Name: 补偿性增长龙鼠标肺切除型号 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 22 s
Description: 学习小鼠肺切除手术模型以研究肺再生机制。通过左胸廓切开术结扎左肺动脉并切除左肺，诱导右肺代偿性生长。该方法结合谱系示踪技术可深入解析肺泡发育与再生的细胞分子机制。

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作者感谢辛辛那提儿童医院兽医服务部提供的协助。本研究由美国国立卫生研究院 K12 HD028827 项目资助。Anna Perl 博士向作者传授了该手术操作技术。

注意：动物使用声明：本研究中的所有操作均经辛辛那提儿童医院机构动物使用与护理委员会（IACUC）批准，并遵循其指南进行。8周龄雄性C57BL/6J小鼠购自杰克逊实验室（Jackson Laboratories，缅因州巴港），在使用前允许其适应环境一周。手术前，动物饲养于无病原体屏障设施中，自由摄取经高压灭菌的饲料和过滤水ad libdium。每只小鼠笼具均配备独立的空气和水源，饲养室保持12小时昼夜循环。手术后恢复期间，小鼠饲养在带过滤顶盖的笼具中，自由摄取高压灭菌饲料ad libidum，并通过饮水瓶提供过滤水。
1. 仪器准备
<ol>
	<li>使用回形针和图钉制作6个皮肤牵开器。将拉直的回形针缠绕在图钉的针柄上，一端留出5 cm长的直钢丝，并在钢丝末端弯成一个0.5 cm的“U”形钩。</li>
	<li>使用塑料薄膜制作若干块15 × 15 cm的方形手术巾。每只小鼠准备一块敷料，每块薄膜之间夹一张纸巾。</li>
	<li>将所有手术器械与一叠12 × 12英寸的软木板、纱布和棉签一起灭菌。</li>
</ol>
2. 小鼠准备
<ol>
	<li>使用 2% 异氟烷诱导麻醉。称量动物体重。</li>
	<li>在专用手术准备区域，用电剃刀剃除小鼠左侧胸壁及颈部区域的毛发。</li>
	<li>在小鼠眼睛上涂抹一滴人工泪膏。</li>
	<li>用氯己定和异丙醇对颈部和左侧胸壁进行去污处理，重复两次。</li>
</ol>
3. 小鼠口-气管插管与机械通气
<ol>
	<li>让非无菌手术技术人员将小鼠仰卧放置于预热的手术区域。</li>
	<li>通过记录足垫夹捏无反应来确认麻醉深度。</li>
	<li>洗手并穿戴手术服、口罩和帽子后，戴上无菌外科手套。</li>
	<li>铺巾并采用无菌技术后，在颈部前正中做一长约1 cm的纵行切口，暴露喉部。用弯曲带齿的10 cm镊子轻轻牵拉颈阔肌，再用直剪刀尖端撑开颈阔肌，暴露喉和气管。</li>
	<li>经口将一根22 G钝头套管针插入气管中段（图1A），并目视确认其位置（图1B）。&#160;通过啮齿类动物呼吸机（每搏225 µl，每分钟200次）输送1–3%异氟烷以维持麻醉并进行通气，压力限制设为15 cm H2O。</li>
</ol>
4. 小鼠肺叶切除术
<ol>
	<li>将小鼠置于右侧卧位，背部朝向操作者（左侧朝上）。使用自封式塑料薄膜作为无菌手术巾。在薄膜上剪开，用钝头弯剪沿第4肋间方向平行于肋骨剪出一条长约2 cm的切口。th 和 5th 肋间隙。插入钝头弯剪，将皮肤与下方的肋骨及肋间肌分离。</li>
	<li>用四个牵开器牵开皮肤，暴露一个1.5 cm × 1.5 cm的方形手术窗口（图2A将牵开器固定在软木板上。</li>
	<li>使用弯头镊向下分离至肋骨，并用弯头镊的一侧尖端进入胸腔。</li>
	<li>使用钝头显微剪，用下侧刀片插入胸腔。在肋骨之间做一个0.5 cm的切口，并朝相反方向重复操作。</li>
	<li>使用另外两个牵开器，沿前后轴打开胸腔，并将牵开器固定在软木板上图2B).</li>
	<li>使用左手持弯头钝头镊，夹住左肺，并通过开胸切口将左肺上部向外侧和尾侧移位，直至暴露左肺动脉和支气管（图3A、B).</li>
	<li>右手持装有钛合金血管微型夹的施夹器，施夹器主体置于掌心，弯曲的尖端朝向掌心外侧图3C），将施用器尖端沿左肺后缘的曲率滑入胸腔，并夹闭左支气管和肺动脉（图3D).</li>
	<li>移除施用器，但保持左肺处于牵拉状态。右手持钝头显微剪，于夹闭处远端剪断支气管和肺动脉，随后取出左肺图3E).</li>
	<li>移除肋骨牵开器。</li>
	<li>使用弯头钝性镊子夹起切口下方但位于膈肌水平之上的约1厘米皮肤，将24 G套管针穿过皮肤插入左侧胸腔图&#160;4A,B).</li>
	<li>使用5-0 Prolene缝线在4周围缝合两针间断缝线th 和 5th 肋骨以闭合胸腔。</li>
	<li>移除皮肤牵开器。使用两把镊子将切口处的皮肤边缘对齐，并用胶水闭合皮肤。</li>
	<li>将一个3 ml鲁尔锁注射器连接至套管针，通过轻柔抽吸并回撤套管针以排除残留空气。</li>
	<li>使用两把镊子像之前一样将颈部切口粘合闭合。</li>
</ol>
5. 小鼠假性肺切除术
<ol>
	<li>按照“小鼠肺叶切除术”方案暴露左肺。用弯头钝性镊子抬起肋骨，使空气进入左侧胸腔（图5A,B).</li>
	<li>将24 G套管针插入左侧胸腔，操作同上，注意避免损伤左肺。</li>
	<li>使用5-0 Prolene缝线，并注意避免刺穿肺组织（图5C），将两段缝合材料放入 3rd/4th 和 5th/6th 肋间隙图5D）。在打结前先将两段缝合材料放置到位，以降低左肺疝出的风险。打结形成两个间断缝合（图5E).</li>
	<li>将皮肤粘合于胸部切口处，用套管针抽出残余空气，再按上述方法粘合颈部切口。</li>
</ol>
6. 复苏、镇痛与恢复
<ol>
	<li>关闭异氟烷，皮下注射0.1 mg/kg的丁丙诺啡和0.5 ml的生理盐水。</li>
	<li>当自主呼吸恢复后，拔除气管插管。</li>
	<li>观察小鼠直至其能够自主活动。通常在拔除气管插管数分钟后开始行走。</li>
	<li>将小鼠置于27 °C的培养箱（加湿，25%氧气）中过夜恢复。 
	注意：术后24小时内，我们在笼底放置数块用水润湿的饲料颗粒。</li>
	<li>术后连续三天，每天两次通过腹腔注射给予0.1 mg/kg的丁丙诺啡。操作动物时注意避免打开手术部位。</li>
</ol>
7. 小鼠监测
<ol>
	<li>术后第1、3、5和7天称量小鼠体重。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

我们提供了迄今为止关于小鼠PNX及小鼠假性PNX操作程序最详尽的描述。我们已向读者指出了学习该操作过程中研究者常遇到的若干常见问题，并概述了本实验室为避免这些问题而开发的多种技术方法。其他使用该模型的实验室可能已发展出其他技术改进方法或使用不同的仪器。在评估不同技术之间的差异时，研究者需自行判断这些差异是否会对实验结果产生显著影响。
小鼠单侧肺切除（PNX）的代偿性肺生长模型相较于其他肺修复与再生动物模型具有诸多优势。首先，目前可获得的大量转基因小鼠品系使得大多数实验室能够开展谱系示踪、基因过表达以及常规的靶向基因敲除实验16。其次，用于定量评估肺泡再生的形态计量学技术已有详尽描述17。第三，采用该模型的成本适中。这些手术操作所需的专用设备仅有血管夹施加器和钝头Cohan-Vannas弹簧剪。其余所有器械通常均可在小鼠外科手术包中获得，或可通过小鼠外科核心设施获取。第四，随着操作经验的积累，小鼠PNX及假手术（sham PNX）操作相对快捷，可在同一天内完成多台手术。最后，与其它动物模型相比，小鼠体型较小、饲养条件要求较低，且繁殖简便，因...

肺的主要功能是实现机体与大气之间的氧气和二氧化碳交换。在人类中，多种先天性和后天性病症可导致肺表面面积减少，进而引起肺功能受损。尽管临床上已采用吸入性糖皮质激素、支气管扩张剂、补充氧气以及长期机械通气等多种疗法来减轻肺功能受损所带来的后果1-3理想的治疗方法应能促进功能性肺组织的再生—— 即， 肺再生
哺乳动物组织再生已有充分记录。非洲刺毛鼠能够在不形成疤痕的情况下再生大面积皮肤4。人类远端指骨在损伤或截除后可再生5-7。肺切除术（PNX）后，小鼠8、大鼠9、狗10和人类11均会发生补偿性肺生长。根据定义，补偿性肺生长不仅包括现有肺泡腔的扩张，还包括这些扩大的肺泡腔重新分隔，并伴随相关微循环的扩展12。基因表达分析表明，该模型重现了肺发育过程中的许多信号事件13。小鼠肺切除术后四周，肺泡表面积可恢复至与假手术动物相当的水平14。在本论文中，我们描述了小鼠肺切除术及假手术操作的具体步骤。

<table><tbody><tr><td>6 英寸血管夹施加器</td><td>Teleflex Medical (WECK)</td><td>137062</td><td></td></tr><tr><td>Horizon 小型钛合金红色夹子</td><td>Teleflex Medical (WECK)</td><td>1201</td><td></td></tr><tr><td>窄型 12 cm 弯曲镊子</td><td>Fine Science Tools</td><td>11003-12</td><td></td></tr><tr><td>带锯齿的 10 cm 弯曲 Graefe 镊子</td><td>Fine Science Tools</td><td>11052-10</td><td></td></tr><tr><td>Castroviejo 持针器</td><td>Fine Science Tools</td><td>12565-14</td><td></td></tr><tr><td>直型 9 cm 斜视剪刀（钝头）</td><td>Fine Science Tools</td><td>14075-09</td><td></td></tr><tr><td>直型 8.5 cm 硬质精细剪刀</td><td>Fine Science Tools</td><td>14090-09</td><td></td></tr><tr><td>直型钝头 Cohan-Vannas 弹簧剪刀</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-12</td><td></td></tr><tr><td>皮肤胶</td><td>Gluture</td><td>32046</td><td></td></tr><tr><td>22 G 血管导管</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>24 G 血管导管</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>3 ml 鲁尔锁注射器</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>4 个短牵开器</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2 个长牵开器</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5-0 Prolene 缝线配弯曲切割针</td><td>Ethicon</td><td>8698G</td><td></td></tr><tr><td>0.5 ml 注射器配 27 G 针头</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>生理盐水</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>丁丙诺啡</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Press-n-Seal 保鲜膜</td><td>Glad Products Company</td><td></td><td></td></tr><tr><td>12 x 12 英寸软木板堆</td><td>Office Depot</td><td></td><td></td></tr><tr><td>70% 乙醇</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>聚维酮碘</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>小鼠呼吸机</td><td>Hugo Sachs Elektronnik</td><td>Minivent Type 845</td><td></td></tr><tr><td>异氟烷蒸发器</td><td>OHMEDA</td><td>Excel 210 SE</td><td></td></tr><tr><td>人工泪液软膏</td><td>Puralube</td><td>NDC: 17033-211-38</td><td></td></tr></tbody></table>

小鼠肺叶切除补偿性肺生长模型

Mouse Pneumonectomy Model of Compensatory Lung Growth

在人类中，受损肺组织的修复和重塑过程受阻会导致多种急性和慢性肺部疾病，最终可能引发残疾或死亡。基于损伤的肺修复与再生动物模型受限于特定损伤引发的反应，难以区分与损伤反应及损伤消退相关的变化和与肺修复及肺再生相关的变化。然而，利用动物模型识别这些修复和再生信号通路，对于开发旨在改善肺损伤后肺功能的新疗法至关重要。小鼠肺切除模型利用代偿性肺生长来分离出与修复和再生相关的信号，从而更清晰地界定肺泡再分隔的机制。本文中，我们描述了进行小鼠肺切除术和假手术（sham pneumonectomy）的技术方法。该技术可与谱系示踪或其他转基因小鼠模型联合使用，以阐明肺修复与再生的分子和细胞机制。

PNX小鼠与假手术小鼠体重变化曲线见图6。据我们观察，PNX组与假手术组小鼠的存活率均稳定在95%–100%。关于该模型中右肺再生过程及预期时间进程的详细描述，可参考Gibney et al.15 和 Wang et al.14 的相关文献。
为了成功实施小鼠部分肺切除术（PNX）和小鼠假性肺切除术，必须避免一些常见的错误。
气管插管：许多学习小鼠肺切除（PNX）技术的研究人员在进行气管插管时存在困难。由于小鼠的喉部位置靠前，气管导管必须穿过声带，因此导管容易误入食管。如图1A所示，钝头导管应尽可能向前倾斜，沿中线贴合舌体的曲度进入，然后轻柔施压将其送入气管。应通过视觉确认导管位于气管中段位置（图1B）。可通过轻轻左右移动导管并观察气管是否随之移动，以确认导管是否正确置于气管内。正确置管的另一确认方式是观察到双侧胸廓起伏。下文将介...

小鼠肺切除术是研究代偿性肺生长的常用模型。该手术可与谱系示踪或转基因小鼠模型结合使用，以阐明其潜在机制。

在人类中，受损肺组织的修复和重塑过程若受到破坏，可导致多种急性和慢性肺部疾病，最终可能引发……

该手术的目的是通过切除左肺，诱导右肺产生代偿性生长。手术首先进行左胸切开术，暴露左肺门。第二步是结扎左肺门和左肺动脉。第三步是切除左肺。最后一步是关闭开胸切口。小鼠肺切除后的代偿性肺生长模型可与其他生物测量或生化技术结合使用，以阐明肺泡生长与再生的机制。该方法可以解答肺发育与再生研究领域中的一些关键问题，例如：参与肺泡隔形成的细胞过程有哪些？以及重新启动肺泡隔形成所必需的关键细胞分子过程是什么？通常，初次接触该技术的研究人员会在若干关键步骤上遇到困难，例如可能在气管插管时出现操作困难。他们可能在创建合适的手术窗口时遇到困难。可能难以辨认肺门并进行夹闭，同时在假开胸过程中也可能难以避免对左肺造成损伤。本实验操作将由本实验室的高级实验技术员 Shang Lu 进行演示。首先，在使用 2% 异氟烷对小鼠实施麻醉后，用电剃刀剃除小鼠左侧胸壁及颈部区域的毛发，将人工泪膏涂抹于小鼠眼部以保护角膜，随后用氯己定擦拭局部区域三次，再用异丙醇擦拭三次，最后再次使用氯己定进行消毒。三次。在颈前正中做一厘米垂直切口以暴露喉部后，通过记录对强烈夹捏无反应来确认麻醉深度，使用10厘米带齿镊子轻轻牵拉带状肌，然后用直剪刀的尖端分开带状肌。接下来，经口将一根22号钝头导管插入气管中部，并通过切口处目视确认其位置。将小鼠置于啮齿类动物呼吸机上，以2%异氟烷维持麻醉，压力限值设为15厘米水柱。将仍处于麻醉状态的小鼠置于右侧卧位，背部左侧朝向操作者。将自封式塑料保鲜膜覆盖在小鼠体表作为无菌手术巾。使用钝头弯剪刀在第四和第五肋间区域沿肋骨方向做一条长约2厘米的切口。然后插入剪刀尖端，分离皮肤与其下方的肋骨及肋间肌。在皮肤上放置四个牵开器，形成一个 1.5 × 1.5 厘米的手术窗口。将每个牵开器固定在软木板上。使用弯头镊子分离至肋骨，然后钝性分离肋间组织。为了暴露第四和第五肋骨，使用一把弯头镊子的尖端在胸腔上穿孔以进入胸腔。然后使用一对钝头显微剪刀的下侧刀片沿切口向下按压，直至下侧刀片进入胸腔。在肋骨之间做一道0.5厘米的切口，然后朝相反方向重复操作。然后，插入两个牵开器并将其固定在软木板上，沿前后轴切开胸腔。现在装入微型夹钳施加器。接下来，用非优势手持握弯头钝头镊子，夹住左肺，并通过开胸切口将上部向外侧和下方移位，直至暴露左肺动脉和支气管。然后用主手握住已装入钛金属血管微型夹的施夹器，将施夹器主体置于掌心，弯曲端朝向掌心外侧。沿左肺后缘的弧度将施夹器头端滑入胸腔，夹闭左支气管和肺动脉。取出施夹器，但保持左肺处于牵拉状态。用右手持钝头显微剪，剪断血管夹远端的支气管和肺动脉，摘除左肺。取出肺组织后，移除肋骨牵开器。然后用弯头钝性止血钳在切口下方、但位于膈肌水平上方约一厘米处夹起皮肤，将24号血管导管经皮肤插入左侧胸腔内。接下来，在第四和第五肋骨周围放置两针5-0丙烯酸缝线（间断缝合）。为关闭胸腔，移除皮肤牵开器，使用两把镊子将切口全长的皮肤对合，并使用组织粘合剂将皮肤粘合闭合。最后，将一支3毫升螺口注射器连接至血管导管，通过轻柔抽吸去除残余空气，同时撤出血管导管。通过使用两把镊子夹住颈部，以与闭合胸腔切口相同的方法进行缝合来完成操作。在暴露麻醉小鼠的左肺后，如前所述，使用弯头钝性镊子抬起肋骨，使空气进入左侧胸腔，将24G激光血管导管插入左侧胸腔，操作时注意避免损伤左肺。使用5-0普罗琳缝线缝合，注意避免穿刺肺组织。将两段缝合材料分别置入第三与第四肋以及第五与第六肋之间的间隙。在打结前先放置两段缝合材料，以降低左肺疝出的风险。结扎缝合材料，形成两个间断缝合。将皮肤粘合于胸部切口处。用血管导管去除残余空气，并按先前所示方法粘合颈部切口。关闭异氟烷，皮下注射0.1毫克/千克的丁丙诺啡和0.5毫升生理盐水。当自主呼吸恢复时，移除气管插管。观察小鼠直至其能够自主行走。通常在移除气管插管数分钟后恢复行走。术后3天内，每天两次通过腹腔注射给予0.1毫克/千克的布托啡诺。在此3天期间密切监测动物状况，操作动物时注意避免打开手术部位。此图像显示术后体重下降情况。术后24小时， pneumo somy 小鼠平均减重1.5克，假手术小鼠平均减重1.1克。两组小鼠均在术后第三天恢复至术前体重。此荧光图像显示了在对照条件下副叶的tropo elastin免疫荧光染色结果。此处显示了气管切开术后72小时副叶的Tropo弹性蛋白免疫荧光图像，可见原有气腔增大。这幅最终的TRO弹性蛋白免疫荧光图像显示了气管切开术后四周的副叶。请注意叶的生长与反应。观看本视频后，您应能充分了解如何实施小鼠肺叶切除模型以研究代偿性肺生长，以及如何实施假开胸术，后者在此过程中作为对照操作。

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补偿性增长龙鼠标肺切除型号

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小鼠肺叶切除补偿性肺生长模型

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