体外 小鼠结直肠传入末梢的功能表征

以下实验的总体目标是在体外对小鼠结肠直肠的外源性传入神经末梢进行功能性表征。首先，连续取下结肠直肠组织及其附着的盆腔神经或腰段交感神经链，并将组织置于体外记录装置中。第二步，将盆腔神经或腰段交感神经链主干分离成细小的神经纤维束，以便对单个神经轴突进行单纤维电生理记录。随后，通过对接收野进行无偏倚的电刺激，识别单个结肠直肠神经末梢，并根据其对三种不同机械刺激的反应特征进行功能分类。

此外，可通过使用一段黄铜管隔离感受野，并用含有某种化学物质或多种化学物质混合物的溶液替换原有溶液，来检测化学物质对神经末梢的反应。结果表明，小鼠结直肠受到五类不同的机械敏感性感觉神经元（ens）的支配。此外，约25%的结直肠感觉神经元为机械不敏感或静息性伤害感受器。

我们及其它研究者采用该方法来研究直结肠的感觉神经支配。我们之所以关注这一研究方法，是因为许多胃肠道疾病均与感觉神经支配的敏化或兴奋性改变有关。我们致力于阐明敏化的机制，目的在于推动开发出能够调节疼痛及不适的治疗策略，而这些症状通常与肠易激综合征等胃肠道疾病相关。

该方法的可视化演示至关重要，因为组织解剖和神经分离步骤极难掌握。支配远端直肠结肠的神经在解剖过程中容易受损。

因此，细致的解剖以及分离步骤对于希望重复本实验的研究者而言至关重要。在处死小鼠后，立即进行放血，切开胸腔，穿刺右心房，并将小鼠尸体浸入约半升冰冷的Creb溶液中。接着，仔细移除所有内脏器官，仅保留结肠和盆腔器官。

然后在小鼠约第12胸椎（T12）水平、略高于横膈膜处横断躯体，并将包含下半身的部分转移至含有冰冻冒泡克雷布斯溶液的解剖腔室中。在体视显微镜下，通过在膀胱和生殖器官与尿道连接处进行横断，将其去除。同时，去除降主动脉直至其分叉为左右髂总动脉处。

现在，将骨盆神经或腰交感神经从周围组织中游离出来。从髂嵴外侧开始追踪神经，直至其进入脊柱的部位。骨盆神经进入腰椎第六节（L6）和骶椎第一节（S1）的脊柱，而腰交感神经则进入胸椎第十三节（T13）和腰椎第一节（L1），如图所示。

以下是左侧和右侧盆神经的解剖。接下来，切开耻骨联合，并切断右侧和左侧髋臼关节。然后去除髂骨。去除髂骨后，游离远端结肠直肠及其附着的神经。

将神经从周围的肌肉和结缔组织中分离。神经易受机械损伤。我们需将其从周围组织中完全游离，因此必须格外小心，避免牵拉或夹伤神经。

然后将带有附着神经的结肠直肠组织转移至组织浴槽中。沿对系膜缘纵向切开结肠直肠，并将其黏膜面朝上放置。接着将神经延伸至记录室，记录室通过一个小孔和闸门与浴槽室相连。

将神经干置于一小块玻璃镜上。该镜片具有亲水性，神经会附着其上。随后在记录室旁，用针固定结肠直肠的肠系膜边缘。

现在将浴槽室与温热的含氧克雷布（Creb）溶液连接，并用矿物油填充记录室，以完成装置组装。在体视显微镜高倍放大下，将结肠直肠的对系膜侧固定于连接至力致动器的一排钩上。使用精细镊子小心剥离分离出的盆腔或腰交感神经颈段的神经鞘。

将神经干分离成5至8束神经纤维，每束直径约100微米。现在将参考电极与组织浴槽中的克雷布斯溶液接触。随后依次将各神经束置于记录电极上，以诱发结肠直肠神经丛的动作电位。

使用柔软的画笔轻轻刷拭直肠结肠表面，从而识别支配结肠的神经束或神经束群。接着使用一对30号针尖，将神经束进一步分离成厚度为10微米的细丝，并将其中一根细丝置于记录电极上。

此步骤需要高度的眼手协调能力和灵巧性。随后，为电刺激传入神经末梢，将圆头同心电极垂直置于黏膜表面，并以高于阈值的强度进行刺激。这会在半径两毫米范围内产生电流扩散。

为寻找感受野末端，应沿展开的直肠长度和宽度方向，以1.5毫米为步长系统性地移动电极。当某一传入末梢被激活时，调整电极位置和刺激强度，以精确定位产生反应所需刺激强度最小的感受野。若刺激阈值超过3毫安，则舍弃该神经末梢，转而研究另一神经纤维。

现在根据刺激电极在感受野处与记录位点之间的距离，以及刺激伪影与动作电位起始之间传导延迟的时间，计算传导速度。通过电刺激定位感受野后，施加三种机械刺激。首先，使用校准的 von Frey（如尼龙单丝）探针垂直按压平展的直肠-结肠上的感受野，施加探触刺激。

使用能够产生0.4克和1克力的单丝纤维。其次，通过用产生10毫克力的细尼龙丝轻轻划过直肠结肠黏膜，以在感受野处产生微小的表面剪切应力，从而形成划动刺激。第三，使用计算机控制的力驱动装置进行周向拉伸。

使其沿结肠直肠对系膜缘的圆周方向施加一个逐渐增加的牵拉力。现在根据三项测试的结果，将肠神经系统（ENS）分类为浆膜-黏膜肌层-黏膜，或机械不敏感传入纤维（MIAA）。

首先，通过上一节所述的梯度环向、拉伸或垂直机械探查方法，记录机械刺激下的基线反应，以检测化学敏感性。取一段黄铜或不锈钢管，将其底端边缘涂上石蜡油，然后覆盖在结肠直肠的感受野上。随后，将管内的克雷布斯溶液吸出，并用170微升的待测溶液替换。

将导管留置原位3至5分钟，同时监测传入神经的反应。在取出导管后的4至6分钟内，立即用与基线反应相同的机械刺激测试传入神经的反应。15分钟或更长时间后，可认为试剂已被完全洗脱。

然后再次施加机械刺激。为了与基线蚂蚁进行比较，刺激了分离的神经以确定其感受野。通过动作电位的传导延迟所产生的动作电位反应来确认感受野。

计算得到的传导速度为每秒0.43米，处于无髓鞘C纤维的正常范围之内。在确定感受野后，使用手持式von Frey单丝纤维垂直探查，并用细尼龙丝轻轻划过感受野区域。此外，还通过计算机控制的力致动器评估AFR对探查的反应，该装置可在结直肠的同一位置施加一系列精确计时且可重复的机械力。

同样，结肠直肠的环向牵张由相同的驱动器施加。根据探查、抚摸和牵张的反应，可以区分出不同响应；由三次相隔五分钟的连续环向牵张刺激，可诱发牵张敏感传入神经元的反应。动作电位数量被均匀固定并以刺激-反应函数形式展示，显示出高度的可重复性，以及一致的反应幅度和反应阈值。

随后应用了以下化学物质。在对机械不敏感传入神经施加炎性混合液后，再施加酸性高渗溶液，可直接激活末端。末端本身未被激活，但明显获得了对机械刺激的敏感性。

一种对拉伸敏感、对缓激肽敏感的传入神经纤维在应用炎症混合液后，其感受野对机械拉伸的敏感性也增强。一旦掌握该技术，通常需要三到四个小时完成组织解剖并实现单纤维记录。一个典型的实验从开始到结束通常需要一整天时间。观看本视频后，您应当了解如何通过手术切除并获取带有神经附着的结肠直肠组织。

然后能够使用无偏倚的电学搜索策略，记录支配结肠的盆神经或腰内脏神经中的单根Ahern纤维。接着，应能够识别结肠直肠中的感受末梢，并通过将化学物质直接施加于感受末梢，检测其机械敏感性和化学敏感性。该制备方法是一种强大的实验体系，可用于研究结直肠中的病理生理机制以及基础生理学问题。