从肌肉活检中分离并永生化患者来源的细胞系用于疾病建模

以下实验的总体目标是从人类患者的肌肉活检组织中分离出纯化的肌细胞，并使其永生化，以用于后续研究。该目标的实现首先需要称重、切碎并消化所采集的组织，以解离出单核细胞。第二步，通过流式细胞术将肌源性细胞从非肌源性细胞中纯化出来。

接下来，将成肌细胞用CDK4和H端粒酶进行感染，以生成永生化细胞。结果显示，来源于患者的活体肌肉细胞可经过多代传代扩增，并能根据细胞融合实验、出现收缩的肌管以及成肌标志物的表达进行分化。该技术的意义不仅限于肌肉疾病的诊断，还可能为药物筛选或其他需要大量细胞的下游应用提供无限数量的成肌细胞。

我将与来自达拉斯伍迪·赖特（Woody Wright）博士实验室的博士后研究员杰罗姆·罗宾（Jerome Robbin）共同演示该实验步骤。首先从解离肌肉活检组织开始，以纯化成肌细胞。第一步，在组织培养用生物安全柜中，记录肌肉活检组织的质量。

接下来，在一个10厘米的培养皿中，使用无菌手术刀将组织切成细小的碎片。每克组织加入几滴1×H-BSS，以防止组织干燥。加入3.5毫升Dispase II溶液和3.5毫升胶原酶D溶液。

然后用25毫升移液管混匀细胞，并每隔15分钟将培养板转移至培养箱中。在90分钟内用5毫升移液管混匀细胞。应实现完全的组织解离。

组织解离后，加入两倍体积的生长培养基，通过100微米细胞筛过滤，将滤液收集至50毫升离心管中。在室温下以329 ×g离心10分钟，沉淀滤液中的细胞。

然后将细胞重悬于含0.5% BSA的HBSS中，计数细胞，并调整体积至每100微升含有100万个细胞。留出一份250,000个细胞的等分试样作为未染色对照，另留出两份相似的等分试样用于单染对照。

这些均为传真分析所必需的步骤。现在，每百万个细胞加入五微升抗 CD56 抗体进行染色，并将所有样品置于冰上孵育半小时。接着，用 10 毫升 HBSS 快速洗涤样品。

然后像之前一样离心收集细胞，但在4°C条件下进行；细胞沉淀形成后，弃去上清液，并将细胞沉淀重悬于X-H-B-S-S缓冲液中，浓度为每毫升500万个细胞。随后加入碘化丙啶，使其终浓度为每毫升1微克。接着根据纯化板的指示，通过流式细胞分选技术从非肌源性细胞中分离纯化肌源性CD56阳性细胞。

将成肌细胞以每孔50,000个的密度接种于涂有0.1%明胶的6孔板中进行培养，待细胞贴壁后，用病毒进行感染以实现细胞系的永生化。在文本方案中，还额外回顾了如何纯化和培养真皮成纤维细胞，具体步骤如文本方案所述。将Phoenix包膜细胞与质粒PolyJet混合物共同孵育过夜后，制备Phoenix包膜细胞。

用新鲜培养基喂养细胞，培养基由四份DME M1、一份199培养基和10%小牛血清组成。同时准备感染性包装。将约400,000个PA317细胞接种于六孔板中，每孔接种约400,000个PA317细胞。

12 小时后，收集 Phoenix tropic 细胞上含有病毒的上清液，并通过 0.45 微米滤器过滤。然后取 1 毫升上清液感染 PA three 17 细胞，并过夜培养。次日，当细胞接近汇合时，在培养基中加入浓度为 0.5 毫克/毫升的抗生素，筛选能够产生病毒的 PA three 17 细胞系，并在 12 小时间隔内分三次收集细胞上清液。

每次收获后对收集物进行过滤。滤液即为工作用病毒上清液。将其分装为每份一毫升。

留出少量等分试样用于立即使用。额外的等分试样可保存在负80摄氏度，但每次冻融循环将导致其效率降低50%。请注意，在整个操作过程中，所有接触过病毒颗粒的设备在丢弃至废物桶之前，必须用漂白剂清洗。

为长期保存稳定的PA三17病毒生产细胞系，将细胞悬浮于含10% DMSO和90%血清的冻存液中，每孔加入已纯化的细胞，于六孔板中每孔加入400 µL新鲜制备的病毒上清液。留出两孔不加病毒作为对照，置于-150°C保存。

将培养板孵育过夜，次日将每孔中的培养基更换为2.5毫升新鲜肌肉细胞培养基。务必将含有病毒颗粒的培养基和移液管丢弃至含漂白剂的容器中。让细胞在新鲜肌肉细胞培养基中继续孵育三天。

然后使用每毫升400微克的遗传霉素（neomycin）筛选CDK4感染的细胞，或使用每毫升300微克的潮霉素（hygromycin）筛选人端粒酶细胞。进行逆转录酶感染一周至两周。在筛选条件下培养细胞，直至处理组和对照孔中的细胞全部死亡。

在细胞达到融合状态之前始终进行传代，即使在筛选期间细胞达到60%至80%融合度时，也应使用0.05%胰蛋白酶-EDTA溶液收集并传代细胞。将细胞接种至10厘米培养皿中，加入含抗生素的新鲜成肌细胞培养基。首次接种时，每10厘米培养皿接种密度应非常低，为300至500个细胞。

将细胞在此类培养皿中培养约两周，直至形成含有10至20个细胞的小克隆。当小克隆明显可见时，移除大部分培养基，仅保留一层薄薄的培养基以防止细胞干燥。然后，将克隆环的一侧浸入硅基真空润滑脂中，并将该环覆盖于目标克隆上。

在每个环中，围绕每个目标克隆分别画一个不同的环。加入几滴胰蛋白酶EDTA溶液。当细胞变圆时，使用显微镜小心地将每团细胞吸入200微升移液枪头中。

将细胞团转移至可获取的最小规格多孔板的孔中。随后根据需要扩增每个克隆，以防止汇合。采用所述方案，分离得到了成肌细胞以及成纤维细胞、脂肪生成细胞，可能还包括免疫细胞，然后通过流式细胞分选进行纯化。

随后，按照所述方法，使用表达周期蛋白依赖性激酶4（CDK4）和人端粒酶逆转录酶（hTERT）的病毒对细胞进行永生化。在每一步骤中，必须将培养皿中的细胞密度维持在汇合度以下，因为细胞可能进入分化程序并形成肌管。通过比较非永生化对照细胞与永生化细胞中的肌管形成及收缩情况，未观察到任何差异。

通过测定端粒长度和端粒酶活性，确认了细胞系的永生化特性。细胞生长曲线也明显显示出永生化特征。观看本视频后，您应能充分理解如何从患者活检组织中分离原代肌肉细胞。

永生化原代成肌细胞，并分离和筛选永生化的成肌克隆。请注意，操作病毒时必须使用特定的组织培养罩和安全的通风系统。此外，所有涉及病毒操作的物品，如移液器、枪头、培养皿、注射器和滤器，都必须用漂白剂处理，以避免任何不必要的污染。

病毒颗粒可能具有危险性，因此在进行此操作时应始终采取预防措施。