的压力脉冲和光注入系统）相比，该技术具有一些优势。一是它是一种具有成本效益的方法，允许对药物输送进行基于功能的控制，从而限制了过度注射造成的组织损伤。该系统提供的另一个优势是组合记录功能，允许有效控制神经失活的时间分量。
要准备记录注射移液器，首先拉出一个外径为 1 毫米的 7 厘米毛细管，用于 cop 垂直模型。7 个 20 或类似的单位。将加热器设置为 18，将螺线管设置为下一个，戴上手套手动折断尖端以打开，并在显微镜下验证内径在 30 到 40 微米之间。
使用取景器标尺测量。它将产生 0.3 到 0.6 兆欧姆的相对较低的阻抗。然后从非锥形端开始，将一根银丝插入移液器中约 7 厘米长，并留出 1 到 2 厘米的悬垂在移液器外。
将多余的导线与毛细管正交弯曲。接下来，取一根 30 号皮下注射针头，将柔性塑料粘合剂涂在轴上。然后慢慢地将针头插入移液器中。
尽可能。添加更多胶粘剂，在移液器和针头之间的交界处形成密封。移液器吸头朝上，让组件干燥约 12 小时。
麻醉并将大鼠放入立体定位框架后，涂抹眼药膏将其头部剃干净。在应用局部麻醉剂并确认手术麻醉平面后，继续使用 10 号手术刀刀片沿正中线切开头皮。这将暴露冠状缝和矢状缝。
然后使用手术刮刀，确定 Lambda 和 bgma 解剖参考。调整头部的位置，使这些路标在同一水平面上水平。然后是 0，一个细的刚性指针，就像 bgma 上的玻璃管一样。
接下来，使用 bgma 中的坐标将管的位置调整到感兴趣的位置。使用记号笔在开颅手术的目标区域周围画一个正方形。现在使用手术消毒钻头，沿着标记慢慢去除骨头。
首先使用尽可能小的压力并保持钻头移动，以避免骨骼变薄时因摩擦而导致头部组织损伤，用镊子小心地去除方形切片。Dora MA 不需要移除，因为注射会向前渗透它。保持裸露的皮质用脑脊髓液冲洗。
首先用矿物油填充 5 至 10 微升注射器来准备注射。接下来，用生理盐水中的染料制备目标药物。这里 0.5% 芝加哥天蓝色与 300 微摩尔 gapa 混合。
现在，先将 1 毫升注射器中加入准备好的溶液，然后使用注射器加载移液器，从而填充注射移液管。取出注射器时，请轻轻按压柱塞，这样真空就不会从注射路径中去除溶液。检查可能的泄漏点是否有液体逸出。
用棉签擦掉多余的液体并重新检查是否有泄漏。现在，将装有矿物油的 micros 注射器连接到注射路径。然后擦去多余的溶液。
带纱布。检查注射针头。应该可以让小滴溶液流过它，否则它会被堵塞或现在将喷油器牢固地安装到微型泵系统上。
然后将注射路径的位置移动到目标坐标，并将电极降低到上柱，这可以通过记录视觉诱发电位来识别。当电极下降时，通过施加低注射速率施加小的正压以避免堵塞。到达结构时中断注入。
插入注射剂后，用温热的琼脂覆盖暴露的皮层以防止干燥。最终放置电极后，等待 30 分钟，以稳定电极周围的组织。然后以每分钟 400 纳升的速率注入 800 至 400 纳升溶液，直到上结肠中的神经元活性激活，电极在注射抑制溶液期间应显示尖峰减少。
在上结肠中获得视觉诱发电位。在注射 gaba 后向对侧眼闪光 300 毫秒后，响应闪光刺激的尖峰活动被抑制 45 至 60 分钟。在执行此程序时，重要的是要检查加载过程中是否有泄漏，并验证药物溶液是否自由流过注射针头。
查看完整文字稿并访问数千部科学视频
概述
本文描述了一种玻璃移液器的构建，其设计有两个目的：通过电生理记录传递药物以抑制深部脑结构，并监测神经元活动。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 电生理学
- 神经药理学
背景
- 理解深部脑结构对于神经科学研究至关重要。
- 微注射允许靶向药物递送。
- 同时监测神经元活动可以提高数据准确性。
- 经济实惠的工具可以促进更广泛的研究应用。
研究目的
- 创建一种经济实惠的神经递质微注射方法。
- 监测药物给予期间的多单元神经元活动。
- 提高神经科学实验技术的可及性。
使用的方法
- 使用玻璃毛细管构建玻璃移液器。
- 插入银线进行电记录。
- 用胶水将移液器密封到皮下针上。
- 用GABA溶液填充移液器以进行微注射。
主要结果
- 构建的移液器有效地向大鼠上丘传递药物。
- 成功获得了神经元活动的同步记录。
- 该方法在抑制目标脑结构方面表现出可靠性。
- 结果表明该方法在神经科学研究中有更广泛的应用潜力。
结论
- 双功能移液器是神经科学研究的有价值工具。
- 它允许同时进行药物递送和实时监测神经元活动。
- 这种方法可以提高神经药理学实验的结果。
常见问题
Executive Industry Relevance
This method enables real-time functional validation of drug effects on neuronal circuits, supporting target de-risking in early neuropharmacology discovery. By combining microinjection with electrophysiological readout, it provides mechanistic confidence for inhibitory compound screening. The approach offers a low-cost, adaptable platform for probing brain region-specific pharmacodynamics prior to lead optimization.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables functional interrogation of therapeutic targets through site-specific drug delivery and concurrent neuronal activity monitoring.
- Operational Value: Supports hypothesis-driven validation of neuronal pathway involvement in disease models.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative, real-time electrophysiological readouts as functional biomarkers of drug engagement.
- Operational Value: Facilitates assay standardization through reproducible microinjection and recording parameters.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Bridges in vitro findings to intact circuit function by validating drug effects in disease-relevant neuronal systems.
- Operational Value: Supports go/no-go decisions by linking target inhibition to measurable changes in neural network activity.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery workflows where target engagement and functional consequence must be established before compound advancement.
- Discovery Biology: Supports mechanistic de-risking by confirming that target modulation produces expected electrophysiological outcomes.
- Screening: Enables primary screening of inhibitory agents using neuronal silencing as a functional readout.
- Analytics: Provides spike suppression metrics and latency-to-effect measurements for compound comparison.
- Translational Research: Aligns with preclinical validation by demonstrating target-mediated effects in vivo.
- Enterprise Reuse: The injectrode design is adaptable across brain regions and chemical compounds, supporting broad reuse in discovery programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by linking pharmacological intervention to functional neural output.
- Operational Value: Reduces reliance on separate injection and recording systems, improving workflow efficiency and data synchronization.
- Strategic Value: Enhances capital efficiency by minimizing false positives through functional target confirmation.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of compounds based on dose-dependent electrophysiological responses.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microsurgery, electrophysiology, and stereotaxic targeting.
- Depends on access to microinjectors, amplifiers, and signal acquisition systems capable of multi-unit recording.
- Necessitates standardization of injection volumes, rates, and post-injection stabilization periods across studies.
- Adaptation to different brain regions may require recalibration of coordinates and electrode positioning.
- Potential limitations include tissue damage from repeated insertions and variability in seal integrity affecting drug delivery accuracy.
