对于荧光DNA的简易方法原位杂交来压扁染色体

该程序的总体目标是使用 DNA 原位杂交将异色序列映射到有丝分裂染色体。这是通过首先解剖星果蝇幼虫或其他感兴趣组织的第三个大脑来完成的。第二步是将组织固定在盖玻片上。

接下来，将组织压在盖玻片和载玻片之间。为了准备用于杂交的染色体，最后一步是将短合成的寡核苷酸探针与压扁的组织杂交。最终，荧光显微镜用于显示染色体上与寡核苷酸探针互补的序列的定位。

与现有方法相比，这种方法的主要优点是它的简单性。大多数其他染色体和 C 2 杂交方法涉及用大量形式的酰胺洗涤，这可能既昂贵又混乱。我们的方法不需要形式 IDE 清洗，使其成为一种更便宜、更清洁、更快速的技术。

虽然这种方法提供了一种简单的方法来直观地绘制果蝇大脑体细胞染色体上的序列，但它也可用于绘制来自不同生物体中不同组织的其他类型染色体上的序列。对于要制作的每张载玻片，准备四到五个组织，但不要准备更多用于脑解剖的组织。首先选择流浪的第三龄幼虫并将它们收集在一个 XPBS 的一滴中。

选择不会过度拥挤的样品瓶进行收集。在解剖镜下，使用超细镊子抓住口钩，另一对镊子抓住身体长度的三分之二。然后轻轻拉动口钩，露出大脑、腹侧神经节、唾液腺和部分消化道。

接下来，将大脑和腹侧神经节从其他组织中抽离，并将它们转移到塑料板上的一个 XPBT 液滴中。对于 nasia 睾丸解剖，收集雄性 3 日龄 puy。三天大的小狗有黄色的身体和红色的眼睛。

翼垫较小的是雄性。用一对镊子和第二对镊子抓住靠近胸部区域的腹部顶部蛹。抓住腹部的最远端，然后拉出泪滴状的睾丸。

它们被可以轻轻甩掉的脂肪体包围，从睾丸上分离任何外部身体部位，这将阻止正确挤压并将睾丸转移到干净板上的一滴 XPBT 中。收集完所有组织后，用低渗溶液处理它们，以改善姐妹染色单体的分离。在 e 色区域，将组织转移到一滴 0.5% 柠檬酸钠中 10 分钟。

为了获得这种效果，不建议使用秋水仙碱，因为它会导致染色体形态出现伪影。现在，使用超细镊子固定组织。将它们转移到一滴 20 微升新鲜制备的 2.5% PFA 和 45% 乙酸中，放在干净的 sigma 涂层处理过的盖玻片上，将组织均匀地放在固定剂中，在室温下孵育 4 分钟，然后继续压扁盖玻片，首先将聚赖氨酸涂层的载玻片面朝下轻轻放在组织和盖玻片上。

让盖玻片粘在载玻片的底部，不要按压。治疗。带有 sigma 涂层的盖玻片有助于确保在去除盖玻片后南瓜组织保留在载玻片上。然而，组织很少会保持附着在盖玻片上。

在此步骤中，我们建议执行重复组织压缩。现在将幻灯片翻转过来，放入一张折叠的厚纸中。然后在稳定的表面上，用拇指非常用力地直接按压盖玻片。

请勿以滑动盖子的方式按压，否则会弄脏组织。非常用力的按压通常会在南瓜组织内产生很好的染色体。但是，有时您可能会遇到染色体质量的可变性，例如染色体不完整、挤压或碎片化。

因此，我们建议进行 2 或 3 次重复组织挤压。将组件转移到冰块中几分钟，然后将其浸入液氮中，直到氮气停止沸腾或更长时间在组织解冻前立即取出载玻片后，使用新的剃须刀片弹起盖玻片的一角。从而删除它。

小心避免刮伤组织。然后快速将玻片放入装有 100% 乙醇的 Coplin 罐中，浸泡至少 5 分钟。取出载玻片芯，在不接触组织的情况下去除多余的乙醇，让载玻片风干一小时。

然后，载玻片可以在干燥室中储存数周至数月。首先将每个探针的 100 ng 添加到 20 μL 的 1.1 x 杂交缓冲液中，以获得 22 μL 的 1 x 杂交缓冲液溶液。然后将混合物移液到固定的纸巾上，保持组织不动，轻轻地盖上盖玻片。

不接触组织的小气泡不会出现问题，但更多气泡需要重新应用盖玻片。将载玻片放在 95 摄氏度加热块的平坦面上，并用箔纸覆盖。等待 5 分钟，在此期间，您可以通过将湿纸巾添加到小费盒中来准备湿度箱。

然后取下载玻片。小心地将载玻片包裹在拉伸的 Paraform 中，并将其转移到由湿毛巾组成的加湿室中。在提示盒中，将载玻片在腔室中孵育 4 小时，至 30 摄氏度过夜。该温度适用于低 GC 含量探针，但对于 GC 含量较高的探针，可能需要对杂交温度进行一些故障排除。

孵育后，小心地取下封口膜，慢慢提起盖玻片的一个角。然后在 0.1 XSSC 缓冲液中洗涤玻片 3 次，每次洗涤 15 分钟。在洗涤过程中用箔纸盖住罐子，以尽量减少光照。

对于长生物素化探针，在继续之前加入 rod domine avadon 并洗涤。首先，干燥组织周围的区域，并用 100 微升封闭溶液覆盖组织。然后轻轻地贴上新的盖玻片，不要捕获气泡。

同样，用 param 包装幻灯片。然后将玻片在 37 摄氏度下孵育 30 分钟。其次，孵育后，取下盖玻片并用抹布吸干组织周围。

然后在组织上，涂抹 100 微升 1 至 1000 个 SBT 稀释的 1 至 1000 个反刍 avadon。跟进，像用块一样覆盖、包裹和孵育载玻片。最后，小心地取下盖玻片并清洗载玻片。

在 4 x SSCs T 中使用 3 次洗涤，然后在 0.1 XSSC 中使用 3 次洗涤。每个洗涤步骤应至少为 5 分钟。继续执行方案，通过吸干多余的缓冲液而不接触组织来干燥载玻片。

然后将玻片组织面朝上放在黑暗的地方 10 到 15 分钟，或直到水分完全消散。现在，使用 11 微升具有 DPI 的矢量盾牌安装载玻片，并小心地降低非 sigma 涂层盖玻片。如果介质没有到达所有边缘，请从边缘再涂抹几微升介质并擦去多余的部分。

然后用指甲油密封盖玻片，并在指甲油干燥时将载玻片直立存放在黑暗的地方，这通常至少需要半小时。然后将载玻片在零下 20 摄氏度下存放长达一周，并尽快对组织进行成像。一组具有荧光偶联物和由 Nick Translation 制备的较长生物素化探针的小型商业合成寡核苷酸都与来自几种不同组织类型的染色体杂交。

使用所描述的方法，对果蝇 359 碱基对卫星重复序列的探针识别出 x 上的一个大的多兆碱基对块和染色体 3 上一个小得多的区域。对响应卫星的较长探测检测到重复块，该重复块由相对较低的重复拷贝数组成，约为 700 个。因此，这种方法允许可视化非常小的卫星块。

当低渗溶液处理步骤的持续时间增加一倍至 10 分钟时，姐妹染色单体的分离向东增加。该程序可以与其他方法（例如抗体染色）结合使用，以回答诸如某些染色质蛋白定位于特定序列等问题。