选择性的mRNA翻译在哺乳动物细胞中的核糖体性能分析评估

以下实验的总体目标是通过固定和分离多核糖体来区分高度翻译和翻译不良的 mRNA。这是通过首先向细胞中添加 cyclo heide 以抑制其核糖体、易位和 RNA 翻译来实现的。作为第二步，将处理过的细胞的裂解物上样到蔗糖梯度和超速离心机上，以根据其质量分离储存的多核糖体。

接下来，将梯度分成相等的分数，以在最后一步中分离翻译高度和翻译不良的转录本。R-T-Q-P-C-R 用于检测每个级分中目标 mRNA 的存在。最终，核糖体分析可用于检测响应不同生理和病理生理应激的 mRNA 的整体和特异性翻译的变化。

普立万分析可以回答分子和细胞生物学领域的关键问题，例如在 S 应激期间选择、翻译哪些 mRNA，以及这如何使细胞适应这些条件。演示此程序的是实验室研究生的妈妈 Dar要使用自动梯度生成器来准备蔗糖梯度，首先要打开梯度生成器并调平板，当板调平时，该板将保持梯度。单击 done（完成）。

然后要选择渐变程序，打开 grad 菜单并选择列表。单击 SW 41，然后滚动列表，直到看到 10% 到 50% 梯度的 11 步程序，然后按。用。接下来，将 SW 41 锥形超速离心管放入标记块中，并使用提供的细管标记沿标记块的上部台阶在管上画一条线。

将试管放在稳定表面上的安装架上，然后将提供的两个插管连接到两个 10 毫升注射器上。上下吸取活化溶液中含有 RNA 的温蒸馏水几次以清洗注射器。然后，在去除所有痕迹的水后，用 10% 蔗糖加环 heide 填充其中一个注射器，并将套管插入超速离心管的底部。

轻轻分配溶液，直到它刚好超过试管上的标记。注意避免气泡。然后用 50% 蔗糖加环 heide 填充另一个注射器，并用湿巾清洁管子上多余的液体。

使用套管将 50% 蔗糖溶液轻轻插入管中，当溶液与标记齐平时停止，然后快速平稳地取出套管。10% 蔗糖溶液应上升，在管顶部形成弯月面。接下来，稍微倾斜超速离心管以置换任何气泡，并使用微量移液器插入盖子以去除盖子储液器中的任何多余液体。

将试管放在梯度制作器上，然后按下运行按钮。请注意，板将以指定的角度倾斜。暂停 5 秒钟，然后开始旋转以形成渐变。

大约两分钟后，机器将发出哔哔声，表示梯度形成已完成。轻轻地将试管转移到试管架上，并在向上移动时迅速取下瓶盖，以避免干扰梯度。然后轻轻地将等于 260 单位的先前制备的细胞裂解物加载到每个蔗糖梯度上，并在超速离心机中以 260、343 倍 G 和 4 摄氏度旋转试管一个半小时。

要设置梯度分馏系统仪器，首先要打开分光光度计。接下来，选择文件夹图标两次，然后选择返回箭头两次，返回主屏幕并将馏分收集器设置为 PolyZone 方法，以确保馏分收集器上的阀设置为废液。单击指向垃圾桶图标的箭头，然后将一个装有蒸馏水的 250 ml MIA 烧瓶放在废液收集管下。

现在，在图表记录器上选择以下设置：灵敏度拨盘以设置灯和光学元件，噪声过滤器。切换到 1.5 峰值分离器刻度盘以偏离图表速度，刻度盘为每小时 30 厘米，并将分光光度计单元顶部的刻度盘调整为最大打开。然后将注射器和针筒放入泵中，并使用提供的螺钉和 Alan Key 将其拧紧到位。

快速使用 rev 命令将 chase 溶液填充注射器。然后将泵置于直立位置，并使用 forward 命令使空气通过管道。接下来，在支架中安装一个装满 RNA 游离水的超速离心管，然后用套管刺穿管，直到看到两个黑色标记。

分配孔位于两个标记之间。以每分钟 6.0 毫升的速度按手动前进启动注射泵。当追逐溶液充满试管的三分之一时，将流速切换到可变速度，流速为 1.0 mL/min。

现在转动分光光度计上的基线调整刻度盘，直到图表上的电压为零。水将开始从废液管流出到 el Mya 培养瓶中。然后将所需的灵敏度设置为 1.0 au。

调整灵敏度后，按下基线按钮并转动记录仪偏置拨盘，将基线设置调整到图表记录仪上的 10% 标记。然后，一旦达到稳定的基线，将泵开关和图表速度旋钮转到关闭位置。泵关闭后，将其切换到转速位置以恢复追踪溶液，直到它到达穿刺套管上的第一个标记。

然后取出离心管，用少许追逐溶液分散套管中的任何气泡，并清理可能从流通池泄漏的任何残留水以分馏梯度。接下来，将含有蔗糖梯度的离心管安装在支架中，并用套管刺穿管子。然后将 10 个 2 ml 微量离心管放入馏分收集器托盘位置 2 至 11 中，将腰管放入位置 1，使瓶盖不会向上突出。

将泵控制旋钮设置为手动，并将注射泵上的流速设置为 6.0 mL/min。然后在臂到达第一根管后立即按馏分收集器上的 play。按下暂停按钮以定位臂并打开馏分分配阀。

然后使用 forward 命令启动泵并监控图表记录笔。当笔开始向上偏转，表明样品正在通过流通池时，请迅速将废液管更换为 1 号管。然后，当收集到第一滴时，快速将命令切换到远程启动、停止和可变 1.0 mL/min，然后按播放以允许馏分收集器界面每分钟收集 1 mL 馏分。

最后，在蓝色追踪溶液进入最后一根管后，按下 stop。PolyZone 分析是证明 PD CD4 特异性参与 IRA 介导翻译的关键技术。例如，在本实验中，瞬时转染 HEC 2 93 细胞以消耗 PDC D 4 的内源水平，然后进行 PolyZone 谱分析。

降低 PDC D 4 的水平不会损害基因的整体翻译，这可以通过 PolyZone 谱中没有变化来判断。当比较 SI 对照和 IPD CD 时，四个处理的细胞类似地，XIAP 的非 IRAs 变体的多核糖体分布在处理和未处理的细胞之间保持不变。相比之下，两种携带 mRNA XIAP 和 BCL XL 的 IS 的多核糖体分布发生显著改变。

在没有 PD CD4 的情况下，这两种 mRNA 的分布转移到重核糖体中。由于这不伴随着 XIAP 和 BCL XL mRNA 稳态水平的变化，这些结果表明 XIAP 和 BCL XL 在 PDC D 降低 4 水平的细胞中翻译增强，Western 开花进一步证实了这一点。看完这个视频，您应该对如何通过制备蔗糖区和超速离心分离多核糖体来测量 mRNA 翻译有一个很好的了解。