Name: 在小鼠大肠传入结尾的体外功能研究 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 9 s
Description: 了解小鼠结肠直肠传入神经末梢的体外单纤维电生理记录方法。该方案通过分离神经束、电刺激识别感受野并测试机械与化学敏感性，用于研究五类机械敏感神经末梢的功能特性。

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由NIH资助项目R01 DK093525（GFG）支持。我们非常感谢匹兹堡大学Amber Shaffer博士对本文稿的科学审阅和语法修改，同时感谢Michael Burcham在图表准备过程中提供的帮助。

注意：本方案已通过匹兹堡大学机构动物护理和使用委员会的审查与批准。
1. 改良克雷布斯溶液和测试药物等分试样的制备
<ol>
	<li>配制6 L改良Krebs溶液，其成分如下（单位：mM）：117.9 NaCl，4.7 KCl，25 NaHCO₃3, 1.3 NaH2PO4，1.2 MgSO₄4，2.5 CaCl211.1 D-葡萄糖，2 丁酸钠，20 醋酸钠，0.004 硝苯地平（用于阻断自发性肌肉收缩），以及 0.003 吲哚美辛（用于抑制内源性前列腺素的合成）。组织解剖使用冰冻的克雷布斯液，单纤维记录使用温热的克雷布斯液。</li>
	<li>配制任何化学溶液（例如， IS、辣椒素（capsaicin）、ATP）按所需浓度分装。</li>
</ol>
2. 结肠直肠-神经组织的解剖
<ol>
	<li>将雄性小鼠（6 - 8 周龄，20 - 30 g）置于 CO2 麻醉/安乐死舱中，气体流速设定为每分钟置换舱内体积的 10 - 30%，直至小鼠完全停止呼吸，以胸壁运动完全消失为准。</li>
	<li>安乐死后立即行放血操作：切开胸腔，穿刺右心房，并将小鼠尸体浸入足量（约 500 ml）冰浴（4 °C）、持续通入碳合气（95% O2，5% CO2）的 Krebs 溶液中。</li>
	<li>小心去除除结肠及盆腔器官外的所有内脏组织。在略高于膈肌的 T12 脊髓节段处将小鼠身体横断，将尾侧半段转移至盛有冰浴、通碳合气 Krebs 溶液的解剖腔室中。</li>
	<li>在体视显微镜下，于膀胱和生殖器官与尿道连接处进行横断以将其去除，并游离腹主动脉至其分叉为左右髂总动脉处。通过钝性分离松解 PN 或 LSN 与其周围组织，沿髂嵴外侧追踪神经，直至其从前侧进入 L6 和 S1 脊柱节段（PN）或 T13 和 L1 脊柱节段（LSN）的位置。</li>
	<li>切断耻骨联合以及左右髋臼关节，去除髂骨。小心地从靠近直结肠处开始，将 PN 或 LSN 从附着的肌肉和结缔组织中游离，直至神经进入脊柱的入口处。</li>
	<li>进一步切除髂骨以暴露远端直结肠。连续完整地解剖出远端直结肠及其附着的 PN 或 LSN。</li>
	<li>将带有神经附着的直结肠转移至组织浴槽的灌流腔室中。通过进一步解剖去除多余的结缔组织，并沿对系膜缘纵向剖开直结肠。</li>
	<li>将直结肠黏膜面朝上，用针固定其系膜侧边缘于腔室硅胶基底上，靠近记录腔室一侧；将对系膜侧的直结肠段连接至与力传感器相连的钩状支架（如 图 1 所示，图 2A 所示为实物照片）。</li>
	<li>将 PN 或 LSN 延伸至记录腔室，该腔室通过小鼠孔和闸门与灌流腔室相连。轻柔地将神经干置于记录腔室内的小玻璃镜面上，该镜面提供亲水表面以利于神经附着。以温热（30 - 32 °C）、含氧 Krebs 溶液持续灌流灌流腔室，并在记录腔室内填充石蜡油。</li>
</ol>
3. 单纤维记录及感受野定位
<ol>
	<li>在体视显微镜下以高倍放大（50 - 60X）小心剥离坐骨神经（PN）或下腹下神经（LSN）的神经外膜（神经鞘）。使用精细镊子将神经干分离成5 - 8束直径约100 µm的神经束。</li>
	<li>将铂铱参考电极与组织浴槽中的Krebs溶液接触。依次将各神经束放置于由相同材料制成的记录电极上。</li>
	<li>使用柔软的画笔轻轻上下刷拭结肠直肠表面，以诱发结肠直肠传入神经的动作电位（AP）。通过可检测到的动作电位（AP）记录，定位支配结肠的神经束。 
	注意：PN和LSN还支配膀胱及其他盆腔器官。</li>
	<li>使用一对30 G针尖进一步将神经束分离为直径约10 µm的细小束膜纤维，并将单根纤维置于记录电极上。</li>
	<li>将圆头同心电极垂直置于黏膜表面，以超阈值刺激强度（10 mA，0.5 msec持续时间，频率0.3 Hz）电刺激传入末梢，产生约2 mm半径的电流扩散。沿展平的结肠直肠长度和宽度方向系统移动电极（步进约1.5 mm），以定位感受野末梢。</li>
	<li>当传入末梢被激活时，调整电极位置以精确定位所需刺激强度最小的激活位点（感受野，RF），即刺激阈值。弃用刺激阈值&#62;3 mA19的末梢。</li>
	<li>根据以下两项计算传导速度（CV）：1）感受野（RF）处刺激电极与记录位点之间的距离；2）刺激伪迹与动作电位起始之间的传导延迟（例如，图2B）。 
	CV（m/sec）= 距离（mm）/ 传导延迟（msec）。</li>
</ol>
4. 机械敏感性结直肠传入神经的功能分类
<ol>
	<li>通过电刺激定位到感受野（RF）后，对RF施加以下三种机械刺激：
	<ol>
		<li>使用校准的类似von Frey的尼龙单丝（0.4 和 1 g 力）垂直按压扁平化结肠直肠上的RF，进行探触刺激。</li>
		<li>使用细尼龙丝（10 mg 力）轻轻划过结直肠黏膜，对RF产生轻微的表面剪切应力，进行拂刷刺激。</li>
		<li>使用计算机控制的力致动器沿结肠直肠对系膜缘，通过步骤 2.8中所述的钩耙装置施加环向牵张，产生梯度增加的牵张力（0 - 170 mN，以5 mN/sec速率递增）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>根据反应特征将传入神经分类为：仅对钝性探触有反应的浆膜型、对黏膜拂刷和钝性探触均有反应的黏膜型、对环向牵张和钝性探触有反应的肌层型、对环向牵张、黏膜拂刷和钝性探触均有反应的肌层-黏膜型，或对上述三种机械刺激均无反应的MIA型（机械不敏感传入神经）。</li>
	<li>对于主要分布于LSN支配区域且难以通过电刺激选择性激活的肠系膜传入神经，可通过机械性拂刷或探触肠系膜来定位其感受末梢。</li>
	<li>对于牵张敏感的传入神经（肌层型及肌层-黏膜型），测定其反应阈值，定义为在梯度牵张过程中引发首个动作电位（AP）所需的力值。</li>
	<li>对于浆膜型传入神经，记录其在计算机控制的力致动器驱动下，对感受野施加递增强度的点状探触刺激所产生的反应。</li>
</ol>
5. 感受末梢的化学应用/调节
<ol>
	<li>记录对机械刺激的基线反应（即， 对梯度拉伸、点状探压或黏膜刷拭的反应。</li>
	<li>将一段管材（黄铜或不锈钢，高10 mm，4 × 4 mm）的底边涂覆2 用凡士林密封方形或直径4-5 mm的区域，并将其置于结肠直肠的感受野上。</li>
	<li>移除管路内的克雷布斯液，将感受末端暴露于含有待测化学物质的溶液中 3 至 5 分钟，溶液体积为 170 μl。</li>
	<li>在化学物质施加期间监测传入神经的反应（某些传入神经具有化学敏感性）。</li>
	<li>移除化学溶液及管路以终止化学作用。在4至6分钟内，用与基线反应相同的机械刺激测试传入反应。</li>
	<li>在充分洗脱后，再次施加机械刺激&#62;15 分钟。</li>
</ol>
6. 记录和区分动作电位尖峰
<ol>
	<li>以 20 kHz 的频率对从轴突记录的电信号进行数字化，并将数据保存至计算机。通过音频监视器实时监测信号。</li>
	<li>离线分析动作电位（AP）峰电位，并基于单个峰电位波形的主成分分析来区分单个神经元单位25。 
	注意：一个记录中应包含不超过两个易于区分的活跃单位。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

该 体外 此处描述的结肠-直肠神经制备方法已被证明是研究单个结肠直肠传入神经神经编码功能的有力手段，可很好地补充其他非功能性研究方法例如， 细胞、分子和组织学研究）对内脏感觉神经元（参见综述 27 有关细节，请参见正文）。参与伤害感受及长期结直肠高敏感性的神经机制已被揭示，并已开展药理学干预实验，明确了可能缓解内脏疼痛的作用靶点。以下将讨论成功实施该实验准备工作的几个关键要点：1）降低电噪声干扰；2）提高信号检测灵敏度；3）选用标准化刺激以评估传入信号编码的变化。此外，本文还讨论了该技术的若干局限性。
沿神经轴突在细胞内传播的动作电位（APs）通常具有100 - 130 mV的跨膜电位。然而，由于轴突膜的比电容较小，这种相对较大的去极化仅导致跨细胞膜的微小电荷位移，该电荷极易消散到周围的细胞外组织/间质液中（其电导率远低于脂质膜）。在对神经细丝/轴突进行细胞外记录时，电信号通常处于微伏级别，接近典型生物电信号记录系统中热噪声/白噪声的幅度，因此成功记录的首要任务是降低噪声。为了最有效地屏蔽环境电噪声，可将组织浴槽、记录电极和...

疼痛和感觉过敏是功能性胃肠道疾病患者的主要主诉，包括肠易激综合征（IBS），这些症状在无明显病理生物学原因或组织损伤的情况下存在。例如，IBS 患者表现出感觉过敏，包括对直肠气囊扩张的反应增强、在正常肠道功能期间敏感性增加，以及躯体牵涉性过敏（即 腹部区域触诊时压痛）1。由于靶向结直肠传入神经已被证明可有效缓解 IBS 患者的疼痛和感觉过敏（例如 直肠内给予局部麻醉剂2,3；口服鸟苷酸环化酶-C 激动剂利那洛肽4-6），因此加深对结直肠传入神经支配的理解具有重要意义。
内脏传入神经，包括结直肠传入神经，能够对化学/营养物质和温度刺激产生反应（例如，7-9）。然而，对机械刺激（即，机械敏感性传入神经）发生反应的内脏传入神经被研究得最为深入，因为机械刺激（例如，管腔扩张、牵拉）通常是引发意识感知（包括不适和疼痛）的主要原因10-16。此外，内脏还受到机械不敏感传入神经（MIAs）的支配，这类神经通常被称为“静息性”或“休眠性”伤害感受器17。在正常的生理条件下，MIAs 对机械刺激无反应或反应阈值极高18，但在病理生理状态下可被激活并获得机械敏感性，从而参与痛觉过敏的形成。
使用 体外 根据此处所述的制备方法与实验方案，我们开发并采用了一种电刺激策略来搜寻感受性末梢，从而能够无偏倚地识别结直肠中的机械敏感性末梢和MIA末梢19结直肠的神经支配来源于腰交感神经（LSN）和盆神经（PN）通路，包括可划分为五类机械敏感性传入纤维（浆膜型、黏膜型、肌层型、肌层-黏膜型、肠系膜型）以及一类MIA传入纤维20. 使用这种方法 体外 制备过程中，我们发现结直肠机械不敏感传入纤维（MIAs）在短暂暴露于炎症混合物（IS）后获得了机械敏感性。该处理使盆神经（PN）通路中71%的MIAs发生致敏，以及下腹神经（LSN）通路中23%的MIAs发生致敏。19我们还记录了在长期行为性内脏高敏感性背景下，MIAs的长期致敏现象（长达28天）。即， 在经结肠内给予酵母聚糖治疗的小鼠中21 或2,4,6-三硝基苯磺酸（TNBS）22).
在机械敏感性传入神经中，肌层和肌层-黏膜传入神经是唯一能够持续编码结直肠周向牵张的类别（即， 对拉伸敏感）并介导有害性结直肠扩张的编码23,24使用计算机控制的力致动器，我们对展平的结直肠组织沿周向施加了标准化、均一且可重复的渐进式拉伸，并进一步将对拉伸敏感的传入神经分为低阈值和高阈值两类23此外，还研究了结肠内注射酵母聚糖后牵张敏感传入神经元致敏作用的时间进程21 或TNBS22 治疗对应于行为性内脏高敏感性的起始、持续和/或恢复，提示牵张敏感性结直肠传入神经在内脏痛和内脏高敏感性中的作用。

<table><tbody><tr><td>Leica MZ16 体视显微镜</td><td>Leica Microsystems Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica IC D 相机</td><td>Leica Microsystems Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>放大器</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>SYS-DAM80</td><td>低噪声差分放大器</td></tr><tr><td>双室组织浴槽</td><td>定制</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Power1401</td><td>Cambridge Electronic Design Limited</td><td>Power1401</td><td>数据采集，模拟信号输入/输出</td></tr><tr><td>Spike2 v5.02</td><td>Cambridge Electronic Design Limited</td><td></td><td>与 Power1401 配合使用的软件包</td></tr><tr><td>音频监测器</td><td>Natus</td><td>Am 8</td><td></td></tr><tr><td>方波脉冲刺激器</td><td>Natus</td><td>S48</td><td>用于施加电刺激</td></tr><tr><td>光电隔离单元</td><td>Natus</td><td>PSIU6</td><td>刺激隔离以降低噪声</td></tr><tr><td>同心双极微电极</td><td>FHC Inc.</td><td>CBFFG75</td><td>用于施加电刺激</td></tr><tr><td>双模式杠杆系统</td><td>Aurora Scientific Inc.</td><td>Series 300C</td><td>用于施加机械刺激</td></tr><tr><td>镊子</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-00</td><td>尖端精细的镊子</td></tr></tbody></table>

体外 小鼠结直肠传入末梢的功能表征

In vitro Functional Characterization of Mouse Colorectal Afferent Endings

本视频详细演示了一种 体外 使用小鼠结肠-神经制备物的单纤维电生理记录方案。该方法可无偏倚地识别并进行单个结肠传入神经的功能表征。通过细胞外记录方式获取源自一个或少数几个传入神经的传播性动作电位（APs）。即， 单纤维）感受野（RFs）通过分离神经纤维束获得。结肠直肠标本连同盆神经（PN）或腰内脏神经（LSN）一并切除，并沿纵轴切开。将组织置于记录腔室中，展平并用氧合的克雷布斯（Krebs）溶液持续灌流。采用局部电刺激定位结肠直肠传入末梢，并通过三种不同的机械刺激（钝性探压、黏膜刷拭和环形牵张）对其进行测试，以将传入纤维功能分类为五种机械敏感类型。对上述机械刺激均无反应的末梢归类为机械不敏感传入纤维（MIAs）。机械敏感性传入纤维和MIAs均可用于评估致敏性（即， 增强的反应、降低的阈值和/或通过将感受野局部暴露于化学物质而获得的机械敏感性）例如， 炎症性混合液（IS）、辣椒素、三磷酸腺苷（ATP）。本文描述了相关设备及结肠直肠–神经记录制备方法，包括带附着的盆神经（PN）或腰骶内脏神经（LSN）的结肠直肠组织获取、结肠直肠内感受野（RF）的定位、神经束单纤维记录，以及化学物质在感受野的局部应用。此外，还讨论了该制备方法中的技术难点以及标准化机械刺激应用的相关挑战。

实验装置如图1所示。该装置包含一个定制的组织浴槽，其由两部分组成：一部分为内衬硅胶的灌流腔室，用于放置结肠直肠组织；另一部分为连续的、充满矿物油的腔室，用于容纳与其相连的神经。双腔室由一整块丙烯酸塑料经数控机床加工而成；两个腔室的底部均衬有硬质硅胶，以便于将结肠直肠组织固定。从神经束中分离出的单个神经束膜外动作电位（AP）通过低噪声、电池供电的差分放大器记录，该放大器具有高共模抑制比（CMRR ~ 60 dB）。放大器增益设置为10,000倍，带通滤波范围为0.3至10 kHz。结肠直肠的电刺激通过光学隔离的恒流刺激器经由与结肠直肠黏膜接触的同心电极传递。机械刺激（结肠直肠牵张和点状探压）则由计算机控制的力致动器施加。模数转换器（A-D转换器）及配套软件通过发送电压指令信号，控制机械和电刺激的启动，同时记录并数字化来自差分放大器的胞外动作电位信号。为避免机械和电噪声干扰，组织浴槽、显微镜和差分放大器均置于安装在气浮平台上的法拉第笼内。
如图2A所示，从小鼠体内分离出带有附着神经的结肠直肠组织，沿对系膜缘剪开，展平并...

本视频演示了一种在单根神经纤维上进行电生理记录的实验方案 体外 小鼠结直肠-神经制备

本视频详细演示了一种利用小鼠结肠-神经制备标本进行体外单纤维电生理记录的实验方案。该……

本实验的总体目标是在体外对小鼠直肠远端的外源性传入神经末梢进行功能性表征。首先，连续地分离直肠结肠段及其相连的盆腔神经或腰交感神经链神经，并将组织置于体外记录装置中。第二步，将盆腔神经或腰交感神经链主干分离为细小的神经纤维束，以便对单个神经轴突进行单纤维电生理记录。随后，通过对接收区域进行无偏电刺激，识别单个直肠结肠神经末梢，并根据其对三种不同机械刺激的反应特征进行功能分类。此外，可通过使用一段黄铜管隔离感受野，并用含有某种化学物质或化学物质混合物的溶液替换原有溶液，来检测化学物质对神经末梢的反应。结果显示，小鼠结直肠受到五类不同的机械敏感性感觉神经元支配。此外，约25%的结直肠感觉神经元为机械不敏感或静息性伤害感受器。该方法被我们及其他研究人员用于研究结直肠的感觉神经支配。我们关注这一研究方法，是因为许多胃肠道疾病都与感觉神经支配的敏化或兴奋性改变有关。我们希望深入了解敏化的机制，以期有助于开发治疗策略，从而调节与这些胃肠道疾病（如肠易激综合征）相关的典型疼痛和不适。该方法的可视化演示至关重要，因为组织解剖和神经分离步骤极难掌握。支配远端直肠结肠的神经在解剖过程中极易受损。因此，细致的解剖和分离步骤对于希望重复本实验的研究人员而言至关重要。在处死小鼠后，立即进行放血，切开胸腔，穿刺右心房，并将小鼠尸体浸入约半升冰冷的Creb溶液中。接着，仔细移除所有内脏器官，仅保留结肠和盆腔器官。然后在胸膈膜稍上方约 T12 位置横断小鼠躯体，并将含有内脏的半侧躯体转移至含有冰冷冒泡克雷布斯溶液的解剖腔室中。在体视显微镜下，于膀胱和生殖器官与尿道连接处进行横断，将其移除。同时，将降主动脉从起始处剥离，直至其分叉为左右髂总动脉。现在，从周围组织中游离出盆腔神经或腰交感神经链。从髂嵴外侧开始，沿神经追踪至其进入脊柱的部位。盆腔神经进入腰椎第六节（L6）和第一节骶椎（S1），而腰交感神经则进入第13胸椎（T13）和第一腰椎（L1），如图所示。以下是左侧和右侧盆神经的解剖。接下来，切开耻骨联合，并切断右侧和左侧髋臼关节。然后去除髂骨。去除髂骨后，游离远端直肠结肠及其附着的神经。将神经从周围的肌肉和结缔组织中分离。该神经易受机械损伤。我们已将其从周围组织中游离出来，因此必须特别小心，避免牵拉或夹伤神经。然后将带有附着神经的结肠直肠组织转移至组织浴槽中。沿对系膜缘纵向切开结肠直肠，并将其黏膜面朝上放置。接着将神经延伸至记录室，记录室通过一个小孔和隔门与浴槽室相连。将神经干置于一小块玻璃镜上。该镜面具有亲水性，神经会附着其上。随后在记录室旁边，用针固定结肠直肠的肠系膜边缘。现在，用温热的含氧克雷布（Creb）溶液灌注浴槽室，并用矿物油填充记录室，以完成装置的组装。在高倍体视显微镜下，将结肠直肠的抗肠系膜端固定于连接至力致动器的钩状支架上。使用精细镊子小心剥离分离出的盆腔或腰骶神经丛神经

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医学

在小鼠大肠传入结尾的体外功能研究

本视频演示了在小鼠中进行结肠镜引导下钳取活检的实验方案。该技术有助于直观分析结肠腔，并采集组织样本用于深入研究。...

小鼠模型中结肠镜引导下的钳取活检技术：一种用于观察和提取小鼠结肠组织样本的方法

在本视频中，我们介绍了一种用于构建小鼠近端结肠袢（pcLoop）节段的外科手术方法，随后向该节段进行管腔内注射荧光标记物，以研究肠道上皮通透性。...

小鼠近端结肠袢模型的建立：一种通过肠腔内注射荧光标记物并检测血清中荧光信号以评估肠道通透性的外科手术方法

本视频展示了一种在离体大鼠结肠上记录结肠传入神经活动的方法。结肠两端被插管并灌注生理盐水以增加腔内压力。随着压力升高，神经信号增强，表明神经受到刺激。...

离体大鼠结肠中结肠传入神经的电生理记录

本视频展示了在离体小鼠空肠段上记录肠系膜传入神经电活动的过程，以研究组织压力和运动变化对传入神经活动的影响。...

离体小鼠空肠节段肠系膜传入神经活动记录

来源： Fried, D. E., Gulbransen, B. D. 肠神经系统原位 Ca2+ 成像. J. Vis. Exp.

小鼠结肠肌间神经丛中肠神经元与胶质细胞活动的钙成像

我们展示了一种用于直接研究肠神经系统中神经元和胶质细胞组分的细胞培养方案。该方法通过取自成年小鼠肌间神经丛的神经元/胶质细胞混合培养，在盖玻片上建立培养体系，从而能够利用电生理学、免疫组织化学等方法对单个神经元和胶质细胞的功能进行检测。 等等.

一个 体外 成年小鼠肌间神经丛分离肠神经元和胶质细胞的制备

近年来，新一代内窥镜已成为评估小鼠结肠炎和结直肠肿瘤的重要诊断与研究工具。本文详细介绍了一种用于小鼠内窥镜下评估炎症及结直肠肿瘤的实验方案，并提出一种新颖的评分系统，该系统采用小数标识符来记录结肠炎和结直肠肿瘤的内窥镜下严重程度。...

利用经验证的内镜评分系统对小鼠进行柔性结肠镜检查以评估结肠炎和结直肠肿瘤的严重程度

我们介绍了利用刚性内窥镜对小鼠结肠疾病治疗疗效进行纵向监测的方法。该方案可直接用于活体小鼠中单个肿瘤治疗反应的表征，也可用于监测潜在的疾病复发。...

利用活体小鼠连续内窥镜成像无创评估新型肠道疾病治疗药物的疗效

本文介绍了一种视频成像技术及高分辨率时空图谱方法，用于识别成年小鼠结肠运动神经调控的变化。利用该方法在离体组织样本中可检测胃肠道（GI）功能的细微影响，从而增进对胃肠道疾病的理解。...

利用视频成像与时空图分析小鼠胃肠道运动功能

肠系膜传入神经将来自胃肠道的信息传递至大脑，涉及正常的稳态以及病理生理状态。通过将带有附着传入神经的离体肠段固定于器官浴槽中，分离神经并记录基础状态及刺激条件下的神经放电活动，可评估胃肠道传入神经的活性。...

体外记录小鼠空肠和结肠节段肠系膜传入神经活动

异常感觉功能是功能性及炎症性肠病内脏疼痛及其他症状的基础。一种用于结肠传入神经电生理记录的方案 离体...

体外 大鼠结肠传入纤维电生理特性的表征

了解小鼠结肠直肠传入神经末梢的体外单纤维电生理记录方法。该方案通过分离神经束、电刺激识别感受野并测试机械与化学敏感性，用于研究五类机械敏感神经末梢的功能特性。

体外小鼠结直肠传入末梢的功能表征

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