Name: 肝脏活体如下显微成像利什曼原虫感染：肝脏血流动力学的评估 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-07-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 48 s
Description: 学习使用活体共聚焦显微成像技术测量小鼠肝脏血管中的血流速度。该方法通过荧光血浆标记实现实时可视化，可量化正常及利什曼原虫感染条件下的肝脏血流动力学变化。

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本研究由法国国家健康与医学研究院（INSERM）、艾克斯-马赛大学以及CL Forestier获得的国际人类前沿科学计划组织（HFSPO）职业发展奖资助。

伦理声明：所有动物实验均按照法国艾克斯-马赛大学机构动物护理与使用委员会批准的指南和方案进行。8至10周龄的雌性C57Bl/6小鼠购自商业供应商，并依照法国《第2013-118号法令》（Décret N&#176; 8 87–848，1987年10月19日，巴黎。所有使用 L. donovani LD1S 寄生虫的操作严格遵守法国及欧盟法律法规中的生物安全规定。
1. 小鼠感染 L. donovani 前鞭毛体寄生虫

<ol>
	<li>制备培养基 体外 维持 L. donovani 前鞭毛体寄生虫，LD1S（MHOM/SD/62/1S-CL2D）。
	<ol>
		<li>使用M199培养基。在M199培养基中添加10%胎牛血清（56℃热灭活） &#176;C 下孵育 30 分钟），25 mM HEPES（pH 6.9），12 mM NaHCO₃31 mM 谷氨酰胺，RPMI 16040 维生素混合物，10 mM 叶酸，100 mM 腺苷，7.6 mM 血红素，50 U/ml 青霉素和 50 mg/ml 链霉素。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在26°C下，将LD1S寄生虫培养于10 ml完全M199培养基中 &#176;C，置于25 cm²培养瓶中2 通风烧瓶</li>
	<li>通过连续差速离心步骤，制备富含前循环型的前鞭毛体寄生虫群体。
	<ol>
		<li>收获对数中期的寄生虫培养物。使用血细胞计数板进行计数。重悬为 5 x 105 在10 ml完全M199培养基中接种每毫升含一定数量的寄生虫。在厌氧条件下培养寄生虫，直至其进入晚期稳定期（约5-6天）。</li>
		<li>在26℃下，以1,200 × g离心LD1S培养物10分钟 &#176;C，以沉淀非后循环型寄生虫，收集上清液并再次在26℃下以2,500 × g离心 &#176;10 分钟，4℃ 
		注意：此最终沉淀物中富含前鞭毛体的代谢循环期寄生虫。</li>
		<li>将沉淀重悬于 100 &#181;加入 PBS。取少量等分试样，用 25% 戊二醛按 1:100 体积比进行固定，使用血细胞计数板计数寄生虫。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将富集的后循环型寄生虫群体稀释至 1 x 107/100 &#181;l 磷酸盐缓冲液中。使用带有30 G针头的1 ml注射器，将寄生虫悬液注入麻醉小鼠的尾静脉（见下文）。对于对照动物，注入100 &#181;l PBS 注入尾静脉。</li>
</ol>
2. 手术操作
<ol>
	<li>使用生物杀灭性消毒喷雾对工作区域进行消毒，并用70%乙醇对所有外科器械消毒30分钟。</li>
	<li>根据动物体重配制麻醉溶液，其中包含125 mg/kg的氯胺酮（Ketamine）和12.5 mg/kg的赛拉嗪（Xylazine），用PBS稀释。</li>
	<li>称量小鼠体重，使用带有30 G针头的1 ml注射器，腹腔注射相应剂量的麻醉剂。</li>
	<li>保持小鼠体温，并在继续操作前通过捏压足垫确认小鼠已完全麻醉。每60分钟追加注射一次半剂量的麻醉溶液。</li>
	<li>剃除小鼠腹部毛发，并用Vetedine清洁。在腹部左侧胸廓下方的皮肤和肌肉上做一个小切口。</li>
	<li>在切口区域下方的腹部放置一块湿润纱布，暴露肝脏并将其置于纱布上，再用另一块湿润纱布覆盖肝脏。</li>
	<li>将一块尺寸为24 × 60 mm2、厚度为150 µm的盖玻片（用氰基丙烯酸酯粘合在金属框架上）放置于肝脏表面，以便在显微镜下观察。</li>
	<li>用湿纱布覆盖小鼠眼睛以保护眼部。</li>
	<li>成像结束后，通过颈椎脱位法处死麻醉状态下的动物。</li>
</ol>
3. 肝脏结构的活体显微成像
<ol>
	<li>在配备有温控培养室、63倍油甘油浸没式复消色差物镜（数值孔径1.4）、氩离子激光器（488 nm）、氦氖激光器（543 nm，633 nm）以及蓝色二极管激光器（405 nm）的倒置共聚焦显微镜上进行活体显微成像实验。</li>
	<li>将小鼠放置于显微镜载物台上，使覆盖肝脏的盖玻片朝下紧贴物镜。将培养室温度设定为29 °C。利用肝脏自发荧光调节焦距，以清晰观察肝窦状隙结构。</li>
	<li>为观察血管系统，每只小鼠准备一份将500 µg BSA-Alexa 647溶于100 µl PBS中的溶液。使用1 ml注射器配合30 G针头，将该溶液经尾静脉静脉注射至麻醉小鼠体内。</li>
	<li>为观察肝细胞核，配制Hoechst 33342的PBS溶液。使用1 ml注射器配合30 G针头，按每公斤小鼠体重8 mg的剂量，将该溶液腹腔注射。</li>
	<li>采用常规顺序扫描模式，使用63倍浸没物镜及400 Hz扫描速度对肝细胞核和肝脏血管系统进行成像。开启405 nm蓝色二极管激光以激发Hoechst，开启633 nm激光以激发BSA-Alexa 647，同时开启488 nm氩离子激光，并设置较宽的信号采集波段以观察肝脏自发荧光。</li>
</ol>
4. 用于血流速度测量的肝脏活体显微成像
<ol>
	<li>打开显微镜的 LAS 软件（LAS-AF Viewer 版本 3.1.0 build 8587）。启动显微镜软件时，选择共振扫描模式。</li>
	<li>点击配置选项卡以设置硬件。点击激光器并选择 HeNe 633 激光器。点击设置并选择 12 位分辨率。</li>
	<li>点击采集菜单。在光路设置窗口中，选择 63X 物镜，并将 633 激光器功率设置为 100%。通过在 PM1-3 下拉菜单中选择 Alexa-633，激活信号增益和偏移参数。</li>
	<li>在采集选项卡中，选择“xyt”采集模式。将格式宽度设置为 1,024 × 1,024。选择扫描速度为 8,000 Hz。选择针孔大小为 3 个艾里单位。设置放大倍数为 3。不要选择双向扫描模式。</li>
</ol>
5. 使用 xyt 图像对红细胞速度进行定量分析（方法 1）
<ol>
	<li>点击“Live”图标以实时模式观察血流情况。选择感兴趣的区域，并选定特定血管进行分析。通过调整USB控制面板上的“X”、“Y”坐标及扫描视野旋转角度，将目标血管调整至水平位置。</li>
	<li>当目标血管调整到位后，停止“Live”模式。在采集模式设置窗口中，将格式设置宽度改为1,024 × 256，线平均值 = 1，帧平均值 = 1，选择“stacks”为150。点击“start”开始采集图像。</li>
	<li>为使用“xyt”图像对红细胞（RBC）速度进行定量分析，请打开ImageJ软件。在ImageJ中选择“File”选项卡，点击“Open”，然后选择所需文件。</li>
	<li>进入ImageJ的“plugin”菜单，选择LOCI和Bio-formats导入选项。在此窗口中，将堆栈查看参数设置为“hyperstack”，在堆栈顺序选项中选择“xyzct”。注意：此操作将打开一个包含所有采集序列的窗口。</li>
	<li>在ImageJ菜单中点击“Plugins”，选择MTrackJ选项。在弹出的小窗口中点击“add”图标，然后点击待追踪的红细胞。在后续每一帧中点击同一红细胞，并点击“measure”图标以测量其速度。 
	注意：生成的文件可保存为.exl格式。</li>
	<li>每条血管至少追踪五个红细胞，并至少分析三条相同尺寸的独立血管。</li>
</ol>
6. 使用 xt 线图像对红细胞速度进行定量分析（方法 2）
<ol>
	<li>点击“Live”以实时模式观察血流情况。选择特定血管进行分析。将目标血管调整至水平位置。在设定好目标血管后，停止“Live”模式。</li>
	<li>选择“xt”扫描模式，并将所选血管的中心管腔对准线扫描路径。设置图像格式为1,024 × 512，扫描速度为8,000 Hz，线平均值为32，时间为512。点击“start”以获取xt线扫描图像。</li>
	<li>通过打开.lif文件并选择感兴趣的xt线图像，生成用于红细胞速度定量分析的条带图像。在LAS-AF软件中，选择“experiments”，打开.lif文件并选择相应图像。注意：系统将自动打开一张显微运动图（kymograph）。</li>
	<li>在该显微运动图上，测量一个粒子条带（表现为暗色反射）移动一定距离（d，X轴所示）所需的时间（t，Y轴所示）。选择“draw line”工具，并沿条带水平画一条线。记录图像底部结果栏中显示的距离（单位：µm）和时间（单位：秒）。</li>
	<li>利用显微运动图获得的数值，按公式 V = 距离/时间 计算速度。</li>
	<li>每张xt图像至少量化五个粒子条带，且至少分析三条相同尺寸的独立血管。</li>
</ol>

<ol><li>Vollmar, B., Menger, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+hepatic+microcirculation%3A+mechanistic+contributions+and+therapeutic+targets+in+liver+injury+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">The hepatic microcirculation: mechanistic contributions and therapeutic targets in liver injury and repair.</a> Physiol. Rev. 89, 1269-1339 (2009).</li>
<li>Srinivasan, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absolute+blood+flow+measured+by+optical+methods%5BTitle%5D)+AND+%22SPIE+Newsroom%22%5BJournal%5D)">Absolute blood flow measured by optical methods.</a> SPIE Newsroom. , (2011).</li>
<li>Seifalian, A. M., Stansby, G. P., Hobbs, K. E., Hawkes, D. J., Colchester, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+liver+blood+flow%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22HPB.+Surg%22%5BJournal%5D)">Measurement of liver blood flow: a review.</a> HPB. Surg. 4, 171-186 (1991).</li>
<li>Engwerda, C. R., Ato, M., Kaye, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages%2C+pathology+and+parasite+persistence+in+experimental+visceral+leishmaniasis%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Macrophages, pathology and parasite persistence in experimental visceral leishmaniasis.</a> Trends Parasitol. 20, 524-530 (2004).</li>
<li>Beattie, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+imaging+of+experimental+Leishmania+donovani-induced+hepatic+granulomas+detects+Kupffer+cell-restricted+antigen+presentation+to+antigen-specific+CD8+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Dynamic imaging of experimental Leishmania donovani-induced hepatic granulomas detects Kupffer cell-restricted antigen presentation to antigen-specific CD8 T cells.</a> PLoS Pathog. 6, e1000805(2010).</li>
<li>Lee, W. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+intravascular+immune+response+to+Borrelia+burgdorferi+involves+Kupffer+cells+and+iNKT+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">An intravascular immune response to Borrelia burgdorferi involves Kupffer cells and iNKT cells.</a> Nat. Immunol. 11, 295-302 (2010).</li>
<li>Geissmann, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravascular+immune+surveillance+by+CXCR6%2B+NKT+cells+patrolling+liver+sinusoids%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Intravascular immune surveillance by CXCR6+ NKT cells patrolling liver sinusoids.</a> PLoS Biol. 3, e113(2005).</li>
<li>Marques, P. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+liver+biology+in+vivo+using+conventional+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+protocols%22%5BJournal%5D)">Imaging liver biology in vivo using conventional confocal microscopy.</a> Nat. protocols. 10, 258-268 (2015).</li>
<li>Thiberge, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+malaria+parasites+in+the+murine+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+protocols%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of malaria parasites in the murine liver.</a> Nat. protocols. 2, 1811-1818 (2007).</li>
<li>Vacchina, P., Morales, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+screening+test+using+Leishmania+promastigotes+stably+expressing+mCherry+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob.+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">In vitro screening test using Leishmania promastigotes stably expressing mCherry protein.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 58, 1825-1828 (2014).</li>
<li>Ferrer, M., Martin-Jaular, L., Calvo, M., del Portillo, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+microscopy+of+the+spleen%3A+quantitative+analysis+of+parasite+mobility+and+blood%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Intravital microscopy of the spleen: quantitative analysis of parasite mobility and blood.</a> J. Vis. Exp. , (2012).</li>
<li>Kamoun, W. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+measurement+of+RBC+velocity%2C+flux%2C+hematocrit+and+shear+rate+in+vascular+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Simultaneous measurement of RBC velocity, flux, hematocrit and shear rate in vascular networks.</a> Nat. Methods. 7, 655-660 (2010).</li>
<li>MacPhee, P. J., Schmidt, E. E., Groom, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intermittence+of+blood+flow+in+liver+sinusoids%2C+studied+by+high-resolution+in+vivo+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Phys%22%5BJournal%5D)">Intermittence of blood flow in liver sinusoids, studied by high-resolution in vivo microscopy.</a> Am. J. Phys. 269, G692-G698 (1995).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

小鼠肝脏活体显微技术的最新发展为研究感染在体内的生理反应以及实时动态提供了新的可能性体内和&#160;实时5,9,10。器官血流是许多疾病中常发生改变的关键生理参数。&#160;然而，肝脏在生理状态及感染条件下的血流动力学状态仍是一个研究较少的领域。本研究采用基于活体显微成像（IVM）的方法，此前该方法已被用于脾脏和肿瘤血管系统的研究，现被应用于定量单个血管内的肝脏血流速度，并在体内测量单个红细胞的速度11,12。本研究所用方法依赖于静脉注射小鼠体内的一种血浆荧光标记物（如荧光标记的BSA）与保持暗态的红细胞之间的对比度。体内血流测量有望加深我们对疾病过程的理解。
本文采用并比较了两种用于测量肝脏血管血流的方法。第一种方法在数据分析上耗时且繁琐，需要使用者借助 ImageJ 软件中的 MTrackJ 插件，手动追踪单个血管中红细胞的运动。第二种方法则更为简便快捷，其核心是对通过共振扫描模式进行线扫描采集所生成的 xt 图像中的血管进行分析。对于相似的血管，这两种方法所得数据具有可比性。...

器官特异性的血流动力学是任何哺乳动物器官的重要生理特征。血流异常可能是炎症的结果，也是器官功能障碍的征兆。1因此，血流的组织、结构和功能在生理和病理条件下的分析中显得至关重要。目前常用于分析特定器官血流的技术存在若干局限性，包括技术本身的空间分辨率限制（例如&#160;多普勒血流成像），仅测量绝对血流量的能力（单位时间内供应器官的血液体积）（例如&#160;光学相干断层扫描及在大量异质性血管群体中测量平均流速变化2,3肝脏的循环系统连接着在大小、结构和功能上具有异质性的不同血管亚型。本研究应用活体显微成像（IVM）技术评估肝脏血流动力学 体内 实时、高分辨率、并行地揭示构成肝脏器官的单个血管的特征。这一强大光学成像技术的最新发展使研究人员能够在高空间和时间分辨率下采集活体动物的动态数据。通过实现对特定且快速生物过程的直接可视化和实时监测 体内, IVM 为研究者提供了独特的机遇，可对单个血管进行成像，并对特定选择的肝血管内单个红细胞（RBC）的速度进行测量与定量分析。
在本研究中，我们已在小鼠肝脏中应用活体显微技术（IVM），以探究嗜肝性Leishmania寄生虫感染对肝脏血流动力学的影响。L. donovani是引起内脏利什曼病的病原体，该病是一种严重疾病，其特征为急慢性叠加的炎症反应，并累及多个器官，包括脾脏和肝脏。在内脏利什曼病的小鼠实验模型中，肝脏感染可自行消退，而脾脏感染则呈进行性发展4。 目前，Leishmania感染在不同器官中呈现不同结局的机制尚未完全阐明。在病理条件下对肝脏和脾脏血流动力学的研究将有助于进一步揭示宿主与寄生虫之间的相互作用及疾病发生机制。
我们的实验模型系统基于对接受静脉注射特异性荧光染料以标记肝内血管系统的麻醉小鼠进行肝脏暴露和成像。肝脏是活体显微观察的理想器官。在腹部做一小切口后，将肝脏轻柔地外置，置于湿润的纱布上，随后放置于盖玻片上，以尽量减少由心跳和呼吸引起的各种运动伪影。&#160;然后将肝脏置于显微镜物镜视野内。与脾脏和淋巴结等需要使用双光子显微镜进行活体显微（IVM）研究的器官相比，肝脏的优势在于其均一的三维结构/解剖特征，使得可以使用常规共聚焦显微镜进行活体显微成像，其最大穿透深度约为 50 μm5-8。
本研究描述了两种独立的成像方法，用于定量测量单个血管中红细胞（RBC）速度和血流速度。第一种方法采用随时间连续采集的xy二维模式获取肝脏血流图像。所得的xyt数据通过免费的ImageJ软件中的MtrackJ插件进行分析，该插件可实现对单个红细胞随时间运动的追踪。第二种方法选择单个血管，利用共聚焦激光扫描显微镜的线扫描快速采集模式分析其相应的血流情况。对目标血管沿其中心轴向进行高频轴向线扫描，根据未标记的暗色红细胞与荧光标记血浆之间的对比度差异来量化血流速度。将线扫描过程中获取的红细胞和血浆的荧光强度随时间变化绘制成图，得到条纹图像，其条纹角度与单个红细胞的运动速度成正比。
本文的目的是提供一种简单且可重复的方法，用于成像和测量肝脏内单个血管中的血流速度，并提供成功实施小鼠手术、活体显微成像（IVM）以及单个红细胞流速定量分析所需的基本工具。该方法将使研究人员能够深入了解病理条件下血流速度的变化。

<table><tbody><tr><td> Hoechst 33342 </td><td> Sigma Aldrich </td><td> B2261 </td><td></td></tr><tr><td> BSA-Alexa 647 </td><td> lifetechnologies </td><td> A34785 </td><td></td></tr><tr><td> 500 分子量 FITC 标记葡聚糖 </td><td> SIGMA </td><td> 46947 </td><td></td></tr><tr><td> 氯胺酮 </td><td> PanPharma </td><td> 20434 </td><td></td></tr><tr><td> 赛拉嗪 </td><td> Bayer </td><td> KP07KEU </td><td></td></tr><tr><td> Vetedine </td><td> Pharma Animal </td><td> 6869029 </td><td></td></tr><tr><td> 氰基丙烯酸酯液体 </td><td> Cyanolit </td><td> 5833300005 </td><td></td></tr><tr><td> 盖玻片框架：显微切割用膜片，部件编号 N&amp;deg;：5013 </td><td> Molecular machines </td><td> 50103 </td><td></td></tr><tr><td> DiaPath 24×60 盖玻片，厚度：1.6 mm </td><td> DiaPath </td><td> 61061 </td><td></td></tr><tr><td> 共聚焦激光扫描显微镜 </td><td> Leica&amp;nbsp;</td><td> TCS-SP5 </td><td></td></tr><tr><td> LAS-AF 查看器&amp;nbsp;</td><td> Leica 软件 </td><td> 版本 3.1.0 构建 8587 </td><td></td></tr></tbody></table>

肝脏活体显微成像 利什曼原虫 感染：肝脏血流动力学评估

Intravital Microscopy Imaging of the Liver following Leishmania Infection: An Assessment of Hepatic Hemodynamics

活体显微成像（IVM）是一种强大的光学成像技术，可实现在活体动物中实时可视化、监测和定量多种生物学事件。该技术极大地促进了我们对特定器官中生理过程及病原体介导现象的理解。
在本研究中，IVM 应用于小鼠肝脏，并设计了成像方案 体内 肝脏的循环系统，并测量单个肝血管中红细胞（RBC）的流速。为了可视化表征肝脏器官的不同血管亚型并进行血流速度测量，通过静脉注射将一种荧光血浆试剂注入C57Bl/6小鼠体内，以标记与肝脏相关的血管系统。IVM能够 体内 实时测量特定目标血管中红细胞的流速。建立该方法将有助于在生理和病理条件下研究肝脏血流动力学。最终，这种基于成像的方法对于研究各种因素对肝脏血流的影响具有重要意义。 L. donovani 感染&#160;关于肝脏血流动力学。
该方法可应用于其他感染模型和小鼠器官，并可通过量化药物对血流的影响，进一步扩展至药物抗炎效应的临床前测试。

基于肝脏的自发荧光特性（图1，B和C图，绿色）、腹腔注射Hoechst标记肝细胞核（图1B，蓝色）以及静脉注射荧光标记BSA染色肝循环系统（图1C，红色），可清晰观察到肝脏中窦状隙的特定结构组织。肝脏由多种不同功能、结构和尺寸的血管亚型组成，其直径（D）范围为40–700 μm2（小血管直径为40–80 μm2，大血管直径超过300 μm2）。通过活体显微成像技术可高分辨率地观察肝脏血管系统的异质性与复杂性（图1C）。
为了监测单个血管中的血流速度，采用两种不同的方法对活体肝脏血管进行图像采集和数据分析。in vivo。第一种方法使用xyt扫描模式对目标血管中的血流进行实时成像（影片 1）。利用ImageJ软件中的MTrackJ插件对单个血管内单个红细胞（RBC）的速度进行定量分析（图 2A 和 <...

本文报道了一种利用活体显微成像结合特定图像采集与分析方法，对小鼠肝脏血管系统中单个血管内血流速度进行动态测量与定量的详细实验方法。

活体显微成像（intravital microscopy, IVM）是一种强大的光学成像技术，使得多种生物学过程的可视化、监测与定量分析成为可能……

本实验的总体目标是通过对小鼠肝脏进行活体显微成像，测量单个肝血管内的血流速度。该目标通过首先暴露肝脏并经静脉注射荧光血浆标记试剂以标记肝血管系统来实现。随后利用共聚焦显微镜实时观察肝窦及其内流动的红细胞。最后一步中，选择感兴趣的肝血管以测量其血流速度，并以高帧率和高分辨率采集肝脏血流的动态影像。最终可定量分析在正常生理条件下以及 leash mania 感染后各单条血管内的血流速度。该技术相较于其他现有方法（如 TOLA 超声和光学相干断层扫描）的主要优势在于，它具有更高的空间和时间分辨率，同时还能同步测量多个其他参数。在体内，该方法可提供微生物感染期间肝脏血流动力学的信息。该方法也可应用于其他系统，包括癌症和自身免疫性疾病中的器官生理学研究。该方法的可视化演示至关重要，因为若无实际操作经验，很难正确暴露肝脏血管并快速选择出显示荧光质膜试剂染色的血管。在开始操作前，使用杀菌消毒喷雾对工作区进行消毒，并将所有手术器械用70%乙醇消毒30分钟。然后通过观察动物对脚趾夹捏无反应来确认麻醉深度合适，剃除动物腹部毛发，并用聚维酮碘清洁手术区域。接着，在腹部左侧胸廓下方的皮肤和肌肉上做一个小切口，并在切口下方放置一块湿润的纱布。取出肝脏并置于纱布上，再将另一块湿润纱布覆盖在组织上方。然后将一块24 mm × 60 mm、厚度为150 µm的盖玻片用氰基丙烯酸酯粘附于金属框上，并将其置于肝脏表面。将小鼠翻转，并用另一块湿润纱布覆盖动物的眼睛。为测量肝脏血流速度，打开Leica应用系统软件并选择共振扫描模式。接下来，单击配置选项卡，选择激光器和氦氖 633 激光器。然后单击设置，选择 12 位分辨率。现在单击采集菜单，在光路设置窗口中，选择 63 倍物镜，并将 633 激光器功率设置为 100%。要激活光电倍增管的信号增益和偏移参数，请在第三个下拉菜单中选择 Alexa 633。在采集选项卡中，选择XYT采集模式，将格式宽度设置为1024×1024，速度设置为8,000赫兹，并选择针孔和3倍的缩放系数。然后，为了对肝脏结构进行Vidal成像，将小鼠放置在倒置共聚焦显微镜的载物台上，盖玻片和肝脏面朝下。在物镜上，将温控培养室的温度设置为29摄氏度。使用USB控制面板，根据注入的血浆试剂染料的荧光调整肝脏的焦距。为了利用XYT图像量化红细胞流速，首先点击实时图标，以实时模式观察血流情况。接着，选择感兴趣的区域，并选取特定的血管进行分析。在USB控制面板上调整x、y和扫描视野旋转坐标，使血管处于水平位置。然后停止使用实时模式，并将格式设置宽度更改为1024 × 256。在采集模式设置窗口中，将线平均和帧平均设置为1，并将堆栈设置为150。单击开始以获取图像。当所有图像获取完成后，打开 Image J 软件并打开目标文件。然后在插件菜单下，选择 loci 和 bio formats

intravital-microscopy-imaging-liver-following-leishmania-infection-an

Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

肝脏活体如下显微成像<em&gt;利什曼原虫</em&gt;感染：肝脏血流动力学的评估

一个 体内 成像系统用于对利什曼原虫（Trypanosomatid原生动物）感染小鼠的感染情况进行定量测量 利什曼原虫这是一种非侵入性且非致死性的方法，可用于在慢性感染过程中检测多种组织内表达荧光素酶的寄生虫。 利什曼原虫...

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我们展示了利用表达绿色荧光蛋白（GFP）的转基因疟原虫进行脾脏活体显微成像的方法，并对疟原虫在该器官内的运动性及血流情况进行定量分析。...

活体脾脏显微成像：寄生虫运动性与血流的定量分析

在肝脏中对免疫细胞进行稳定的活体高分辨率成像具有挑战性。本文提供了一种高灵敏度且可靠的方法，结合重症监护监测，利用活体多光子激光扫描显微镜，对小鼠肝脏中免疫细胞的迁移及细胞间相互作用进行长时间（约6小时）的观察研究。...

利用CXCR6.Gfp报告小鼠对健康与病变肝脏中免疫细胞进行长期活体多光子显微镜成像

我们建立了一种用于活体小鼠肝脏双光子成像的新型微创手术方案。利用该技术，我们揭示了脂多糖诱导的内毒素血症期间肝脏的精细结构。我们预计该方法可用于评估不同试剂治疗对肝内白细胞迁移的有效性。...

脂多糖处理小鼠肝脏中免疫反应期间白细胞的双光子活体成像

此处，我们提供了一套整合的实验方案，用于评估小鼠皮肤感染情况 Leishmania...

体内感染 Leishmania amazonensis 评估小鼠体内寄生虫毒力

本文通过生物发光成像和PCR技术，对经腹腔（IP）或牙龈内（IG）途径感染L. infantum-Luc的金黄地鼠进行纵向评估。在感染后第1天（1 dpi）、感染后第1周（8 dpi）和感染后第3周（22 dpi）对动物进行评估，并于感染后第50天（50th...

体内成像通过牙龈接种表达荧光素酶的无鞭毛体感染利什曼原虫婴儿株的仓鼠

本方案介绍了一种用于活体小鼠体内显微成像的前沿可重复使用肝脏成像工具（RHIT），该工具可增强组织稳定性，适用于快速和急性实验。RHIT采用3D打印设计，生产成本低，具有可扩展性和多功能性，能够实现对不同体型小鼠代谢过程的长期观察。...

可重复使用的肝脏成像工具：一种用于肝脏活体显微成像的可重复使用3D打印工具

一种用于腹股沟淋巴结（LN）活体显微观察的技术方案被概述。该技术可实现对淋巴结的实时、 体内...

腹股沟淋巴结的活体显微成像

我们开发了用于胸腺活体成像采集的新型实验工具和方案。该技术将有助于识别胸腺内发生T细胞发育的“微环境”。...

利用双光子显微镜对小鼠胸腺进行活体成像

双光子显微镜技术的最新进展已实现实时观察 在...

活体小鼠腘窝淋巴结成像

学习使用活体共聚焦显微成像技术测量小鼠肝脏血管中的血流速度。该方法通过荧光血浆标记实现实时可视化，可量化正常及利什曼原虫感染条件下的肝脏血流动力学变化。

肝脏活体显微成像利什曼原虫感染：肝脏血流动力学评估

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肝脏活体显微成像 利什曼原虫 感染：肝脏血流动力学评估

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