Name: 选择性的mRNA翻译在哺乳动物细胞中的核糖体性能分析评估 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min
Description: 学习多核糖体分析技术以评估哺乳动物细胞中mRNA的选择性翻译效率。该方法利用蔗糖梯度超速离心分离多聚核糖体，结合实时定量PCR检测应激条件下的翻译调控机制。

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我们感谢实验室过去和现在的成员，特别是 Urszula Liwak，在多核糖体分析方案方面的关键性讨论以及数据共享。本研究工作得到了加拿大卫生研究院、癌症研究学会以及加拿大自然科学与工程研究理事会向 MH 提供的运营基金资助。MDF 获得了加拿大范尼尔研究生奖学金博士奖和安大略省研究生奖学金的支持，本工作构成了她博士学位论文的一部分。

注意：关于RNA操作的说明：采取标准预防措施，防止RNase导致RNA降解。在实验方案的所有步骤中，均应佩戴手套，使用带滤芯的移液器吸头、无RNase的塑料耗材和试剂。所有溶液均使用超纯水或经DEPC处理的水。根据制造商的操作说明，使用RNase失活溶液对任何可能污染的表面进行去污染处理。
1. 溶液的配制。
<ol style="margin-left: 40px;">
	<li>配制 500 ml 基础溶液（0.3 M NaCl；15 mM MgCl2.6H2O；15 mM Tris-HCl，pH 7.4）。使用磁力搅拌器搅拌至溶液澄清，并通过 0.45 µm 滤膜过滤。室温保存。</li>
	<li>按以下步骤配制 10% 和 50% 蔗糖溶液以及 60% 追踪溶液：
	<ol>
		<li>配制 10% 蔗糖溶液（w/v）：在 50 ml 离心管中加入 5 g 蔗糖，用基础溶液定容至 50 ml。配制 50% 蔗糖溶液（w/v）：在 50 ml 离心管中加入 25 g 蔗糖，用基础溶液定容至 50 ml。</li>
		<li>配制 60%（w/v）追踪溶液：在 50 ml 离心管中加入 30 g 蔗糖，用基础溶液定容至 50 ml。向 60% 追踪溶液中加入 100 µl 饱和溴酚蓝溶液（将溴酚蓝加入水中直至不再溶解；离心以沉淀未溶解的粉末）。使用涡旋振荡器混匀，并确认完全溶解。</li>
		<li>将溶液储存于 4 °C，待用时取出。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>配制 RNA 裂解缓冲液。该缓冲液需在实验当天新鲜配制。每份样品需准备 500 µl RNA 裂解缓冲液。向 1 ml 基础溶液中加入 10 µl Triton X-100（终浓度 1% [v/v]）、1 µl DMSO 溶解的 100 mg/ml 放线菌酮（CHX，终浓度 0.1 mg/ml）和 3.5 µl RNasin（140 U/ml）。使用涡旋振荡器混匀。置于冰上保存。 
	注意：放线菌酮具有高毒性，可能引起突变。避免皮肤接触和吸入。为减少频繁操作粉末，可预先配制较大体积的 100 mg/ml DMSO 储存液，分装后于 -80 °C 长期保存，工作液保存于 -20 °C。</li>
	<li>实验当天，通过向所需体积的 10% 和 50% 蔗糖溶液（每梯度约 7 ml）中加入 CHX（终浓度 0.1 mg/ml），配制含 CHX 的蔗糖溶液。</li>
</ol>
2. 使用自动梯度混合仪制备蔗糖梯度
<ol style="margin-left: 40px;">
	<li>打开梯度生成仪的电源，并将用于放置梯度的托盘调至水平（关键步骤！）。当托盘调平后，点击“Done”。</li>
	<li>在菜单中选择要运行的梯度程序：
	<ol>
		<li>按下“GRAD”菜单，然后选择“LIST”。</li>
		<li>选择“SW41”。</li>
		<li>滚动列表，通过按下“RUN”按钮选择“10 - 50% gradient - 11 steps”程序。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将一个锥形超速离心管（SW-41 管，14 × 89 mm）放入标记块中，并使用提供的细管标记笔沿标记块的上台阶在管壁上画一条标记线。将标记好的离心管放置在稳定台面上的适配架中。 
	注意：此标记线将作为分层加入 10% 和 50% 蔗糖溶液时的填充参考线。</li>
	<li>将两个提供的套管连接到两个 10 ml 注射器上，并用含有 RNase 失活液的温蒸馏水反复抽吸清洗。之后务必彻底清除所有残留水分。</li>
	<li>用 10% 蔗糖+CHX 溶液填充其中一个注射器，将套管插入超速离心管底部。缓慢挤出 10% 蔗糖溶液，直至液面刚好超过管壁上的标记线。 
	注意：避免产生气泡。若出现气泡，请轻轻敲击离心管以驱除气泡。</li>
	<li>用 50% 蔗糖+CHX 溶液填充另一个注射器，用擦拭纸擦去多余液体后，将套管轻轻插入超速离心管底部。缓慢挤出 50% 蔗糖溶液，直至液面恰好达到标记线。然后迅速而平稳地抽出套管。 
	注意：此时 10% 蔗糖溶液应上升并在管顶形成弯月面。若未形成，需在液面处补加少量 10% 蔗糖溶液。</li>
	<li>略微倾斜超速离心管，插入所提供的盖帽，同时排出所有气泡。使用微量移液器移除盖帽储液腔中的多余液体。</li>
	<li>擦去管壁外的多余液体，将离心管放置于梯度生成仪的托盘上。</li>
	<li>按下“RUN”按钮。 
	注意：托盘将按设定角度倾斜，暂停 5 秒后开始旋转，以形成梯度。</li>
	<li>当梯度形成完成后（约 2 分钟，仪器会发出提示音），小心取下超速离心管（或离心管组），放入支架中，并迅速向上拔出盖帽，避免扰动梯度。</li>
	<li>将梯度管置于冰上保存，切勿扰动！或者，也可在 4 °C 下保存过夜。</li>
	<li>或者，可使用双室梯度生成器按以下步骤制备梯度：
	<ol>
		<li>用 RNase 失活液和无 RNase 水冲洗梯度生成器的管路和装置。</li>
		<li>向梯度生成器的近端室加入 5 ml 的 50% 蔗糖+CHX 溶液，并确保两室之间的空气完全排出。</li>
		<li>向梯度生成器的远端室加入 5 ml 的 10% 蔗糖+CHX 溶液。</li>
		<li>向一个锥形离心管（SW-41 管，14 × 89 mm）底部加入 0.5 ml 的 50% 蔗糖+CHX 溶液，并将其放入管架中。</li>
		<li>启动近端室中的搅拌器，打开活塞，以“3”档速度（约 1 ml/min）开始沉积梯度。</li>
		<li>将制备好的梯度管置于冰上，避免扰动。 
		注意：梯度可在 4 °C 下保存过夜。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 细胞裂解与超速离心。
<ol style="margin-left: 40px;">
	<li>将SW-41转子和离心管置于4 °C预冷，并将离心机温度设为4 °C。 
	注意：细胞裂解步骤针对每梯度使用两个150 mm培养皿的亚融合状态（约70–80%融合度）HEK293细胞进行了优化，不同细胞系可能需要调整相应体积。</li>
	<li>在裂解前至少24小时，以适当的细胞密度将细胞接种于生长培养基中。</li>
	<li>准备一份含0.1 mg/ml CHX的生长培养基（每150 mm培养皿20 ml）。</li>
	<li>将细胞在含CHX的培养基中（每150 mm培养皿20 ml）于37 °C/5% CO2条件下孵育3分钟，以阻断并稳定多聚核糖体。</li>
	<li>迅速操作，吸除培养皿中的培养基，将培养皿置于冰上，用10 ml预冷的含CHX（终浓度0.1 mg/ml）磷酸盐缓冲液（PBS：137 mM NaCl，2.7 mM KCl，10 mM Na2HPO4 ，1.8 mM KH2PO4）洗涤细胞一次，注意沿培养皿壁缓慢加样，避免吹起细胞单层。</li>
	<li>吸除PBS，向每个培养皿中加入额外10 ml PBS+CHX，用细胞刮刀刮下细胞，并将两个培养皿的全部液体转移至冰上的50 ml离心管中。保留1 ml细胞悬液于微量离心管中置于冰上，用于后续蛋白质分析。</li>
	<li>将50 ml离心管中的细胞在4 °C、300 × g条件下离心10分钟。</li>
	<li>彻底去除PBS，将沉淀重悬于500 µl预冷的RNA裂解缓冲液中。</li>
	<li>将细胞悬液转移至2 ml微量离心管中。</li>
	<li>反复吹打以裂解细胞，冰上孵育10分钟，期间偶尔涡旋震荡。</li>
	<li>在4 °C、2,000 × g条件下离心5分钟，沉淀细胞核。</li>
	<li>将上清液转移至新的2 ml微量离心管中。</li>
	<li>在4 °C、17,000 × g条件下离心5分钟，沉淀细胞碎片。</li>
	<li>将上清液转移至新的2 ml微量离心管中，取2 µl测定260 nm处的光密度值（以裂解缓冲液作为空白对照）。</li>
	<li>从每个样品中取出50 µl（总量的10%）用于总RNA分析。注意：裂解物可保存于-80 °C直至使用。</li>
	<li>将等量A260单位的样品小心加载至各蔗糖梯度中（最少10 OD，最佳25 OD，最大体积500 µl；如需，可用额外裂解缓冲液稀释浓缩的裂解物）。</li>
	<li>超速离心前确保各梯度间重量差异不超过0.1 g。</li>
	<li>在4 °C条件下，以39,000 rpm（260,343 × g）离心1.5小时。</li>
	<li>离心过程中保持转子刹车开启，在减速至1,000 rpm时关闭刹车。 
	注意：此步骤可最大限度减少因刹车时电刷接触转子导致的加速度突变对梯度造成的扰动。</li>
</ol>
4. 梯度分馏系统仪器设置。
<ol style="margin-left: 40px;">
	<li>按照以下步骤设置仪器，并用水作为空白对照校准分光光度计：
	<ol>
		<li>打开仪器各组件，使光源预热至少15分钟。</li>
		<li>确保馏分收集器设置为“多聚核糖体（polysome）”方法（按文件夹图标两次，再按返回箭头两次以返回主界面）。</li>
		<li>确保馏分收集器上的阀门处于废液位置（箭头指向垃圾桶图标）。在废液收集管下方放置一个盛有蒸馏水的250 ml锥形瓶。</li>
		<li>在图表记录仪上选择以下设置：将灵敏度旋钮设为“SET LAMP AND OPTICS”；噪声滤波开关设为“1.5”；峰分离旋钮设为“OFF”；走纸速度旋钮设为“30 cm/hr”（即5 cm/10 min）；将分光光度计单元顶部的基线调节旋钮（Baseline Adjust dial）设为“MAX OPEN”。
		 
		注：可选：可使用数字记录软件替代图表记录仪。在计算机上点击“开始”，将弹出采集窗口：在“Options”菜单中取消勾选“Pause graphics”；在“Scaling”中将图形范围设为-10至100（可在运行过程中动态调整）；点击“Save”按钮创建新文件并开始记录运行数据。</li>
		<li>将注射器和针筒装入泵中，并使用提供的螺丝和内六角扳手拧紧固定。
		 
		注：切勿过度拧紧。</li>
		<li>使用“REV”指令以“RAPID”速度将追洗液（Chase Solution）吸入注射器。将泵置于直立位置，使用“FORWARD”指令将管路中的空气排出。此功能及清洗步骤仅使用“RAPID”模式。</li>
		<li>安装一支装有无RN酶水的超速离心管。</li>
		<li>用套管刺穿超速离心管，直至看到两个黑色标记（出液孔位于这两个标记之间），然后将注射泵设为“Manual”模式并以6.0 ml/min启动。</li>
		<li>当水流经流通池时（追洗液填充离心管约1/3时），切换至可变速度模式，并将流速设为1.0 ml/min。</li>
		<li>在1.0 ml/min的流速下，调节分光光度计上的基线调节旋钮，使图表上的电压读数为零（±0.5单位范围内）。
		 
		注：观察废液管中流出的水是否进入锥形瓶。</li>
		<li>将所需的灵敏度设为“0.5”或“1.0” AU。
		 
		注：对于10 ml梯度中10 OD单位的样品，1.0 AU灵敏度效果最佳。若OD值低于10，可使用“0.5”灵敏度以增强信号。</li>
		<li>按下自动基线（Auto Baseline）按钮，并通过调节记录仪偏移旋钮（Recorder offset dial），将基线设定在图表记录仪的10%刻度位置（若使用数字记录仪则此步骤可选）。</li>
		<li>当获得稳定基线后，若使用模拟图表记录仪，则将泵开关调至“OFF”，并将走纸速度旋钮调至60 cm/hr；若使用数字记录仪，则将泵开关和走纸速度均设为“OFF”。</li>
		<li>通过将泵切换至“REV”位置，回收追洗液（如有需要，可将流速调回6.0 ml/min……切勿使用RAPID模式），直至液体到达穿刺套管的第一个标记处。</li>
		<li>取下离心管，通过少量追洗液流经套管以排出其中可能存在的气泡。清洁穿刺部位。
		 
		注：少量残留水可能从流通池中渗出。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 梯度分馏与样品收集。
<ol style="margin-left: 40px;">
	<li>安装并刺穿含有蔗糖梯度的离心管。</li>
	<li>将十一支 2 ml 微量离心管放入分部收集器托盘的 1–11 号位置，确保管盖不向上突出。暂时用“废液管”替换“第 1 号管”，以收集分部收集管路中残留的液体。</li>
	<li>将泵控制旋钮设为“手动”模式，并将注射泵的流速设为“6.0 ml/min”。</li>
	<li>按下分部收集器上的“播放”图标。当机械臂到达第一支管时，立即按下“暂停”按钮（这将定位机械臂并打开分部收集阀）。</li>
	<li>使用“前进”命令启动泵，并观察记录仪笔。当笔迹开始向上偏转时（表明样品正通过分光光度计的流动池），迅速将“废液管”更换为“第 1 号管”。</li>
	<li>当第一滴液体被收集后，迅速将命令切换至“远程启动/停止”、“可变（1.0 ml/min）”，然后按下“播放”图标。 
	注意：此时泵由分部收集器界面控制，每分钟将收集 1 ml 的组分。</li>
	<li>从此刻起，A260 读数将显示在数字记录仪界面（或模拟图表记录仪）上。请确保软件上的“记录”按钮已被按下！</li>
	<li>当蓝色洗脱液进入收集管或最后一支管（通常为第 11 号管）时，按下“停止”图标。 
	注意：分配阀应切换至废液阀。</li>
	<li>在所有梯度完成分部收集前，始终将组分置于冰上。当天实验结束后，组分可在进行蛋白质或 RNA 提取前储存于 -80 °C。若需同时进行蛋白质和 RNA 分析，可将每份组分均分为两份（各 500 µl，分别用于蛋白质和 RNA 分析）。</li>
</ol>
6. 清洗
注意：（仅当需要收集多个梯度时才执行此可选步骤）。
<ol style="margin-left: 40px;">
	<li>将废液管浸入含有约 50 ml 超纯水的锥形瓶中，并以 6 ml/min 的流速反转泵运行。</li>
	<li>当冲洗液到达穿刺针管的第一个刻度线时，停止泵运行。</li>
	<li>取下离心管，排出针管中的任何残留空气，并清洁穿刺装置。 
	注意：流路池可能会有少量残留水泄漏。</li>
	<li>从步骤 5.1 开始重复分级操作程序。</li>
</ol>
7. 最终清理。
<ol style="margin-left: 40px;">
	<li>将泵管从穿刺针底部断开，并使用快速流速设置将Chase Solution泵入一个50 ml离心管中。将Chase Solution储存于4 °C，因其可重复使用。</li>
	<li>将泵管连接至三通管路系统，并关闭通向注射器的阀门。将一根管路连接至装有蒸馏水的50 ml注射器，另一根管路连接至穿刺针底部。</li>
	<li>安装用于空白步骤的超速离心管，并通过分光光度计和收集管至少流过50 ml蒸馏水（在界面上点击“开始/暂停”图标，切换至收集菜单）。</li>
	<li>拆下离心管、注射器（使用内六角扳手拆卸螺丝）以及所有其他可拆卸部件，先用温自来水彻底清洗，再用超纯水冲洗。 
	注意：清洗活塞、筒体、管路和穿刺套管时需格外小心。 
	注意：请小心操作玻璃注射器筒体！将所有部件存放于无尘环境中。</li>
	<li>用沾有蒸馏水的软纸巾擦拭流通池底部。清洁馏分收集器托盘及任何可能溅到蔗糖的区域。</li>
</ol>
8. 从蔗糖组分中分离 RNA。
<ol style="margin-left: 40px;">
	<li>每1 ml蔗糖组分准备50 µl蛋白酶K溶液（37.5 µl 10% SDS，7.5 µl 0.5 M EDTA，1 µl Glycoblue，4 µl 20 mg/ml蛋白酶K）。</li>
	<li>在2 ml平底管中，将1 ml蔗糖组分与50 µl蛋白酶K溶液于55 °C孵育1小时（若使用500 µl组分，则相应调整蛋白酶K溶液的体积）。</li>
	<li>向蔗糖组分中加入等体积的苯酚:氯仿:异戊醇（125:24:1，建议使用酸性（pH 4.5）以减少DNA污染）。 
	注意：向第7–10组分中额外加入200 µl氯仿，因其密度较大，可能导致相分离倒置。 
	注意：苯酚/氯仿接触或吸入可引起灼伤。操作时须穿戴实验服、安全护目镜，并在通风橱中进行。</li>
	<li>涡旋混匀约30秒，室温下以最大转速离心5分钟。</li>
	<li>移取约80–90%的水相（避免触及可能含有基因组DNA的中间层），转移至新管中。</li>
	<li>加入等体积氯仿，重复步骤8.4。</li>
	<li>小心移取水相，避免接触中间层。</li>
	<li>加入1/10体积的3 M醋酸钠（pH 5.2）（也可使用5 M醋酸铵替代）。</li>
	<li>加入1.5倍体积的预冷无水乙醇，涡旋15秒。</li>
	<li>于-20 °C沉淀过夜（若时间紧迫，可于-80 °C沉淀1小时）。 
	注意：若需要，样品可在-20 °C保存更长时间。</li>
	<li>4 °C下以最大转速离心30分钟。</li>
	<li>用1 ml预冷无RNase的70%乙醇洗涤沉淀。</li>
	<li>将沉淀空气干燥，并溶于20 µl无RNase的水中。</li>
	<li>通过分光光度法测定总RNA浓度，以确保产量和纯度（基于A260/280比值），随后使用各组分等体积样品及针对目标mRNA的特异性PCR引物进行标准RT-qPCR分析14。</li>
</ol>
9. 从蔗糖组分中分离蛋白质。
<ol style="margin-left: 40px;">
	<li>除了RNA外，还可以从各个多聚核糖体组分中分离和鉴定蛋白质。请选用多种已有的优质蛋白质分离方案之一进行操作， 例如 18.</li>
</ol>

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<li>Ingolia, N. T., Brar, G. A., Rouskin, S., McGeachy, A. M., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ribosome+profiling+strategy+for+monitoring+translation+in+vivo+by+deep+sequencing+of+ribosome-protected+mRNA+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">The ribosome profiling strategy for monitoring translation in vivo by deep sequencing of ribosome-protected mRNA fragments.</a> Nat Protoc. 7 (8), 1534-1550 (2012).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

多聚核糖体分析是一种强大的技术，可用于定量不同处理条件下特定转录本的翻译状态。该技术原理上非常简单，但实际操作涉及多个步骤，其中一些步骤对于获得良好的多聚核糖体图谱至关重要。这些关键步骤包括：1）使用无RNase的试剂和塑料耗材；2）制备优质的蔗糖梯度（根据我们的经验，10-50%的蔗糖梯度最有利于有效分辨40S/60S亚基以及结合有核糖体的mRNA）；3）使用处于指数生长期且融合度不超过80%的细胞，以捕获最高的翻译速率。在进行长时间细胞处理（如基因敲低或过表达）时，应特别注意最后一个步骤，即铺板细胞的数量需根据实验终点时细胞的融合度来确定。
在本研究呈现的结果中，多聚核糖体图谱分析是评估PDCD4在含有IRES的mRNA（如XIAP和Bcl-xL）翻译调控中作用的重要工具12。我们发现，在PDCD4敲低后，总体多聚核糖体图谱未发生明显变化（图1B），由此可得出结论：在本实验条件下，PDCD4并不影响细胞整体的蛋白质翻译。接下来，我们采用RT-qPCR分析，检测在PDCD4或对照siRNA处理的细胞中，XIAP和Bcl-xL mRNA的分布情况。相较于标准RT-PCR或Northern印迹法，qPCR是分析多聚核糖体图谱的首选方法，因为它能够对mRNA分布进行定量而非半定量分析，并可检测不同处理间翻译效率的细微变化。利用该技术，我们发现，在PDCD4敲低后，XIAP和Bcl-xL mRNA的分布（以梯度中占总靶mRNA的百分比表示）显著向重多聚核糖体（即结合大量核糖体的mRNA）区域偏移（图1D、E），表明这些mRNA的翻译水平升高。这一结果进一步通过XIAP和Bcl-xL蛋白水平的升高得以证实，而其稳态RNA水平则未发生变化（图1F、G）。值得注意的是，非IRES型XIAP mRNA在处理组与未处理组细胞间的多聚核糖体分布无变化（图1C）。此外，翻译效率也可表示为多聚核糖体组分（通常为第5至10组分）与单核糖体组分（通常为第2至4组分）中mRNA含量的比值14。
在整个实验流程中使用对照对于验证多聚核糖体分析结果至关重要，因为仅凭254 nm处的吸光度读数所观察到的峰无法单独归因于核糖体RNA（例如Triton X-100等去污剂在此光谱区域有强烈吸收，可能掩盖梯度顶部的40S/60S峰）。必须运行不含裂解液的空白梯度和/或仅含裂解缓冲液的梯度，以确定缓冲液在254 nm处对吸光度的相对贡献。此外，人为造成的高级结构也可能导致将实际并不存在的多聚核糖体误判为存在例如 “拟多核糖体”20）。在整个实验过程中，镁离子用于稳定80S核糖体；在裂解液和梯度缓冲液中加入二价阳离子螯合剂EDTA（20 mM，处理15分钟），可螯合镁离子，导致核糖体解离为其组成的小亚基（40S）和大亚基（60S）。因此，若在260 nm处记录的吸收峰确实代表多聚核糖体（polysomes），经EDTA处理后，该图谱将发生坍塌，在梯度顶部附近仅出现一个单一吸收峰，对应于游离的mRNA和核糖体亚基（数据未显示）。与此同时，qPCR分析的所有特异性靶标也应全部出现在梯度的顶部。
与mRNA结合的核糖体数量并不总是能够指示该mRNA翻译效率的高低。事实上，在某些特定情况下，多聚核糖体上的活跃翻译可能发生停滞21,22，读者应了解这些情况。要确定转录本是否正活跃地参与翻译过程，可通过以下两种方法：a）用嘌呤霉素处理样品，与EDTA不同，嘌呤霉素可导致正在mRNA上主动移位的核糖体发生“脱离”；或b）用高哈尔满碱（homoharringtonine）处理样品，该试剂仅抑制起始密码子处第一个核糖体的移位，从而导致下游所有正在移位的核糖体发生“脱离”。
在进行qPCR分析时，使用对照转录本也至关重要。选择那些不受不同处理条件影响的转录本作为对照，例如一些看家基因（GAPDH、Actin、Tubulin、Nucleolin）、核糖体mRNA（18S、RPL13A），或在本实验中采用的XIAP IRES非IRES变体，有助于验证处理对翻译的影响是特异性的还是普遍性的。这些对照转录本可用于标准化被分析mRNA的分布情况——如本研究所示，将XIAP和Bcl-xL的mRNA水平相对于GAPDH mRNA进行归一化，并表示为各组分mRNA总量百分比（即所有组分mRNA含量之和）；或者，也可将目标mRNA与对照mRNA以绝对值形式分别表示。对输入裂解液（通常为总体积的10%）进行qPCR分析是另一个用于控制特定mRNA分布的步骤。理想情况下，输入裂解液中某一特定转录本的mRNA含量应与所分析的全部10个组分中该转录本mRNA含量的总和相当。最后，为控制苯酚:氯仿抽提步骤，可选的操作是在每个多聚核糖体组分中加入外源RNA spike-in 体外 转录的报告基因mRNA（如CAT，氯霉素乙酰转移酶），随后可通过qPCR进行定量，甚至可用于数据的标准化 14.
与任何技术一样，多聚体图谱分析也存在一些局限性。通常需要收集至少10个组分（若需更精细地检测翻译效率的变化，则可能需要20个或更多组分），才能获得理想的多聚体分布，这一步骤在实际操作中具有一定的限制性，因为为了能够方便地同时处理40个样品以及4个输入对照的RNA提取和qPCR分析，每次最多只能分析4个样本。随着待分析转录本数量以及qPCR重复次数的增加，样本量会迅速累积，导致实验成本显著上升。基于qPCR的多聚体图谱分析另一局限在于，该方法仅适用于候选基因策略（即待分析的转录本需预先已知），无法用于全基因组范围的翻译水平分析。然而，在21世纪初st 世纪，研究人员开始利用DNA微阵列在基因组水平上分析其多聚核糖体RNA 15 以及最近与下一代测序技术相结合 16,17在此强大方法中，多聚核糖体分析的步骤如本方案所述，但与对各组分进行单独qPCR分析不同，而是将单体核糖体组分（通常为第2-4组分）和多聚核糖体组分（通常为后续组分）分别合并，然后通过DNA微阵列或全基因组RNA测序分析整体翻译水平的变化。因此，该方法可评估在特定处理条件下，所有从多聚核糖体向单体核糖体转移（翻译水平下降）或反向转移（翻译水平上升）的mRNA。随后可通过qPCR对特定mRNA在多聚核糖体中的分布进行验证和定量。多聚核糖体分析原理更为强大的应用是核糖体谱分析（ribosome profiling）。最近报道了该技术的进一步高通量扩展，可同时监测数百个多聚核糖体组分。 23这在研究突变体集合的翻译效率或进行大规模RNA干扰筛选时具有明显优势。核糖体谱分析是一种利用下一代测序技术来绘制被核糖体保护的RNA片段（即核糖体足迹）的方法，这些片段来源于正在进行蛋白质合成的核糖体24,25在此技术中，可通过环己酰亚胺（可逆）或依美丁（不可逆）抑制核糖体移位，随后进行细胞裂解和RNase消化，从而获得核糖体保护片段群体。富集核糖体，提取总RNA，并去除污染性的核糖体RNA及线粒体核糖体RNA。分离长约26–28个核苷酸的RNA片段，经逆转录生成cDNA文库并进行测序。26与标准的多聚核糖体分析方法不同，该方法不仅能鉴定出在翻译水平上受到调控的特定mRNA，还能在密码子分辨率上提供针对特定mRNA的信息，例如核糖体在特定转录本上的精确占据位置和密度。这对于具有特定翻译模式的mRNA（如含有IRES的mRNA）尤其具有重要意义，因为它能够提供更详细的信息，揭示核糖体在转录本上的招募位置。

蛋白质合成（翻译）的调控是一个关键的细胞过程，与细胞存活密切相关。鉴于翻译消耗了细胞超过50%的能量，其受到严格调控且翻译过程的扰动难以被细胞耐受，这一点并不令人意外。相反，许多异常的细胞过程则需要翻译机制和翻译输出的改变以维持其功能。即 蛋白质组）需要被修饰。这种情况在多种应激反应和疾病状态下经常出现，癌症可能是其中最典型的例子。转录调控的一个关键优势在于细胞能够对外部和内部的各种刺激迅速重新编程其蛋白质表达输出，从而形成一种精细的调控机制，决定细胞存活与死亡之间的平衡1.
转录调控的两个方面尤为引人关注：一是理解介导特异性翻译的调控机制及控制元件的本质，二是鉴定参与细胞对最初引发选择性翻译的特定刺激产生应答的特定mRNA及其编码的蛋白质产物。多聚核糖体分析技术可有效用于研究这两个过程。
多核糖体分析技术的总体目标是研究并量化特定mRNA在不同细胞条件下的翻译状态。该技术的原理是通过“冻结”正在不同转录本上活跃翻译的核糖体，从而捕获mRNA的翻译过程，并在蔗糖梯度中通过超速离心分离由此形成的多核糖体，进而区分高度翻译的转录本（结合多个核糖体）与低效翻译的转录本（结合一个或两个核糖体）。在本实验方案中，使用抗生素环己酰亚胺，该抗生素可结合60S核糖体亚基，并阻止去乙酰化tRNA从核糖体E位点释放2，从而抑制核糖体的移位，使核糖体停滞在正在翻译的mRNA上。然而，也可使用其他阻断剂，例如同样可抑制翻译延伸的emetine3。
与检测翻译过程最终产物的蛋白质印迹法和35S-甲硫氨酸标记技术不同，多聚核糖体分析技术能够检测核糖体与正在活跃翻译的mRNA的结合情况，从而更详细地研究不同条件下的翻译机制。因此，该技术可轻松地用于专门研究不同的翻译模式4-6、参与翻译调控的蛋白质因子7-9、影响蛋白质合成的应激条件1,10,11，或mRNA结构（如IRES或上游开放阅读框）对蛋白质合成的影响12-14。如今，随着DNA微阵列15或高通量测序技术16,17的应用，多聚核糖体分析的应用范围进一步扩大，可用于分析与多聚核糖体结合的mRNA。

<table><tbody><tr><td>Gradient Master 108 自动梯度生成仪</td><td>BIOCOMP</td><td>107-201M</td><td></td></tr><tr><td>Auto Densi-Flow 双室梯度生成仪</td><td>LABCONCO</td><td>4517000</td><td></td></tr><tr><td>Beckman 超速离心机&amp;nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td>型号 # L-100-XP</td><td></td></tr><tr><td>密度梯度分馏仪</td><td>TELEDYNE ISCO</td><td>69-3873-246</td><td>组成：穿管系统，&amp;nbsp; 蠕动泵，UA-6 检测器（配备 254 nm 和 280 nm 滤光片）及 Foxy R1 分部收集器</td></tr><tr><td>WinDaq 数据采集软件</td><td>DATAQ INSTRUMENTS</td><td>WINDAQ/LITE</td><td>http://www.dataq.com/products/software/acquisition.htm</td></tr><tr><td>聚丙烯超速离心管（适用于 SW41，14 x 89 mm）</td><td>Beckman Coulter</td><td>331372</td><td></td></tr><tr><td>无核酸酶 2 ml 离心管（海豚鼻型）</td><td>DiaMed</td><td>PRE1900-N</td><td></td></tr><tr><td>无核酸酶 2 ml 离心管（平底型）</td><td>SafeSeal</td><td>12000</td><td></td></tr><tr><td>蔗糖（无核酸酶）</td><td>Calbiochem</td><td>573113</td><td>分子量 = 342.3 g/mol</td></tr><tr><td>环己酰亚胺</td><td>SIGMA</td><td>C7698</td><td>分子量 = 281.4 g/mol。用 DMSO 溶解后于 -80°C 长期保存。注意：有毒！可引起呼吸道和皮肤刺激。称量时请佩戴口罩。</td></tr><tr><td>氯化钠（无核酸酶）</td><td>OmniPur</td><td>7710</td><td>分子量 = 58.44 g/mol</td></tr><tr><td>MgCl₂·6H₂O（无核酸酶）</td><td>OmniPur</td><td>5980</td><td>分子量 = 203.3 g/mol</td></tr><tr><td>Tris 碱（无核酸酶）</td><td>J.T. Baker</td><td>4109-01</td><td>分子量 = 121.14 g/mol</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>OmniPur</td><td>9400</td><td>注意：有毒！可引起呼吸道和皮肤刺激</td></tr><tr><td>重组 RNasin 核糖核酸酶抑制剂</td><td>Promega</td><td>N2515</td><td></td></tr><tr><td>RNaseZap 核糖核酸酶失活溶液</td><td>Ambion, Life Technologies</td><td>AM9780</td><td></td></tr><tr><td>GlycoBlue 共沉淀剂（15 mg/ml）</td><td>Invitrogen, Life Technologies</td><td>AM9516</td><td></td></tr><tr><td>酸性苯酚:氯仿，pH 4.5（含 IAA，125:24:1）</td><td>Ambion, Life Technologies</td><td>AM9722</td><td>注意：有毒！可引起呼吸道刺激以及皮肤刺激和腐蚀</td></tr></tbody></table>

通过多聚体图谱分析评估哺乳动物细胞中mrna的选择性翻译

Assessment of Selective mRNA Translation in Mammalian Cells by Polysome Profiling

蛋白质合成的调控是细胞应激反应中的关键控制环节。特别是，已发现特定的RNA调控元件能够实现特定mRNA的选择性翻译，这些mRNA通常编码应对特定应激反应所需的蛋白质。识别这类mRNA以及表征介导选择性翻译的调控机制，长期以来一直是分子生物学研究的前沿课题。多核糖体分析（polysome profiling）是这些研究中的核心技术。多核糖体分析的目标是通过固定正在不同转录本上活跃翻译的核糖体，并在蔗糖梯度中利用超速离心分离由此形成的多核糖体，从而实现对高效翻译与低效翻译转录本的区分。随后可利用传统的生物化学与分子生物学方法对这些转录本作进一步表征。尤为重要的是，将多核糖体分析与高通量基因组学方法相结合，可实现对翻译调控的大规模分析。

我们最近报道了肿瘤抑制因子PDCD4作为一种选择性翻译抑制剂的新功能，可抑制携带IRES的编码凋亡抑制因子XIAP和Bcl-xL的mRNA的翻译12。多聚核糖体分析（polysome profiling）是一项关键的技术，用于证明PDCD4在IRES介导的翻译过程中的特异性作用。HEK293细胞被瞬时转染以降低内源性PDCD4水平（图1A），随后进行多聚核糖体谱型分析。我们观察到，降低PDCD4水平并未损害细胞整体的翻译活性，这一点通过比较siCTRL和siPDCD4处理细胞的多聚核糖体谱型未见明显变化得以证实（图1B）。同样，非IRES型XIAP19的多聚核糖体分布在这两组细胞之间也未发生改变（图1C）。相反，携带IRES的两种mRNA——XIAP和Bcl-xL——的多聚核糖体分布则发生了显著变化。在PDCD4缺失的情况下，这两种mRNA的分布向重核糖体多聚体（heavy ribopolysomes）区域偏移（图1D、E）。由于这一变化并未伴随XIAP和Bcl-xL mRNA稳态水平的改变（图1F），这些结果表明，在PDCD4水平降低的细胞中，XIAP和Bcl-xL的翻译被增强，这一结论进一步通过Western blotting得到验证（图1G）。
<img alt="siRNA experiment results showing PDCD4, XIAP, Bcl-xL levels; Western blot, mRNA analysis graphs." src="/files/ftp_upload/52295/52295fig1highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 1"> 
图1：多聚核糖体分析鉴定PDCD4为XIAP和Bcl-xL翻译的选择性抑制因子。 （A） HEK293 细胞用 PDCD4 siRNA 或对照（CTRL）非靶向 siRNA 处理后，裂解并进行 Western 印迹分析，使用抗 PDCD4 和抗 Nucleolin 抗体验证 PDCD4 沉默程度。 (B) PDCD4 按如下方法进行敲低 （A） 并对接收的细胞裂解液进行多聚核糖体分析。顶部图示为典型的多聚核糖体图谱；XIAP 非IRES元件的分布情况 (C)Bcl-xL (D)和 XIAP IRES (E) 以GAPDH的mRNA为参照，各组分中目标mRNA的相对含量表示为总mRNA的百分比（% mRNA）。 (F) 通过RT-qPCR检测经PDCD4 siRNA或对照（CTRL）siRNA处理的细胞中mRNA的稳态水平。 (G) 来自裂解液的 （A） 也使用抗 XIAP、抗 Bcl-xL 和抗 Nucleolin 抗体进行了蛋白质印迹分析。（注：数据见于 图1 最初发表于 12) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52295/52295fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>

细胞适应应激的能力对其存活至关重要。mRNA 翻译的调控即为一种此类适应策略，可实现对蛋白质组的快速调控。本文提供了一种标准化的多聚体分析流程，用于鉴定在应激条件下被选择性翻译的特定 mRNA。

通过多聚体图谱分析评估哺乳动物细胞中mRNA的选择性翻译

蛋白质合成的调控是细胞应对应激反应的关键控制点。特别是，已发现特定的RNA调控元件在……

以下实验的总体目标是通过多聚核糖体的固定与分离，区分高翻译活性与低翻译活性的 mRNA。首先向细胞中加入环己酰亚胺，以抑制核糖体的移位及 RNA 的翻译；随后，将处理后的细胞裂解液加载至蔗糖梯度中，通过超速离心根据多聚核糖体的质量大小进行分离。接下来，在最后一步中将梯度离心液等分为若干组分，以分离高效翻译和低效翻译的转录本。采用R-T-Q-P-C-R方法检测各组分中目标mRNA的存在情况。最终，核糖体谱分析可用于检测在不同生理及病理生理应激条件下，mRNA整体水平及特定转录本翻译的变化。PolyOne 分析能够解答分子与细胞生物学领域的关键问题，例如在 S 期应激期间哪些 mRNA 被选择并进行翻译，以及这一过程如何使细胞适应此类条件。本实验操作由实验室的一名研究生的母亲演示。使用自动梯度制备仪制备蔗糖梯度时，首先打开梯度制备仪，调节承载梯度管的托盘至水平状态。当托盘调平后，点击“完成”。然后选择梯度程序，打开梯度菜单并选择列表。点击 SW 41，然后向下滚动列表，直到显示 10% 至 50% 梯度 11 步程序，按下“使用”。接下来，将一个 SW 41 锥形超速离心管放入标记块中，并使用提供的细管标记笔沿块的上台阶在管壁上画一条线。将离心管置于稳定表面上的合适支架中，然后将提供的两根套管分别连接到两个10毫升注射器上。用含有RNAs的温热蒸馏水在活化溶液中上下吹打数次，以清洗注射器。随后彻底去除水分后，用10%蔗糖加环己亚胺填充其中一支注射器，并将套管插入超速离心管底部。轻轻滴加溶液，直至液面刚好超过管壁上的标记线，注意避免产生气泡。然后用另一支注射器吸取50%蔗糖加环糊精溶液，并用擦拭纸清除管外多余的液体。使用套管轻轻将50%蔗糖溶液插入管中，当液面与标记齐平时停止，并迅速而平稳地取出套管。10%蔗糖溶液应上升至管顶部形成弯月面。接下来，略微倾斜超速离心管以排除任何气泡，并使用微量移液器插入盖子，同时移除盖子储液腔中的多余液体。将试管放入梯度制备仪中，然后按下运行按钮。注意，平板将倾斜至指定角度。暂停五秒钟后，开始旋转以形成梯度。大约两分钟后，仪器会发出蜂鸣声，提示梯度已形成完毕。轻轻将离心管转移至试管架中，并迅速以向上动作同时取下管帽，避免扰动梯度。然后，小心地将等量的260单位预先制备的细胞裂解液加到每根蔗糖梯度管中，在超速离心机中于4°C条件下以260,343 × g离心一个半小时。设置梯度分馏系统仪器时，首先打开分光光度计。接着连续点击文件夹图标两次，然后连续点击返回箭头两次，返回主界面，并将组分收集器设置为PolyZone方法，以确保组分收集器上的阀门处于废液位置。点击指向垃圾桶图标的箭头，然后在废液收集管下方放置一个盛有蒸馏水的250毫升MIA烧瓶。现在选择图表记录仪上的以下设置：将灵敏度旋钮调至1.5，灯和光学噪声滤波器开关调至“开”，峰分离旋钮调至“关闭”，走纸速度旋钮调至30厘米/小时，并将分光光度计单元顶部的基线调节旋钮调至最大开度。然后将注射器和泵筒放入泵中，并使用提供的螺丝和内六角扳手将其固定紧。使用快速反转命令将追加溶液吸入注射器中。然后将泵置于直立位置，使用正向命令推动液体，使空气通过管路排出。接着，将装有无RNA酶水的超速离心管放入支架中，再用套管穿刺管壁，直至看到两个黑色标记。分配孔位于两个标记之间。将注射泵设置为正向手动模式，流速为6.0毫升/分钟。当洗脱液填充至管子三分之一处时，切换为可变速度模式，流速为1.0毫升/分钟。现在调节分光光度计上的基线调节旋钮，直至图表上的电压值为零。水将开始从废液管流出，进入收集烧瓶。然后将灵敏度设定为1.0 au。调整好灵敏度后，按下基线按钮，旋转记录仪偏移调节旋钮，将基线设定在图表记录仪的10%刻度位置。待基线稳定后，关闭泵开关和图表走速调节旋钮。泵停止运行后，将其切换至反转（rev）位置，以回收追加溶液，直至溶液到达穿刺套管上的第一个标记处。然后取出离心管，用少量冲洗液分散导管中的气泡，并清理流室可能泄漏的残留水分，以进行梯度分段收集。接着，将含有蔗糖梯度的离心管安装到支架中，并用导管刺穿管壁。随后，将十个2 mL的微量离心管放入分部收集器托盘的第2至第11位，将一个废液管放入第1位，确保管盖不向上突出。将泵控制旋钮设为手动模式，并将注射泵的流速设为 6.0 毫升每分钟。当机械臂到达第一根试管时，立即按下馏分收集器的运行按钮。按下暂停按钮以定位机械臂并打开馏分分配阀。然后使用正向指令启动泵并监测图表记录仪的笔迹。当记录笔开始向上偏转，表明样品正流经流通池时，迅速将废液管更换为1号管。当收集到第一滴时，立即切换指令为远程启动、停止和1.0毫升/分钟的可变流速，然后按下播放键，使组分收集器接口每分钟收集1毫升的组分。最后，当蓝色追踪溶液进入最后一根试管后，按下停止按钮。多聚体分析（PolyZone profiling）是一种用于证明PD CD4特异性参与IRAs介导翻译的关键技术。例如，在本实验中，HEC 293细胞被瞬时转染以降低内源性PDC D四的表达水平，随后进行多聚体分析。降低PDC D四的水平并未影响该基因的整体翻译，这由PolyZone谱型无变化所证实。在比较SI对照组和IPD CD四处理的细胞时，XIAP的非IRAs变异体的多聚体分布在这两组细胞间保持不变。相比之下，携带IS的两种mRNA——XIAP和BCL XL的多聚体分布则发生了显著改变。在缺乏PD CD4的情况下，这两种mRNA的分布向重链核糖体偏移。由于这一现象并未伴随XIAP和BCL XL mRNA稳态水平的变化，这些结果表明，在PDC D四水平降低的细胞中，XIAP和BCL XL的翻译得到增强，这一点进一步通过Western印迹实验得到证实。观看本视频后，您应能够充分理解如何通过制备蔗糖梯度并利用超速离心分离多聚核糖体来检测mRNA的翻译水平。

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科研

JoVE Journal

Biology

生物学

选择性的mRNA翻译在哺乳动物细胞中的核糖体性能分析评估

本文介绍了一种从真核细胞中提取正在翻译的核糖体的实验方案。提取后，通过蔗糖梯度分级分离将核糖体分为单体核糖体和多聚核糖体，从而实现对不同核糖体群体的分析。因此，该方法是研究翻译调控的金标准。...

真核生物多聚核糖体图谱分析

本文介绍了一种用于分析真核细胞在应激条件下mRNA翻译起始变化的方法。该方法基于正在翻译的核糖体与非翻译核糖体在蔗糖梯度中沉降速度的差异进行分离。...

应激条件下通过多聚核糖体分析检测翻译起始

核糖体在蛋白质合成中起着核心作用。通过蔗糖密度梯度离心法对多核糖体（多聚体）进行分级分离，可直接在全基因组范围内测定各个mRNA的翻译效率。此外，该方法还可用于对与核糖体和多核糖体相关的分子（如分子伴侣和信号分子）进行生物化学分析。...

多聚核糖体分级分离及哺乳动物转译组的全基因组规模分析

翻译核糖体亲和纯化（Translating Ribosome Affinity Purification,...

稀有细胞群体的核糖体亲和纯化技术（TRAP-rc） 黑腹果蝇 胚胎

本方案描述了一种根据结合的核糖体数量从植物组织中提取和分级分离转录本的简便方法。该方法可用于全局评估翻译活性，并确定特定mRNA的翻译状态。...

一种简便的植物多聚核糖体分析方法

本文描述了一种用于可视化并定量亚细胞区室中局部翻译事件的方法。该方法仅需基础的共聚焦成像系统及试剂，具有快速、经济高效的特点。...

定量免疫荧光法检测全局限域性翻译

多核糖体分析技术的总体目标是分析蛋白质合成过程中单个mRNA或转录组mRNA的翻译活性。该方法对于研究健康状态及多种人类疾病中的蛋白质合成调控、翻译激活与抑制具有重要意义。...

利什曼原虫、人细胞和小鼠睾丸中的多聚核糖体分析

本文介绍了一种在离体灌注小鼠心脏上进行多聚核糖体分析的实验方案。我们描述了心脏灌注、多聚核糖体分析的方法，以及针对多聚核糖体组分中mRNA、miRNA和多聚核糖体蛋白质组的分析方法。...

离体小鼠心脏Langendorff灌注后多聚核糖体的动态蛋白质组学与miRNA分析

本文介绍了利用RiboTag系统从成年雄性小鼠特定生殖细胞群体中免疫沉淀核糖体及其结合RNA的方法。通过合理的杂交育种和严谨的免疫沉淀操作，可获得纯净且可重复的结果，从而揭示生殖细胞的翻译组特征，并有助于深入理解突变表型的作用机制。...

雄性小鼠生殖细胞中的RiboTag免疫沉淀

哺乳动物大脑的发育需要在翻译水平上对基因表达进行精确调控。本文介绍了一种多聚核糖体分析系统，该系统配备易于组装的蔗糖梯度制备与分级分离平台，可用于评估发育中大脑内mRNA的翻译状态。...

利用多聚核糖体分析法研究小鼠发育大脑中的翻译过程

本实验方案描述了如何在不使用自动梯度生成仪或梯度分段收集系统的情况下，制备多聚核糖体图谱。...

无需梯度混合器或组分分离系统的多聚核糖体分析

学习多核糖体分析技术以评估哺乳动物细胞中mRNA的选择性翻译效率。该方法利用蔗糖梯度超速离心分离多聚核糖体，结合实时定量PCR检测应激条件下的翻译调控机制。

通过多聚体图谱分析评估哺乳动物细胞中mRNA的选择性翻译

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