Name: 从肌肉活检患者来源的细胞系疾病建模隔离和永生化 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 26 s
Description: 学习从人体肌肉活检中分离和永生化肌源性细胞的方法，使用FACS纯化细胞并通过CDK4和hTERT感染实现永生化。该技术为肌肉疾病研究和药物筛选提供无限细胞来源。

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本出版物由Cure CMD、法国肌肉疾病协会（AFM）资助（项目编号16297）以及美国国立卫生研究院（资助号：K08 AR059750、L40 AR057721 和 2R01NS047727）资助。

注意：人类组织采集方案必须经过机构伦理审查委员会（IRB）的审查和批准。波士顿儿童医院和布莱根妇女医院IRB委员会已批准对废弃的、去标识化的人类组织进行采集。以下所述方法已用于从去标识化、废弃的组织中分离成肌细胞。所述方法同样适用于从经患者知情同意采集的组织样本中分离细胞。
1. 细胞分离
<ol>
	<li>肌肉活检组织的解离与成肌细胞的纯化
	<ol>
		<li>在组织培养生物安全柜中预先称量一个10 cm组织培养皿的重量，然后再次称量含有肌肉活检组织的培养皿，以计算待解离组织的量。</li>
		<li>使用无菌手术刀将肌肉组织充分切碎，并加入几滴无菌1×HBSS，防止组织干燥。</li>
		<li>每克待消化的肌肉组织中加入3.5 ml dispase II和3.5 ml collagenase D。用无菌25 ml&#160;移液管将切碎的组织与酶溶液反复吹打数次。将培养皿置于37 °C、5% CO2的组织培养孵箱中孵育15 min&#160;，持续消化组织，直至匀浆可轻松通过无菌5 ml移液管。 
		注：通常在45–90 min内通过酶消化完成组织解离。更多细节请参见“代表性结果”部分。</li>
		<li>向已解离的组织中加入2倍体积的无菌生长培养基，通过100 µm细胞筛过滤至50 ml&#160;离心管中，并在室温下以329 × g（约1,100 rpm）离心10 min&#160;，收集细胞沉淀。培养基成分请参见材料表。</li>
		<li>将细胞沉淀重悬于1倍体积的无菌生长培养基中，并加入7倍体积的红细胞裂解液。将溶液通过40 µm细胞筛过滤，然后在室温下以329 × g离心10 min，收集细胞沉淀。</li>
		<li>使用血细胞计数板对细胞进行计数，并将细胞重悬于含0.5% BSA的1×HBSS中，浓度为1 × 106 个细胞/100 µl。预留约250,000个细胞于单个离心管中作为阴性（未染色）对照。另准备单色染色对照管，分别用于碘化丙啶（propidium iodide）和CD56染色，这些对照是通过FACS分选正确设门获取CD56阳性细胞所必需的。请参考细胞分选手册或咨询FACS分选核心设施专家，以确保包含适当的对照。</li>
		<li>使用抗CD56抗体（5 µl/106 个细胞）对拟分选的细胞进行染色。将所有样本（包括对照）置于冰上孵育30 min。</li>
		<li>用10 ml 1×HBSS洗涤样本，并在4°C下使用冷藏离心机以329 × g（约1,100 rpm）离心10 min&#160;，收集细胞沉淀。</li>
		<li>向待分选样本中加入碘化丙啶，终浓度为1 µg/ml，用于排除死细胞。使用荧光激活细胞分选仪从非成肌细胞中纯化CD56阳性的成肌细胞。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>皮肤活检组织的解离 
	注：当无法获取肌肉活检样本时，可从患者皮肤钻取活检组织中分离真皮成纤维细胞。真皮成纤维细胞可作为多种研究的生物材料，包括通过MyoD转导生成成肌细胞。此外，真皮成纤维细胞还可用于诱导生成iPS细胞，进而分化为多种细胞类型以供进一步研究。
	<ol>
		<li>将皮肤活检组织置于运输培养基中运送至实验室。样本收到后应尽快进行原代培养。若无法在当天建立原代培养，可将样本在室温下保存过夜。</li>
		<li>在超净工作台中将皮肤活检组织转移至无菌35 mm培养皿中。</li>
		<li>用无菌1×PBS在培养皿中冲洗皮肤活检组织，以去除血液和碎片。使用无菌手术刀去除脂肪组织。</li>
		<li>加入2 ml胶原酶溶液，并用手术刀切碎组织，根据组织大小在37 °C孵育45 min至1 hr。</li>
		<li>将消化后的组织转移至15 ml离心管中，用2 ml成纤维细胞培养基冲洗培养皿两次，并将冲洗液收集至同一离心管中。</li>
		<li>在室温下以200 ×&#160;g离心5 min&#160;，收集细胞沉淀。</li>
		<li>弃去上清液，用3 ml成纤维细胞培养基洗涤沉淀以去除胶原酶，再次离心收集细胞沉淀。培养基成分请参见材料表。</li>
		<li>重复步骤1.2.7一次。</li>
		<li>将细胞沉淀重悬于5 ml成纤维细胞培养基中，接种至T25无菌组织培养瓶中。将培养瓶置于37 °C、5% CO2条件下孵育。</li>
		<li>在接下来的1–3天内观察培养物中成纤维细胞的贴壁与生长情况。 
		注：部分小块组织也可能贴附于培养皿，成纤维细胞会从这些组织块中迁移而出。</li>
		<li>在相同条件下维持培养，直至成纤维细胞生长至约80%汇合度。</li>
		<li>通过胰酶消化收集成纤维细胞，并转移至新的培养瓶中进行扩增。胰酶消化操作：用无Ca++和Mg++的1×PBS洗涤培养物3次。向细胞中加入胰酶-EDTA（见材料表）（2 ml/T25培养瓶），在37 °C孵育2 min&#160;。</li>
		<li>将已脱落的细胞分种至其他培养瓶中。若部分组织块仍附着于原T25培养瓶，可向该瓶中加入5 ml新鲜培养基，成纤维细胞将持续迁移而出。 
		注：扩增后的成纤维细胞培养物可冻存为P1代，并储存在液氮中以备后续实验使用。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 肌源性细胞的永生化
<ol>
	<li>将500万个Phoenix Ecotropic包装细胞（PE）接种于10 cm无菌组织培养皿中，使用DMEM与Medium 199按4:1比例混合的培养基，添加10%小牛血清，过夜培养。</li>
	<li>转染前30分钟，用5 ml新鲜培养基（添加10 mM咖啡因）对细胞进行换液。</li>
	<li>将中量提取的质粒DNA（CDK4或hTERT质粒）2 μg与Polyjet混合均匀，按制造商建议在室温下孵育15分钟。</li>
	<li>将质粒/Polyjet混合物加入PE细胞中，过夜培养。</li>
	<li>用新鲜培养基（DMEM与Medium 199按4:1比例混合，添加10%小牛血清）更换培养液。12小时后，收集含病毒的上清液，并通过0.45 μm孔径滤器过滤。</li>
	<li>取1 ml收集的上清液感染amphotropic包装细胞系PA317 5，过夜后使用0.5 mg/ml新霉素（G418）筛选CDK4转导细胞，或使用0.5 mg/ml潮霉素筛选hTERT转导细胞，以获得稳定的病毒产生细胞系。</li>
	<li>将稳定包装细胞培养至接近汇合状态，制备工作用病毒上清液；连续三天，每天早晨、晚上和次日早晨各收集一次上清液。</li>
	<li>过滤病毒上清液，可直接使用，或分装为1 ml等份，于-80 °C保存备用。注意：每次冻融会使病毒感染效率降低50%。所有接触过病毒颗粒的物品在丢弃前必须用漂白剂清洗。 
	注意：稳定的PA317病毒产生细胞系可使用含10% DMSO和90%血清的冻存液冻存，并于-150 °C长期保存。</li>
	<li>将经FACS纯化的成肌细胞（见步骤1.1–1.9描述）以5 × 104 个细胞/孔的密度接种于涂有0.1%明胶的6孔板中。确保细胞已贴壁后再进行病毒感染。</li>
	<li>每孔加入400 μl过滤后的、新鲜制备或冻存的病毒上清液，过夜感染（保留2孔作为对照）。</li>
	<li>更换培养基，每孔加入2.5 ml新鲜肌肉细胞培养基（DMEM与Medium 199按4:1比例混合，添加15%胎牛血清；0.02 M HEPES缓冲液；1.4 mg/L&#160;维生素B12；0.03 mg/L&#160;ZnSO4；0.055 mg/L&#160;地塞米松；2.5 μg/L肝细胞生长因子和10 μg/L&#160;碱性成纤维细胞生长因子）。将含有病毒颗粒的培养基和移液器丢弃至含漂白剂的容器中。细胞继续在此培养基中培养3天以恢复，随后分别使用400 μg/ml新霉素（CDK4感染）或300 μg/ml潮霉素（hTERT感染）进行筛选处理。</li>
	<li>持续在药物筛选条件下培养细胞，直至对照组培养皿中的细胞死亡（1–2周）。</li>
	<li>在细胞达到汇合前（60–80%汇合度，使用0.05%胰蛋白酶-EDTA）进行传代，即使在筛选期间也应如此。将细胞重铺至多个10 cm培养皿中，使用新鲜成肌细胞培养基（如步骤2.11所述）并补充筛选药物。可将永生化筛选后的细胞作为异质性群体维持，或进行克隆以获得完全均一的遗传背景（每个细胞中外源基因插入位点相同）。</li>
	<li>采用以下步骤进行单克隆筛选：
	<ol>
		<li>以低密度接种细胞（例如，10 cm培养皿中接种300–500个细胞），培养约两周，直至形成小克隆（10–20个细胞）。</li>
		<li>此时移除大部分培养基，仅保留薄层液体以防止细胞干燥。</li>
		<li>将克隆环（一端浸有硅酮真空润滑脂）置于目标克隆上方，并加入数滴胰蛋白酶/EDTA。</li>
		<li>待细胞变圆后，用1 ml枪头或巴斯德移液管小心吸出细胞，转移至最小规格的多孔板中（96孔、48孔、24孔或12孔板）。</li>
		<li>根据需要扩增克隆，避免局部汇合。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

细胞作为一种有用的资源
分离和培养成肌细胞群体在建立疾病表型或 体外 疾病模型。本文所述的肌源性细胞分离方法可从骨骼肌标本中分离出成肌细胞和成纤维细胞，这些细胞随后可用于扩增、诱导分化或直接进行分析。通过显微镜观察、细胞存活率评估、细胞融合能力检测，或对RNA及蛋白质表达的分子学研究，可评估成肌细胞的结构与功能。此外，成肌细胞可分化为成肌管细胞，后者具有未成熟肌纤维的多种特征，从而可在肌肉发育及组织损伤后修复的背景下直接评估成肌细胞的功能。尽管上述表型在肌源性细胞早期传代中通常具有较好的可重复性，但许多原代肌源性细胞系的行为特征可能随着传代次数的增加而发生改变。因此，有时有必要对特定的肌源性细胞系进行永生化处理（如本文所述），这有助于简化细胞培养的建立过程，并在较长时间内获得可重复的实验结果。
特定细胞群体的筛选
本方案描述了使用荧光激活细胞分选（FACS）作为纯化手段，从骨骼肌组织中分离成肌细胞的方法。所提出的细胞筛选策略包括使用碘化丙啶（死细胞指示剂...

A correction was made to the authors section in: Isolation and Immortalization of Patient-derived Cell Lines from Muscle Biopsy for Disease Modeling
One of the authors names was corrected from:
Stacy C. Cossette
to:
Stacy A. Cossette

A correction was made to the authors section in: Isolation and Immortalization of Patient-derived Cell Lines from Muscle Biopsy for Disease Modeling

Erratum: Isolation and Immortalization of Patient-derived Cell Lines from Muscle Biopsy for Disease Modeling

分子诊断在过去20年中取得了显著进展。如今，基因组DNA已可常规地从痰液或口腔拭子中分离获得，而过去则需要通过抽血获取。得益于当前快速的检测周期和便捷的基因测序技术，许多致病突变已能被常规识别，无需额外检测。在肌肉疾病诊断领域，过去十年中已发现数十个与肌营养不良或肌病相关的新基因，这极大地改变了这些疾病的诊断方式1,2。目前，已有数十个基因被确认为导致肌营养不良和先天性肌病的原因，尽管其中许多基因致病的具体机制仍不明确。特别是罕见病由于患者人群规模小，诊断和研究面临较大挑战。因此，无论是罕见病还是更常见的疾病，建立稳定的工具以促进发病机制研究和治疗药物筛选都具有重要意义。
尽管DNA诊断技术已取得显著进展，但对于许多疑似患有原发性代谢或肌肉疾病的患者，仍需进行肌肉活检以确立初步诊断。当必须进行肌肉活检时，可在对患者额外风险极小的情况下，同时获取更多用于诊断和研究的组织样本。由于每份组织标本均有多种用途，因此建立一种简单、高效且仅需少量组织即可开展原代细胞培养的技术显得尤为重要。为最大限度地从组织中分离原代细胞并实现活体材料的长期保存，必须对肌肉或皮肤活检样本进行合理的分流处理。此外，干细胞研究和药物筛选在利用基于细胞的检测方法开发多种疾病疗法方面具有广阔前景3,4。
本文介绍了从人体肌肉或皮肤活检样本中分离原代细胞的方法。此外，还包括一种成肌细胞永生化方案，该方法有助于从个体样本中获得大量细胞。这些细胞可用于后续应用，例如定制药物筛选，而此类应用通常难以通过原代组织获得的有限数量细胞来实现。

<table><tbody><tr><td>仪器设备</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>组织&amp;nbsp;培养生物安全柜</td><td>Baker Company, Inc.</td><td>Model SterilGuard Hood</td><td></td></tr><tr><td>台式离心机，例如 Beckman 型号&amp;nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td>Model Allegra 6R</td><td>若进行细胞分选，建议使用带制冷功能的离心机</td></tr><tr><td>显微镜</td><td>尼康</td><td>Model Eclipse TS100</td><td></td></tr><tr><td>组织培养箱，连接至CO₂&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 源</td><td>Forma Scientific&amp;nbsp;</td><td>第二系列</td><td></td></tr><tr><td>荧光激活细胞分选仪（FACS）</td><td>Becton Dickinson</td><td>模型 Aria</td><td></td></tr><tr><td>从组织中分离原代成肌细胞的试剂</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dispase II</td><td>罗氏应用科学</td><td>#04942078001</td><td>在DMEM中配制2.4 U/ml的sock溶液</td></tr><tr><td>胶原酶D&amp;nbsp;</td><td>罗氏应用科学</td><td>#088882001</td><td>配制10 mg/ml的储备液</td></tr><tr><td>1x 无菌 Hank氏液&amp;rsquo;不含钙和镁的Hank's平衡盐溶液（HBSS）</td><td>GIBCO Life Technologies</td><td>#14185-052</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白，第五组分</td><td>Sigma</td><td>#05470</td><td>制备无菌的&amp;nbsp; 用于FACS分选的1X HBSS 0.5% BSA溶液</td></tr><tr><td>用于成肌细胞的无菌培养基：Dulbecco&amp;rsquo;s 改良伊格尔&amp;rsquo;高糖（4.5 g）DMEM培养基，添加30%胎牛血清</td><td>GIBCO Life Technologies</td><td>11965-092</td><td>含 L-谷氨酰胺</td></tr><tr><td>红细胞裂解液</td><td>Qiagen</td><td>158904</td><td></td></tr><tr><td>碘化丙啶储存液 10 mg/ml</td><td>Sigma</td><td>P4170</td><td>通过将粉末溶于无菌蒸馏水中来配制储备液</td></tr><tr><td>用于流式细胞术的抗人CD56抗体</td><td>Biolegend</td><td>318310</td><td>APC标记的抗体，其他标签也可提供</td></tr><tr><td>原代成肌细胞永生化试剂</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>嗜鼠包装细胞系 PE</td><td>Cell Biolabs</td><td>RV-101</td><td></td></tr><tr><td>兼嗜性包装细胞系 PA3174</td><td>Cell Biolabs</td><td>RV-102</td><td></td></tr><tr><td>猪皮明胶</td><td>Sigma</td><td>G1890-500g</td><td>配制0.1%明胶水溶液作为储备液。将培养皿用该溶液在37℃下进行包被。&amp;deg;37°C 孵育一小时。移除溶液，加入培养基。</td></tr><tr><td>PolyJet&amp;nbsp;</td><td>Signagen</td><td>SL100688</td><td></td></tr><tr><td>G418</td><td>Fisher</td><td>345812</td><td></td></tr><tr><td>潮霉素</td><td>EMD Biosciences</td><td>400051</td><td></td></tr><tr><td>含有 mCDK4 和 hTERT 的 pBabe 质粒</td><td>非商业供应</td><td></td><td>Stadler 等，2013</td></tr><tr><td>Qiagen 质粒中量提取试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>12143</td><td></td></tr><tr><td>Medium 199</td><td>Life Technologies&amp;nbsp;</td><td>Medium 199 (31150022)</td><td></td></tr><tr><td>杜尔贝科&amp;rsquo;DMEM（杜尔贝科改良伊格尔培养基）</td><td>Life Technologies&amp;nbsp;</td><td>DMEM (11965-092)</td><td>DMEM:199（4:1）混合液</td></tr><tr><td>成肌细胞生长培养基：4:1 Dulbecco&amp;rsquo;改良型伊格尔培养基（DMEM）和199号培养基（Medium 199），添加15%胎牛血清；0.02 M HEPES缓冲液；1.4 mg/L维生素B12；0.03 mg/L ZnSO4；0.055 mg/L地塞米松；2.5 &amp;mu;克/升肝细胞生长因子和10 &amp;mu;g/L β成纤维细胞生长因子</td><td>Life technologie（DMEM，F199）；Atlanta Biological（FBS）；Invitrogen（Hepes）；Fisher（ZincSulfate）；Sigma（Vit.B12，Dexamethasone）；Chemicon international（HGF）；Biopioneer（betaFGF）&amp;nbsp;</td><td>#15630-080（Hepes）；#Z68-500（ZnSO）；#V2876.#D4902（维生素B12，Dex）；GF116（HGF）；HRP-0011（bFGF）&amp;nbsp;</td><td>准备培养基和储备液：维生素B12（20 mg/ml）；硫酸锌（60&amp;micro;g/ml）；Dex（55&amp;micro;克/&amp;micro;l) 分装保存以便于使用。HGF 储存液（5&amp;micro;微克/毫升）和 FGF（20&amp;micro;g/ml）应每周新鲜添加，至最终工作浓度。</td></tr><tr><td>TrypLE express</td><td>GIBCO Life Technologies</td><td>12605-010</td><td></td></tr><tr><td>用于免疫染色的肌球蛋白重链抗体</td><td>发育型杂交瘤库</td><td>MF20</td><td>克隆 MF20</td></tr><tr><td>用于免疫染色的Desmin抗体</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>MS-376-S0</td><td>克隆 D33</td></tr><tr><td>马血清</td><td>Invitrogen</td><td>26050-088</td><td></td></tr><tr><td>原代皮肤成纤维细胞分离试剂</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>运输培养基：RPMI 1640 添加 10% 胎牛血清和 0.2% 青霉素/链霉素</td><td>RPMI 1640 培养基：GIBCO Life Technologies</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>人原代成纤维细胞培养基：RPMI 1640 培养基添加 10% 胎牛血清和 1% 青霉素/链霉素</td><td>胎牛血清：Thermo Scientific</td><td>SH30071.03</td><td></td></tr><tr><td>胶原酶溶液：将胶原酶 II 型（100 mg）溶于 12.5 ml 成纤维细胞培养基中，过滤除菌</td><td>沃辛顿</td><td>4176</td><td></td></tr><tr><td>无钙无镁无菌 1X 磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>Lonza</td><td>17-516F</td><td></td></tr><tr><td>分离原代成肌细胞的材料</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 ml 和 15 ml 无菌锥形管</td><td>GeneMate/Bioexpress</td><td>C-3394-4（50 ml）；C3394-1（15 ml）</td><td></td></tr><tr><td>无菌手术刀</td><td>Aspen Surgical</td><td>372610</td><td></td></tr><tr><td>血细胞计数板</td><td>豪泽科学</td><td>1492</td><td></td></tr><tr><td>无菌的5、10和25 ml移液管</td><td>贝尔科玻璃</td><td>1226-05010（5 ml）；1200-10010（10 ml）；1228-25050（25 ml）</td><td>可重复使用的移液管在使用前需清洗、塞入棉花并进行高压灭菌</td></tr><tr><td>无菌组织培养处理的塑料培养皿（10 cm）</td><td>BD Falcon</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>无菌尼龙细胞滤网（100 &amp;micro;米和40 &amp;micro;m 大小）</td><td>BD Falcon</td><td>352340 (40&amp;micro;米）；352360（100&amp;micro;m)</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;用于成肌细胞永生化的材料</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>无菌 0.45 &amp;micro;m 滤膜</td><td>Millipore</td><td>SLHV013SL</td><td></td></tr><tr><td>克隆环</td><td>康宁</td><td>#3166-8</td><td>使用前后需清洗并高压灭菌</td></tr><tr><td>成纤维细胞系所需材料&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>无菌35 mm组织培养处理塑料培养皿</td><td>Greiner bio-one</td><td>628160</td><td></td></tr><tr><td>无菌手术刀</td><td>DeRoyal</td><td>D4510A</td><td></td></tr><tr><td>无菌T25细胞培养瓶</td><td>Techno Plastic Product, TPP</td><td>90026</td><td>由MIDSCI在美国销售</td></tr><tr><td>TrypLE express</td><td>GIBCO Life Technologies</td><td>12605-010</td><td></td></tr></tbody></table>

从肌肉活检中分离并永生化患者来源的细胞系用于疾病建模

Isolation and Immortalization of Patient-derived Cell Lines from Muscle Biopsy for Disease Modeling

患者特异性细胞系的建立是诊断或转化医学研究中极为宝贵的工具，这些细胞可从患者诊断过程中获取的皮肤或肌肉活检组织中分离获得。本方案中，我们描述了一种从小量肌肉或皮肤组织中分离活细胞用于原代培养的技术。此外，我们还提供了一种将原代细胞来源的成肌细胞系和成纤维细胞系永生化的方法。一旦细胞系实现永生化，即可实现患者来源细胞的大规模扩增。永生化细胞适用于多种下游应用，包括药物筛选和 体外 纠正基因突变。总体而言，这些方案为生成和保存患者来源的细胞以用于后续应用提供了可靠的工具。

图1 展示了原代组织解离过程中的一些关键步骤：将精确称量的组织置于无菌的组织培养培养皿中（图1A, B）。随后使用无菌手术刀将组织精细切碎，直至形成组织浆液（图1C, D）。加入消化酶后，通常在45–90分钟内通过酶消化法完成原代肌肉组织的解离。为防止过度消化和细胞死亡，通常每15–20分钟监测一次组织消化的进程。每15–20分钟可轻柔地用移液器吹打并混匀数次。消化步骤结束后，细胞悬液依次通过100 µm（图1E, F）和40 µm滤网进行过滤。根据起始肌肉组织的量以及样本来源于轻度或重度病变肌肉的不同，所获得的解离原代细胞具有异质性。图1G 显示了消化后立即悬浮的单核细胞示例，而 图1H 显示了消化并接种于组织培养皿后3–6小时的解离原代细胞示例。成肌细胞通常与成纤维细胞和脂肪生成细胞混合存在。在患者疾病伴有炎症的情况下，也可能存在免疫细胞。因此，可能需要对不同类型的细胞进行前瞻性分离。对于人成肌细胞的前瞻性分离，CD56或N-CAM...

本方案描述了从肌肉或皮肤组织中分离活细胞并建立成肌细胞和成纤维细胞原代培养体系的技术。同时介绍了一种使这些细胞系永生化的方法。总体而言，这些方案为获取和保存患者来源的细胞以用于后续应用提供了可靠的工具。

患者特异性细胞系的建立是诊断或转化医学研究中不可或缺的工具，这些细胞可以被收集……

以下实验的总体目标是从人类患者的肌肉活检组织中分离出纯化的肌细胞，并使其永生化，以用于后续研究。该目标首先通过称重、切碎并消化所采集的组织，从而解离出单核细胞来实现。第二步，利用流式细胞术将肌源性细胞与非肌源性细胞分离纯化。接下来，将成肌细胞同时感染CDK4和hTERT，以生成永生化细胞。结果表明，来源于患者的活体肌肉细胞可进行多次传代扩增，并能根据细胞融合实验、出现收缩的肌管以及成肌标志物的表达进行分化。该技术的意义不仅限于肌肉疾病的诊断，还可能为药物筛选或其他需要大量细胞的下游应用提供无限数量的成肌细胞。我将与来自达拉斯伍迪·赖特（Woody Wright）博士实验室的博士后研究员杰罗姆·罗宾（Jerome Robbin）共同演示该实验步骤。首先从肌肉活检组织的解离开始，以纯化肌源性细胞。第一步，在组织培养用生物安全柜中，称量肌肉活检组织的质量。接下来，在一个10厘米的培养皿中，使用无菌手术刀将组织切成细小的碎片。每克组织加入几滴1×H-BSS，以防止组织干燥。加入3.5毫升Dispase II溶液和3.5毫升胶原酶D溶液。然后用25毫升移液管混匀细胞，并每隔15分钟将培养板放入培养箱中。在90分钟内用5毫升移液管混匀细胞。应实现完全的组织解离。组织解离后，加入两倍体积的生长培养基，通过100微米滤网过滤。将滤液收集至50毫升离心管中。在室温下以329 ×g离心10分钟，沉淀滤液中的细胞。然后将细胞重悬于含0.5% BSA的HBSS中，并计数。调整体积至每100微升含有100万个细胞。保留250,000个细胞的等分试样作为未染色对照，并保留两个类似的等分试样作为单染对照。这些均为传真分析所必需的步骤。现在，每百万个细胞加入五微升抗 CD56 抗体进行染色，并将所有样品置于冰上孵育半小时。接着，用 10 毫升 HBSS 快速洗涤样品。然后像之前一样离心收集细胞，但在4°C条件下离心；细胞沉淀形成后，弃去上清液，并将细胞沉淀重悬于X-H-B-S-S缓冲液中，浓度为每毫升500万个细胞。随后加入碘化丙啶，使其终浓度为每毫升1微克。接着根据纯化板的指示，通过流式细胞分选技术从非肌源性细胞中分离纯化肌源性CD56阳性细胞。将成肌细胞以每孔50,000个的密度接种于涂有0.1%明胶的6孔板中进行培养，待细胞贴壁后，用病毒进行感染以实现细胞系的永生化。在文字版实验方案中，还额外提供了如何纯化和培养真皮成纤维细胞的详细说明。在转染前，将Phoenix亲嗜性细胞与质粒PolyJet混合物共同孵育过夜以进行准备。用新鲜培养基喂养细胞，培养基由四份DME M1、一份199培养基和10%小牛血清组成。同时准备促动力包装。在六孔板中接种PA317细胞，每孔约400,000个PA317细胞。12 小时后，收集 Phoenix tropic 细胞上含有病毒的上清液，并通过 0.45 微米滤器过滤。然后取 1 毫升上清液感染 PA three 17 细胞，过夜培养。次日，当细胞接近汇合时，在培养基中加入浓度为 0.5 毫克/毫升的抗生素，筛选可产生病毒的 PA three 17 细胞系，并在 12 小时间隔内分三次收集细胞上清液。每次收获后对收集物进行过滤。滤液即为工作用病毒上清液。将其分装为每份一毫升。留出少量等分试样用于立即使用。额外的等分试样可保存在负80摄氏度，但每次冻融循环将损失50%的活性。请注意，在整个操作过程中，所有接触过病毒颗粒的设备在丢弃至废物桶之前，必须用漂白剂清洗。为长期保存稳定的PA三17病毒生产细胞系，将细胞悬浮于含10% DMSO和90%血清的冻存液中，每孔加入已纯化的细胞，于六孔板中每孔加入400 µL新鲜制备的病毒上清液。留出两孔不加病毒作为对照，置于-150°C保存。将培养板孵育过夜，次日将每孔中的培养基更换为2.5毫升新鲜肌肉细胞培养基。务必将含有病毒颗粒的培养基和移液管弃置入含漂白剂的容器中。让细胞在新鲜肌肉细胞培养基中继续孵育三天。然后，对于CDK4感染，使用每毫升400微克的遗传霉素进行细胞抗性筛选；对于人端粒酶，则使用每毫升300微克的潮霉素。进行逆转录酶感染，持续一至两周。在筛选条件下培养细胞，直至处理组和对照孔中的细胞全部死亡。在细胞达到融合状态之前始终进行传代，即使在筛选过程中，当细胞融合度达到60%至80%时，也应使用0.05%胰蛋白酶-EDTA溶液收集并传代细胞。将细胞接种至10厘米培养皿中，使用含抗生素的新鲜成肌细胞培养基。首次接种时，每10厘米培养皿接种极低密度的细胞，即300至500个细胞。将细胞在这些培养皿中培养约两周，直至出现由10至20个细胞组成的小克隆集落。当小克隆明显可见时，移除大部分培养基，仅保留一层薄薄的培养基以防止细胞干燥。随后，将克隆环的一侧浸入硅基真空润滑脂中，并将该克隆环覆盖于目标克隆上。在每个环中，用不同的环圈出每个需要的克隆。加入几滴胰蛋白酶EDTA溶液。当细胞变圆时，使用显微镜小心地将每团细胞吸入200微升移液器吸头中。将细胞团转移至可获取的最小规格多孔板的孔中。随后根据需要扩增每个克隆，以防止细胞汇合。采用所述方案，分离得到了成肌细胞以及成纤维细胞、脂肪生成细胞，可能还包括免疫细胞，然后通过FACS进行纯化。随后，按照所述方法利用表达周期蛋白依赖性激酶4（CDK4）和人端粒酶逆转录酶（hTERT）的病毒对细胞进行永生化。每一步都必须将培养皿中的细胞密度维持在汇合度以下，因为细胞可能进入分化程序并形成肌管。通过比较非永生化对照细胞与永生化细胞中的肌管形成及收缩情况，未观察到任何差异。通过测定端粒长度和端粒酶活性，确认了细胞系的永生化特性。细胞生长曲线也明显显示出永生化特征。观看本视频后，您应能充分理解如何从患者活检组织中分离原代肌肉细胞。永生化原代成肌细胞，并分离和筛选永生化的成肌克隆。请注意，操作病毒时必须使用特定的组织培养罩和安全的通风系统。此外，所有涉及病毒操作的物品，如移液器、枪头、培养皿、注射器和滤器，都必须用漂白剂处理，以避免任何意外污染。病毒颗粒可能具有危险性，因此在进行此操作时应始终采取预防措施。

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从肌肉活检患者来源的细胞系疾病建模隔离和永生化

显微解剖外植体技术是一种稳健且可靠的方法，可用于从幼年、成年或胚胎期肌肉中分离出具有增殖能力的骨骼肌细胞，以获取骨骼肌干细胞。这些细胞具有独特性，可通过克隆化培养获得骨骼肌干细胞系，用于体内移植。...

成年与胚胎骨骼肌微植块培养及骨骼肌干细胞的分离

肌纤维的分离与培养是金标准 体外...

分离与培养成年骨骼肌单个肌纤维及其卫星细胞

从人类肌肉中获得的主要贴壁细胞类型为成肌细胞和成纤维细胞。本实验通过基于CD56抗原的磁性激活细胞分选技术对细胞群体进行富集。随后使用特异性抗体进行免疫标记，并结合图像分析技术，实现对单个细胞胞质和细胞核特征的定量分析。...

人骨骼肌中初级成肌细胞和成纤维细胞的分离与定量免疫细胞化学表征

本方案利用电穿孔技术将荧光标记的蛋白质导入小鼠肌纤维并使其表达。电穿孔后经恢复，分离肌纤维。随后使用高分辨率共聚焦显微镜对单根纤维进行成像，以观察肌肉结构。...

DNA电穿孔、肌纤维的分离与成像

在此，我们介绍一种从成人肌肉组织中获取纯化人成肌细胞群体的方法。这些细胞可用于研究 体外 骨骼肌分化，特别是研究参与钙离子（Ca）相关过程的蛋白质2+...

人原代成肌细胞的分离、成肌分化评估及牵张激活钙内流检测

我们介绍了从骨骼肌活检组织中分离、培养、鉴定和诱导人原代肌前体细胞（hMPCs）的技术。...

从骨骼肌活检手术中分离、培养、鉴定及诱导人肌肉前体细胞分化

成肌细胞是能够增殖的前体细胞，可分化形成多核的肌管，并最终发育为骨骼肌肌纤维。本文介绍一种从小鼠成年早期骨骼肌中高效分离和培养原代成肌细胞的实验方案。该方法可用于在体外培养条件下对肌肉细胞进行分子、遗传和代谢方面的研究。...

从小鼠骨骼肌组织外植体中分离和分化原代成肌细胞

本文提出一种方法，可从纯合突变型Lamin...

单根肌纤维的分离与培养：早产后发育阶段Emery-Dreifuss型肌营养不良小鼠模型的研究

本方案描述了将皮肤成纤维细胞转化为成肌细胞，并进一步分化为肌管细胞的过程。这些细胞系来源于患有神经肌肉疾病的患者，可用于研究病理机制以及测试治疗策略。...

直接重编程人类成纤维细胞为成肌细胞以研究神经肌肉疾病疗法

本方案描述了从小鼠单个骨骼肌中分离肌肉干细胞和纤维脂肪形成祖细胞的方法。该方案包括单块肌肉解剖、通过荧光激活细胞分选法分离干细胞、免疫荧光染色评估纯度，以及通过5-乙炔基-2′-脱氧尿苷掺入实验定量检测S期进入情况。...

从单个骨骼肌中分离静息态干细胞群体

本方案通过组织解离、连续过滤、预贴壁及特定培养条件，提供了一种从成年和新生小鼠骨骼肌中分离和富集原代成肌细胞的标准化方法，可用于建立和维持由卫星细胞衍生的成肌细胞培养体系，以支持后续实验应用。...

分离骨骼肌卫星细胞以 体外 肌生成研究

学习从人体肌肉活检中分离和永生化肌源性细胞的方法，使用FACS纯化细胞并通过CDK4和hTERT感染实现永生化。该技术为肌肉疾病研究和药物筛选提供无限细胞来源。

从肌肉活检中分离并永生化患者来源的细胞系用于疾病建模

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