电功能性细菌效应器到哺乳动物细胞
2015年1月19日
电穿孔用于将纯化的细菌毒力效应蛋白直接插入活的真核细胞中。通过共聚焦免疫荧光显微镜监测蛋白质定位。该方法允许使用活性外源蛋白研究运输、功能和蛋白质-蛋白质相互作用，避免了在真核细胞中异源表达的需要。
以下实验的总体目标是将外源性的、潜在的细胞毒性蛋白质（如细菌效应子）引入哺乳动物细胞中，以研究它们的作用和功能。这是通过首先通过标准培养条件培养哺乳动物细胞以获得合适的宿主样细胞来实现的，从而在其中引入纯化的目标蛋白质。作为第二步，在纯化的细菌效应子存在下对培养的宿主细胞进行电穿孔，这允许蛋白质进入宿主细胞并与宿主细胞相互作用。
接下来，进行可视化或其他一些功能测定，以评估效应蛋白的亚细胞定位和功能。基于共聚焦显微镜、免疫化学方法或其他分析技术的结果显示功能性细菌效应子定位于其预期的亚细胞位置，并与它们已知的相互作用伴侣结合。与现有方法（如横切或转导）相比，该技术的主要优点是该方案是一种快速、简单且廉价的克服潜在细胞毒性的方法。
这种方法可以帮助回答病原体生物学领域的关键问题，例如发现或验证细菌效应蛋白的功能。虽然这种方法用于提供对细菌效应蛋白的了解，但它也可以应用于其他蛋白质或小分子。可视化结果至关重要。
由于与已知的细胞特征共定位，因此验证电穿孔蛋白的预期亚细胞关联以开始此过程。将 400 μL 细胞悬液转移至预冷的兽医中。然后加入 20 μg 选定的蛋白质，以达到每毫升 50 μg 的最终浓度。
轻轻轻弹 vete 约 10 次以混合并避免损坏细胞。之后，用纸巾擦干 Q Vet 的外部，以避免在电镜中产生电弧。将样品放入电介质中，电穿孔后立即将其设置为 0.3 kV，持续 1.5 至 1.7 毫秒。
轻轻轻弹 qve 约 10 次以充分混合样品，然后再进行固定和免疫荧光染色或亲和纯化。从电穿孔中恢复 4 小时后，用无菌 PBS 洗涤细胞。然后将细胞在室温下用 100% 甲醇固定 2 分钟。
随后，用无菌 PB S3 洗涤细胞更多次。用 0.4% tritton X 100 的 PBS 溶液渗透细胞 15 分钟。根据靶蛋白的表位和位置调整渗透性的长度和 Triton X 100 的强度。
然后在室温下用 PBS 中的 5% BSA 封闭细胞 1 小时。然后。用 PBS 洗涤 3 次。接下来，将它们与抗体结合溶液中的一抗在 4 摄氏度下孵育过夜，第二天轻轻摇动。
用 PBS 再洗涤细胞四次。然后将它们与抗体结合溶液中适当的荧光偶联二抗一起孵育。根据需要添加其他染色剂，例如在室温下避光放置 5 微摩尔小麦胚芽凝集素或 WGA 与 Alexa 6、47 或 DPI 偶联 1 小时。
然后用 PBS 洗涤细胞五次，并在 4 摄氏度避光储存，直到它们准备好在此步骤中成像。用 4 摄氏度的 PBS 洗涤电穿孔细胞两次。恢复 4 小时后，在冰上用 1 mL 裂解缓冲液对细胞进行虱子处理。
立即用橡胶警察刮擦细胞并收集到锥形管中。然后通过超声处理和剧烈涡旋对细胞进行虱子处理。接下来，将样品离心 10， 000 次。
在 4 摄氏度下重力 10 分钟以收集细胞碎片和不溶性聚集体并保存上清液。将 1 毫升澄清的电穿孔细胞裂解物与 50 μL strept 混合在 aros 树脂悬浮液中。将混合物在 4 摄氏度下孵育过夜，端到端旋转，以通过 strp havein 结合肽亲和标签捕获电穿孔蛋白和相关复合物。
之后，将样品以 2， 500 倍重力离心 2 分钟，并弃去上清液。然后用 1 毫升 PBS 洗涤样品两次。接下来，向样品中加入 30 微升 4 个 XLDS 上样缓冲液、20 微升蒸馏 H 2 O 和 1 微升 0.5 摩尔 TCEP，并留下一些上清液。
将样品在 95 摄氏度下加热 10 分钟。然后在冰上冷却约一分钟。随后，将样品在 4 摄氏度下以 10， 000 倍重力离心 5 分钟。
最后，用适当的抗体收集上清液进行蛋白质印迹。用每毫升 50 微克亲和标记的沙门氏菌效应子 GTGE 孵育或电穿孔 Hela 细胞，并用抗效应标签抗体 dpi、A 核掩码和 WGA 染色 为了描绘胞质边界，孵育的 Hela 细胞显示没有绿色荧光，表明缺乏 GTGE 的内化。这是电穿孔 GTG 的代表性显微照片，显示了所示的细胞内电穿孔效应蛋白。
这是检测真核相互作用伴侣正弦硫蛋白激酶 N one 的蛋白质印迹。请注意，最右侧的泳道包括两个混合的比色皿。来自一个 qve 的信号混合到背景中，但 pkn 1 在以 50 μg/mL 的浓度电穿孔后，仍然富集于共聚焦显微镜在无诱饵控制中观察到的无结合。
S sph one hela 细胞显示 pkn one 和 S SPH one 之间的共定位。这种光学重叠表明效应子和宿主蛋白足够接近，可以物理相互作用。这种相互作用首次显示在细胞核中的事实为蛋白质被宿主正确运输提供了额外的支持。
一旦掌握，该技术就可以以高通量方式进行。研究多种蛋白质 在尝试此程序时，重要的是要记住根据经验确定每种细胞类型和蛋白质靶标的最佳电穿孔条件。该程序可能允许您对多种蛋白质、小分子或两者的组合进行多重分析，以更好地了解各种模型系统中的细胞过程。
观看此视频后，您应该对如何使用电穿孔将蛋白质等大分子引入哺乳动物细胞有很好的了解。
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概述
本研究展示了使用电穿孔将纯化的细菌毒力效应蛋白引入哺乳动物细胞的方法。使用共聚焦免疫荧光显微镜评估这些蛋白的定位和功能，提供了它们在真核细胞内相互作用的见解。
关键研究组成部分
科学领域
- 细胞生物学
- 微生物学
- 蛋白相互作用
背景
- 了解细菌效应蛋白对哺乳动物细胞的影响对于研究致病机制至关重要。
- 传统的将蛋白质引入细胞的方法可能耗时且可能导致细胞毒性。
- 电穿孔为蛋白质递送提供了一种快速有效的替代方法。
- 共聚焦显微镜允许对细胞内蛋白定位进行详细的可视化。
研究目的
- 将外源性细菌效应蛋白引入哺乳动物细胞。
- 研究这些蛋白的定位和功能。
- 提供一种简单有效的蛋白递送方法，最大限度地降低细胞毒性。
使用的方法
- 在标准条件下培养哺乳动物细胞。
- 在纯化的细菌效应蛋白存在下进行细胞电穿孔。
- 使用共聚焦免疫荧光显微镜可视化蛋白定位。
- 通过各种测定评估蛋白功能。
主要结果
- 成功将细菌效应蛋白引入哺乳动物细胞。
- 在预期的亚细胞位置可视化蛋白。
- 展示蛋白与已知伴侣的相互作用。
- 验证电穿孔作为一种快速有效的蛋白递送方法。
结论
- 电穿孔是一种研究哺乳动物细胞中细菌效应蛋白的有效技术。
- 这种方法允许研究人员绕过传统蛋白表达系统的挑战。
- 未来的研究可以利用这种方法探索各种蛋白功能和相互作用。
常见问题
Executive Industry Relevance
Electroporation enables direct delivery of exogenous proteins into mammalian cells, offering a rapid, low-cost alternative to transfection or transduction for studying pathogen-host interactions. This approach supports early-stage target validation by allowing functional assessment of bacterial effectors in a relevant cellular context, reducing reliance on overexpression systems that may introduce artifacts. The method enhances predictive confidence in preclinical de-risking by verifying subcellular localization and protein-protein interactions under near-physiological conditions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by testing effector protein function in mammalian cells.
- Operational Value: Provides a simple, fast workflow for introducing purified proteins without genetic manipulation.
- Predictive Value: Supports target de-risking through validation of subcellular trafficking and interaction with host partners.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative localization and interaction data via confocal microscopy and western blot.
- Operational Value: Compatible with parallel processing for high-throughput effector screening.
- Assay Readiness: Produces reproducible intracellular protein delivery detectable by affinity tagging and imaging.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Bridges discovery to preclinical validation by confirming effector function in mammalian systems.
- Mechanistic De-risking: Clarifies pathogen protein behavior in host cells, informing anti-virulence strategies.
- Disease Relevance: Applicable to studying virulence mechanisms in infection models.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery to lead identification, enabling functional screening of pathogen proteins before compound screening campaigns.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of effector mechanisms and pathway modulation in host cells.
- Screening: Delivers standardized protein inputs for consistent functional readouts across targets.
- Analytics: Generates imaging and biochemical outputs (e.g., colocalization, co-immunoprecipitation) for comparative analysis.
- Translational Research: Validates effector activity in mammalian cells, supporting progression to infection models.
- Enterprise Reuse: Platform adaptable to various proteins and small molecules across multiple projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by confirming effector localization and function.
- Operational Value: Requires minimal equipment (standard electroporator) and short hands-on time.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by filtering non-functional or mislocalized effectors early.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on validated host-cell activity.
Implementation Considerations
- Requires expertise in mammalian cell culture and electroporation optimization.
- Dependent on access to a standard electroporator and 0.4 cm gap cuvettes.
- Needs standardization of protein concentration, pulse parameters, and recovery time across users.
- Must account for variable efficiency across cell types and protein properties (size, charge, toxicity).
- Limited by potential surface aggregation; requires validation of intracellular delivery per target.
