Name: 脊髓压迫损伤的校准钳型 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 41 s
Description: 了解使用校准钳型在小鼠中建立可重复的脊髓压迫损伤模型的详细手术步骤。该方法通过椎板切除术暴露脊髓，利用组织化学技术评估损伤程度，为神经科学研究提供标准化的实验方案。

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本研究工作得到了Shriners医院以及CIRM向AMC和AM提供的资助。我们还要感谢Plemel 等7首次设计并发表了经校准的镊子模型。

所有动物实验操作和动物护理方法均须经机构的机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准。&#160;
1. 手术准备
<ol>
	<li>准备所有必需的手术器械和试剂：镊子、Vannas剪刀、咬骨钳、拉钩、手术刀、剪刀、缝合线、皮肤缝钉、棉签、无菌生理盐水、手术纱布和异氟烷。术前准备并高压灭菌一套完整的手术器械包。若需对多只小鼠进行手术，应为每只动物准备并高压灭菌一套器械包，或仅高压灭菌一套手术器械包，并在每次手术之间使用器械灭菌器进行灭菌。通常情况下，若在手术间使用玻璃珠灭菌器对器械进行清洁，则一套灭菌器械包最多可用于5只小鼠（在完成5只动物手术后，器械必须重新清洁并灭菌后方可再次使用）。请咨询您所在机构的IACUC管理员以获取具体机构指南。

关键词：镊子, Vannas剪刀, 咬骨钳, 拉钩, 手术刀, 剪刀, 缝合线, 皮肤缝钉, 棉签, 无菌生理盐水, 手术纱布, 异氟烷, 高压灭菌, 玻璃珠灭菌器, IACUC</li>
	<li>用70%异丙醇擦拭消毒手术区域。铺设手术巾以确保术中维持无菌区域。</li>
	<li>手术前称量每只小鼠的体重。皮下注射剂量为每公斤体重0.05 mg的丁丙诺啡。</li>
	<li>在异氟烷麻醉机的诱导室中，以4%浓度的异氟烷对动物进行麻醉。</li>
	<li>动物麻醉后，将眼药膏涂抹于眼睛以防止脱水，将动物置于37 °C加热垫上，并确保小鼠头部正确置于麻醉罩内。（注意：使用不会引起热灼伤的加热源； 即，循环水毯、热水袋或等效设备。&#160;此时向动物给予2%异氟烷剂量。</li>
	<li>剃除小鼠背部手术切口周围约1厘米范围的毛发。</li>
	<li>用70%异丙醇擦拭巾对切口部位进行消毒，然后使用碘溶液（10%聚维酮碘，1%有效碘）处理。重复此步骤3次。</li>
</ol>
2. 背侧椎板切除术
<ol>
	<li>在进行切口前，需通过脚趾或尾部夹捏法检查动物的反射，以确认其已充分麻醉。</li>
	<li>使用手术刀片沿背部脊柱做切口，然后再次检查反射。弓起背部以更清晰地观察解剖标志，例如椎骨之间的边界。</li>
	<li>切开皮肤，插入牵开器以将皮肤和筋膜从脊髓上拉开。清除脊髓两侧的组织，暴露覆盖脊柱的肌肉。 
	注意：手术者应熟悉解剖标志。例如，肩胛骨下角对应T7；小鼠脊柱自然弯曲的顶部为T12，可作为参考点。</li>
	<li>在适当照明下，确定椎骨之间的间隙。找到T10的后端，并垂直于椎间盘间隙切开肌肉和筋膜。切开范围应刚好足以暴露T10的棘突和后部椎板。</li>
	<li>使用精细尖头Dumont #5镊子，清除部分椎板和棘突上的组织，以暴露一小片脊髓。必要时，使用组织镊子稳定脊柱。</li>
	<li>进行椎板切除术时，将小型Vanna剪刀的一侧沿椎骨的背外侧插入，置于椎板下方。
	<ol>
		<li>进行小而谨慎的剪切，以切断椎板的外侧部分。确保不对脊髓施加任何压力。</li>
		<li>在另一侧重复此操作。</li>
		<li>必要时，使用棉签或外科海绵施加轻柔压力以止血，注意避免对脊髓施压。 
		注意：准备用无菌生理盐水浸泡的明胶海绵，以备需要控制出血时使用。</li>
		<li>完成切口后，移除椎骨的背侧部分，并轻轻清除任何残留的组织附着。必要时采用适当方法控制出血。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 脊髓受压
<ol>
	<li>使用咬骨钳或椎板切除钳，确保脊髓侧方的椎体骨质已完全清除，以便用于压迫损伤的校准钳能够置于脊髓两侧。钳臂必须能够放置于脊髓相邻侧的硬膜外腔，且钳尖必须能够触及椎管底部。
	<ol>
		<li>确保脊髓的视野清晰良好。</li>
		</ol>
	</li>
	<li>将校准过的Dumont #5镊子置于暴露的脊髓节段大致中点位置。需注意，镊子的臂部必须置于脊髓相邻侧的硬膜外腔内，且镊尖必须接触椎管底部，以产生可重复的损伤。</li>
	<li>小心地压迫脊髓，直至限位装置接触；保持该状态15秒。</li>
	<li>缓慢释放压迫力，并将校准镊子从脊髓处移开。在关闭切口前，应使用无菌生理盐水恢复组织稳态。</li>
</ol>
4. 伤口闭合
<ol>
	<li>仔细缝合覆盖在脊髓上的肌肉层，注意不要破坏或压迫脊髓。</li>
	<li>使用缝线或皮肤缝合钉将皮肤伤口闭合。</li>
	<li>若使用气体麻醉剂，应开始逐步减量或关闭麻醉。</li>
	<li>每10克体重给予0.1 ml乳酸林格氏液，以弥补手术期间及术后动物因嗜睡和伤后恢复阶段可能发生的脱水。注射前应将溶液预热至体温。</li>
	<li>将小鼠置于无垫料的笼子中。该笼子应&#160;放置&#160;在加热垫上（如1.1.5所述），方式应使笼子一半区域位于加热垫上，另一半置于室温操作台面上，以便小鼠在恢复活动能力后可自行选择适宜的微环境。注意确保“恢复笼”放置在安静的环境中。需密切监测动物，直至其完全恢复意识，之后可将其转移至带有垫料的常规饲养笼中。</li>
</ol>
5. 术后护理
<ol>
	<li>术后，于术后前3天内每12小时皮下注射一次剂量为0.05 mg/kg体重的丁丙诺啡，之后根据需要给予以控制疼痛症状。</li>
	<li>术后前3至5天内，每天皮下注射乳酸林格液（每10 g体重注射0.1 ml）。若动物在此初始时间段之外出现脱水迹象，则应给予该剂量。</li>
	<li>每日两次通过Crede手法手动排空动物膀胱。轻柔触诊动物腹部以定位膀胱，然后施加轻柔的向下压力直至膀胱排空。
	<ol>
		<li>若膀胱无法排空，或尿液呈血性或浑浊，应通过腹腔注射给予动物剂量为50 mg/kg体重的拜耳菌素（Baytril），连续给药10天。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>密切观察动物是否出现自噬、脱水及过度体重减轻（超过体重的20%）等迹象。若动物出现上述任何症状，请立即咨询兽医以确定治疗方案，或根据IACUC指南以人道方式实施安乐死。
	<ol>
		<li>鉴于术后活动能力可能受限，应采取必要措施确保动物能够获取食物和水。在此情况下，可为动物提供预包装湿粮以及水凝胶。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. 评估压缩性损伤导致的组织损伤
<ol>
	<li>按照步骤 1.4和1.5所述对动物进行麻醉。通过夹趾法和监测角膜眨眼反射来检查麻醉深度。当动物对刺激无反应时，进行步骤 6.2。</li>
	<li>进行心脏灌注10。
	<ol>
		<li>暴露胸腔，并将针头插入左心室。先用 20–30 ml 冰冷的磷酸盐缓冲盐水（PBS）冲洗体内液体，随后用 15–25 ml 冰冷的 4% 多聚甲醛（PFA）灌注。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>取出脊髓。
	<ol>
		<li>切开脊髓背侧的皮肤，并清除脊柱全长周围的多余组织。</li>
		<li>切除脊柱并去除任何残留组织。可通过计数肋骨确认椎板切除和损伤的实际节段。</li>
		<li>使用Vannas剪刀和镊子，从尾侧向头侧方向逐段移开脊柱的小部分结构。持续剪切直至脊髓充分暴露，便于安全取出。可借助体视显微镜观察切割位置和过程。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将脊髓组织置于 4% PFA 中，在 4 °C 下后固定 24 小时。</li>
	<li>将组织在 30% 蔗糖溶液中 4 °C 孵育 24 小时，进行冷冻保护。</li>
	<li>将组织包埋于OCT包埋剂中。简而言之，从 30% 蔗糖溶液中取出组织，去除多余液体。将组织放入盛有OCT的冷冻模具中，在 4 °C 孵育 1 小时。
	<ol>
		<li>将模具从 4 °C 取出，确认组织的方向定位，将模具放入盛有2-甲基丁烷的浅皿中（该试剂需预先在干冰上预冷1小时），使OCT完全固化。若立即使用，则保持在干冰上；否则储存于 -80 °C。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用冷冻切片机将组织切成 20 µm 厚的矢状面切片。直接将切片贴附于载玻片上，储存于 -20 °C 直至使用。</li>
	<li>进行苏木精-伊红（H&amp;#38;E）染色。
	<ol>
		<li>简要步骤：将切片复水（每次 5 分钟，共 2 次），用苏木精染色（2.5 分钟），然后用水洗涤（每次 1 分钟，共 2 次）。</li>
		<li>依次在 50% 和 70% 乙醇中孵育（各 3 分钟），用伊红染色（45 秒），再通过 90%（5 秒）、95%（5 秒）、100% 乙醇（2 分钟）和异丙醇（2 分钟）进行脱水。</li>
		<li>用二甲苯透明（每次 5 分钟，共 3 次）。 
		注意：H&amp;#38;E 染色效果会因组织厚度和具体条件而异，因此在处理实验样本前需进行标准化优化。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在组织上覆盖一条薄层Permount封片剂（约 100 µm），加盖盖玻片。轻压盖玻片各边，确保封片剂均匀分布。让载玻片在室温下过夜干燥。</li>
	<li>使用数字显微镜观察组织切片，并利用配套软件采集图像。</li>
</ol>

<ol><li>McDonough, A., Martinez-Cerdeno, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endogenous+proliferation+after+SCI+in+animal+models%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Int%22%5BJournal%5D)">Endogenous proliferation after SCI in animal models.</a> Stem Cells Int. 2012, 387513(2012).</li>
<li>Onifer, S. M., Rabchevsky, A. G., Scheff, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rat+models+of+traumatic+SCI+to+assess+motor+recovery%5BTitle%5D)+AND+%22ILAR+J%22%5BJournal%5D)">Rat models of traumatic SCI to assess motor recovery.</a> ILAR J. 48 (4), 385-395 (2007).</li>
<li>Bunge, R. P., Puckett, W. R., Becerra, J. L., Marcillo, A., Quencer, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Observations+on+the+pathology+of+human+SCI.+A+review+and+classification+of+22+new+cases+with+details+from+a+case+of+chronic+cord+compression+with+extensive+focal+demyelination%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Neurol%22%5BJournal%5D)">Observations on the pathology of human SCI. A review and classification of 22 new cases with details from a case of chronic cord compression with extensive focal demyelination.</a> Adv Neurol. 59, 75-89 (1993).</li>
<li>Beattie, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endogenous+repair+after+spinal+cord+contusion+injuries+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Endogenous repair after spinal cord contusion injuries in the rat.</a> Exp Neurol. 148 (2), 453-463 (1997).</li>
<li>Basso, D. M., Beattie, M. S., Bresnahan, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Graded+histological+and+locomotor+outcomes+after+spinal+cord+contusion+using+the+NYU+weight-drop+device+versus+transection%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">Graded histological and locomotor outcomes after spinal cord contusion using the NYU weight-drop device versus transection.</a> Experimental Neurology. 139 (2), 244-256 (1996).</li>
<li>Krishna, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+contusion+model+of+severe+SCI+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A contusion model of severe SCI in rats.</a> J Vis Exp. 78, (2013).</li>
<li>Plemel, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+graded+forceps+crush+SCI+model+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">A graded forceps crush SCI model in mice.</a> J Neurotrauma. 25 (4), 350-370 (2008).</li>
<li>Wu, D., Shibuya, S., Miyamoto, O., Itano, T., Yamamoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increase+of+NG2-positive+cells+associated+with+radial+glia+following+traumatic+SCI+in+adult+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurocytol%22%5BJournal%5D)">Increase of NG2-positive cells associated with radial glia following traumatic SCI in adult rats.</a> J Neurocytol. 34 (6), 459-469 (2005).</li>
<li>Namiki, J., Tator, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+proliferation+and+nestin+expression+in+the+ependyma+of+the+adult+rat+spinal+cord+after+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuropathology+and+Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">Cell proliferation and nestin expression in the ependyma of the adult rat spinal cord after injury.</a> Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 58 (5), 489-498 (1999).</li>
<li>Teletin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histopathology+in+Mouse+Metabolic+Investigations%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Histopathology in Mouse Metabolic Investigations.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 29, (2007).</li>
<li>McDonough, A., Hoang, A. N., Monterrubio, A. M., Greenhalgh, S., Martinez-Cerdeno, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compression+injury+in+the+mouse+spinal+cord+elicits+a+specific+proliferative+response+and+distinct+cell+fate+acquisition+along+rostro-caudal+and+dorso-ventral+axes%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Compression injury in the mouse spinal cord elicits a specific proliferative response and distinct cell fate acquisition along rostro-caudal and dorso-ventral axes.</a> Neuroscience. 254, 1-17 (2013).</li>
<li>Basso, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basso+Mouse+Scale+for+locomotion+detects+differences+in+recovery+after+SCI+in+five+common+mouse+strains%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Basso Mouse Scale for locomotion detects differences in recovery after SCI in five common mouse strains.</a> J Neurotrauma. 23 (5), 635-659 (2006).</li>
<li>Chaplan, S. R., Bach, F. W., Pogrel, J. W., Chung, J. M., Yaksh, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+assessment+of+tactile+allodynia+in+the+rat+paw%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Quantitative assessment of tactile allodynia in the rat paw.</a> J Neurosci Methods. 53 (1), 55-63 (1994).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

在设计用于评估脊髓损伤（SCI）治疗方案对人类病例疗效的实验时，选择合适的SCI动物模型至关重要。此类实验需要高度可重复的动物模型，以减少可能造成数据不明确的变异性。同时，模型应具有临床相关性，以便准确评估其所模拟的人类疾病状态。为此，相较于横断损伤，选择压迫性或挫伤性损伤更具临床相关性3。然而，用于造成挫伤的撞击器和落重装置需要使用昂贵且复杂的设备。相比之下，校准镊子法（calibrated forceps model）利用经改造的镊子，可由常见的实验室材料简便组装而成，手术过程仅需在标准背侧椎板切除术暴露脊髓后增加一个额外步骤即可完成。但该方法的一个缺点是，施加的压迫力始终为侧向，而非临床上人类SCI最常见的背向压迫9，且该方法产生的压迫性损伤在头尾方向上影响的组织范围较挫伤模型更广1,2。已有研究证实，该技术的创建者及我们团队均能利用此模型产生可重复的SCI7,11，且该模型特别适用于小鼠体型。此外，该损伤模型允许在术后通过多种行为学测试（如Basso小鼠运动功能评分和von Frey毛发试验）对动物进行评估和治疗效果验证，以确认动物群体具有相似的损伤程度和神经功能缺损7,11-13。这些相同的技术也可用于评估在研究过程中给予动物的治疗措施的有效性，从而满足用于评估SCI疗法的动物模型的一般标准2,7。
制备校准镊子用于损伤模型的方法十分简便，可通过多种不同方式实现。我们采用了Plemel7发表的间隔物法11，同时也使用小型螺钉对镊子进行改装，这种方法不仅更易于构建压迫装置，还可灵活调节最终的压迫宽度，有利于开展比较研究。只要间隔物能够稳定地确保镊子每次闭合至相同距离，并能耐受高压灭菌和消毒，那么制备镊子的方法选择几乎是无限的。本视频中描述的手术方法在不同操作者之间具有高度可重复性，但在进行椎板切除以及手术后缝合动物时，必须格外小心，以避免脊髓受到任何额外的压迫力，防止损伤程度加重或干扰后续实验结果。
通过适当的培训和练习，经过校准的镊子压迫损伤模型非常适合在小鼠中实施脊髓损伤（SCI），以模拟临床上观察到的人类病例2,3,7。由于制作镊子简便，可轻松制备出具有不同程度损伤严重性的小鼠模型。这对于在转基因小鼠中观察不同严重程度SCI的遗传效应，以及评估干细胞移植在小鼠中的疗效具有重要意义。文献中大多数研究均以大鼠为对象，因其体型较大，通常更便于手术操作。然而，Plemel et al.7 发表并由我们在本视频中描述的方法，应能实现对小鼠进行简便且可重复的脊髓损伤操作。

脊髓损伤（SCI）的动物模型是评估旨在减轻脊髓创伤所致损害的治疗方案有效性的宝贵工具。出于实验需求，这些模型必须能够产生可重复的运动和感觉功能缺陷，可调节以造成不同程度的损伤，并能证明损伤严重程度与所观察到的神经功能缺损程度相关。根据损伤特征的不同，脊髓损伤主要有三种类型：横断、挫伤和压迫1。简而言之，横断损伤是指脊髓的切割性损伤；挫伤损伤由作用于脊髓背侧的短暂局灶性外力引起；而压迫损伤则是当有害外力作用于脊髓时发生，有时也称为压榨性损伤2。
完全横断性损伤在人类临床中较为罕见3，而挫伤和压迫性损伤更为常见。压迫性损伤所导致的结果类似于由肿瘤压迫或其他有害性压迫力引起的人类脊髓损伤（SCI），且可使用一套简单的工具完成操作。挫伤与压迫性损伤的相似之处在于二者均施加压迫力，且具有类似的病理特征，例如细胞结构紊乱，并引发相似的内源性损伤反应1,4。挫伤模型通常使用特殊装置将外力作用于脊髓背侧，其方式类似于人类因脊柱撞击所致的脊髓损伤2,5,6。相比之下，压迫性损伤可通过多种方法从背侧或侧向施加压力实现。压迫性损伤的方法包括使用校准的持针器7、动脉瘤夹2，或直接在脊髓上放置重物8。动脉瘤夹的优势在于能够提供不同大小的压力9。而直接在脊髓背侧表面加载重物的方法8要求重物放置持续10分钟，这显著延长了手术时间，并因重物位置的差异以及动物呼吸引起的移动而导致结果不一致。由于小鼠体型较小，将其置于专为大鼠设计的特殊装置（如用于挫伤的撞击器）中可能存在困难，或导致损伤不一致7。然而，与大鼠或兔子等体型较大的实验动物相比，小鼠具有多种转基因品系可供选择，这在脊髓损伤研究中具有重要价值。
使用经校准的镊子压迫脊髓的Plemel方法可产生可重复的脊髓损伤（SCI），其损伤严重程度与神经功能缺损之间具有高度相关性7。该手术诱导的SCI模型采用一对5号Dumont镊子，经改造后通过金属环氧树脂或其他阻隔物固定于特定间距，以防止镊子完全闭合。这种工程化间距设计可确保在多次手术及不同操作者使用时，镊子始终闭合至相同宽度。Plemel方法的优点在于，制备校准镊子所需的材料易于在实验室中采购并组装，无需特殊设备。这些镊子可耐受多次高压灭菌和消毒处理，且由于无需额外的大型装置，使手术操作更为简便高效。
在本视频中，我们演示了使用一对校准的镊子对小鼠脊髓进行手术，以制造压迫性损伤。同时，我们还探讨了与脊髓损伤实验动物护理相关的特殊注意事项，以改善术后生活质量并降低死亡率。

<table><tbody><tr><td>异氟烷麻醉机</td><td>Smiths Medical PM, Inc</td><td>VCT302</td><td></td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>Phoenix Pharmaceutical</td><td>NDC: 66794-013-25</td><td></td></tr><tr><td>解剖显微镜</td><td>Seiler Precision Microscopes</td><td>SSI 202/402</td><td></td></tr><tr><td>Germinator-500（器械灭菌器）</td><td>Thomas Scientific</td><td>3885A20</td><td></td></tr><tr><td>Puralube（眼膏）</td><td>Dechra</td><td>NDC 17033-211-38</td><td></td></tr><tr><td>手术刀柄（#3）</td><td>Fine Science Tools</td><td>10003-12</td><td></td></tr><tr><td>手术刀片（#11）</td><td>Fisher Scientific</td><td>&amp;nbsp;08-914B</td><td></td></tr><tr><td>牵开器（Colibri）</td><td>Fine Science Tools</td><td>17000-03</td><td></td></tr><tr><td>Friedman Pearson 骨凿</td><td>Fine Science Tools</td><td>16021-14</td><td></td></tr><tr><td>Vanna（Castroviejo）剪刀</td><td>Roboz</td><td>RS-5658</td><td></td></tr><tr><td>组织镊</td><td>Fine Science Tools</td><td>11029-14</td><td></td></tr><tr><td>椎板切除钳（Dumont #2）</td><td>Fine Science Tools</td><td>11223-20</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 镊子</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-20</td><td></td></tr><tr><td>缝合器</td><td>Fine Science Tools</td><td>12031-07</td><td></td></tr><tr><td>缝合钉（伤口夹）</td><td>Reflex7</td><td>203-1000</td><td></td></tr><tr><td>缝合线</td><td>Henry Schein</td><td>101-2636</td><td></td></tr><tr><td>针头（30 G × &amp;frac12;）</td><td>BD Biomedical</td><td>305106</td><td></td></tr><tr><td>注射器（1 ml）</td><td>BD Biomedical</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>Baytril（恩诺沙星）</td><td>Bayer</td><td>NADA 140-913</td><td></td></tr><tr><td>Buprenex（丁丙诺啡）</td><td>Cardinal Health</td><td>NDC 12496-0757-1</td><td></td></tr></tbody></table>

校准镊子模型用于脊髓压迫性损伤

Calibrated Forceps Model of Spinal Cord Compression Injury

小鼠脊髓的压迫性损伤是研究脊髓损伤（SCI）及脊髓再生治疗的重要动物模型。经过校准的镊子压迫损伤模型是一种简便、低成本且高度可重复的SCI动物模型。我们采用一对改良镊子，根据Plemel 等（2008年）发表的方法，对脊髓进行侧向压迫，压缩距离为0.35 mm。在本视频中，我们将演示通过背侧椎板切除术暴露脊髓，随后使用改良镊子对脊髓进行压迫。视频中还将讨论与截瘫实验动物护理相关的若干问题。该损伤模型可导致小鼠感觉功能受损以及后肢运动功能障碍。此外，通过免疫组织化学方法证实，该损伤方法可产生一致的SCI病理学异常改变。观看本视频后，观众应能够掌握在小鼠中制备不同严重程度SCI所需的器材与方法，用于SCI相关研究或旨在减轻损伤后功能障碍的治疗研究。

我们对12只小鼠（25 - 30克）进行了如上所述的椎板切除术，随后进行脊髓压迫，压迫深度分别为0.25 mm（n = 4）、0.35 mm（n = 4）和0.55 mm（n = 4）。在损伤后第3天（n = 6）和第7天（n = 6），通过心脏灌注处死动物。取出脊髓组织，按上述方法进行组织制备和处理。使用Leica EZ4数码显微镜及配套软件拍摄整个脊髓的图像；使用Olympus数码显微镜及配套软件以2倍放大倍数拍摄脊髓切片图像。
我们发现，脊髓受压损伤的损伤中心位于受压部位（图1）。损伤效应向头端和尾端方向延伸数毫米。随着间隔片间距的减小，损伤程度加重（0.25 mm > 0.35 mm > 0.55 mm，图2）。受压后3天，在损伤中心及其周围区域可见出血，而损伤后7天时该现象消失。0.25 mm和0.35 mm的受压模型形成了空洞，但0.55 mm模型未形成。受压7天后，损伤中心处的背侧和腹侧白质体积明显缩小，灰质结构严重扭曲，且空洞化持续存在。这些细胞构筑学改变表现为动物行为上的运动和感觉功能障碍，可通过适当的检测方法进行评估，例如用于评估运动功能的Basso小鼠运动评分量表（Basso Mouse Scale for Locomotor Function），以及用于评估感觉功能的von Frey毛发试验和氯乙烷试验，我们在先前的研究中已对此进行了验证8。
<img alt="显示组织结构分析的显微图像；带有方向标记的比较研究。" src="/files/ftp_upload/52318/52318fig1highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 
图1. 脊髓完整状态及损伤后的代表性图像。（A） 完整的脊髓。（B） 0.35 mm 压缩后的脊髓。箭头指示损伤边界，星号标记损伤中心。D = 背侧，L = 外侧。比例尺：0.50 mm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52318/52318fig1highres.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="脊髓横切面的组织学分析；不同时间点的对照组与损伤组厚度对比。" src="/files/ftp_upload/52318/52318fig2highres.jpg" width="650" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 
图 2. 小鼠脊髓在不同压缩宽度下压缩损伤前后代表性图像。(A) 对照组脊髓的矢状切面。(B) 压缩损伤后7天（dpi）0.35 mm脊髓损伤（SCI）病灶中心的冠状切面。(C,E,G) 压缩损伤后3天（dpi）脊髓的矢状切面，压缩宽度分别为0.25、0.35或0.55 mm。(D,F,H) 压缩损伤后7天（dpi）经H&amp;E染色的脊髓矢状切面，压缩宽度分别为0.25、0.35或0.55 mm。星号标示损伤病灶中心。所有切片均经H&amp;E染色。D = 背侧，L = 外侧。比例尺：1.25 mm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52318/52318fig2highres.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>

脊髓损伤模型应具有高度可重复性。我们证明，校准的镊子压迫法是一种易于使用的手术方法，可用于在小鼠脊髓上诱导出可重复的损伤。

小鼠脊髓压迫性损伤是研究脊髓损伤（SCI）和脊髓再生治疗的重要动物模型。

以下实验的总体目标是演示使用校准过的镊子在小鼠中制造可重复的脊髓压迫损伤所需的关键步骤。该过程首先轻柔地去除覆盖在脊柱上的皮肤和肌肉层，并准确定位目标椎体。接着，对目标椎体进行椎板切除术以暴露脊髓，随后使用校准过的镊子对脊髓施加损伤。结果展示了利用组织化学技术检测脊髓受压后脊髓组织内损伤程度的情况。通常，初次接触该方法的研究人员会遇到较大困难。该操作是在小型动物上进行的一项极为精细的实验，容错空间极小。这是一种敏感组织，操作时可能意外造成比预期更严重的损伤，因此建议先进行练习。为手术做准备，需准备以下手术器械和试剂：镊子、弯剪、URS手术刀、牵开缝线、皮肤缝合钉、棉签、无菌生理盐水、无菌手术海绵以及异氟烷（isoflurane），后者需与麻醉机配合使用。将单次手术所需的器械进行高压灭菌，并在每次手术之间使用器械消毒器对工具进行灭菌。使用70%异丙醇对手术区域进行消毒，并铺设手术巾，以确保手术过程中维持无菌环境。在手术前称量每只小鼠的体重后，待动物麻醉后，根据文本方案，按每千克体重0.05毫克的剂量皮下注射布托啡诺，并涂抹眼膏以防止眼睛脱水，同时剃除小鼠背部预定切口部位周围约一厘米区域的毛发。使用碘溶液对切口部位进行消毒，随后使用70%异丙醇，重复三次，然后开始手术。首先，进行脚趾或尾部夹捏以评估反射。若无反射存在，使用手术刀沿背部脊柱方向切开皮肤。插入牵开器以将皮肤从脊髓处拉开。再次检查反射情况。然后清除脊髓两侧的组织，暴露覆盖脊柱的肌肉，并弓起背部，以帮助清晰观察解剖标志，例如椎骨之间的边界。应能观察到以下解剖标志：肩胛骨下角，对应第七胸椎（T7），以及在适当照明条件下小鼠脊髓自然弯曲的顶部，位于第十二胸椎（T12）。确定椎骨之间的间隙。然后找到 T10 的后端，使用精细尖头的 Dumont 五号镊子，垂直于椎间盘间隙剪开足够的肌肉和筋膜，以暴露 T10 的棘突和后部椎板。去除部分椎板和棘突上的组织，以暴露一小片脊髓。必要时，使用组织镊子稳定脊柱。接下来，进行椎板切除术：将一对小型VNA剪刀的一侧插入椎骨椎板下方的背外侧，然后小心地进行小幅度剪切，以切断椎骨椎板的左侧部分。另一侧重复相同操作。确保使用棉签或手术海绵时未对脊髓施加任何压力。必要时可施加轻柔压力以止血，注意避免对脊髓造成压迫。完成切口后，抬起椎骨的背侧部分，并轻轻清除任何组织附着物。必要时采用适当方法控制出血。使用正确的钳嘴或椎板切除钳，确保脊髓两侧无椎骨残留，以便用于压迫损伤的校准钳能够准确放置于脊髓两侧。现在将校准后的杜蒙特5号镊子置于脊髓暴露节段的中段位置，镊子的臂部位于硬膜外腔内，镊尖接触椎管底部。小心地压迫脊髓，直至间隔器接触并固定，保持15秒。然后轻柔地释放压力，并将校准的镊子从脊髓上移开。使用无菌生理盐水以恢复稳态，并仔细缝合覆盖在脊髓上的肌肉层，注意避免对脊髓造成扰动或施加压力。使用缝线或钉合器关闭伤口处的皮肤。每10克体重给予1毫升乳酸林格氏液，以帮助缓解脱水。在将小鼠放入垫料-free的笼子前，将其置于设定为约37摄氏度的加热垫上。在安静的环境中密切监测动物，直至其恢复意识。术后前三天将其转移至铺有垫料的常规饲养笼中，每12小时皮下注射一次剂量为0.05毫克/千克体重的丁丙诺啡，之后根据需要每日两次用于控制疼痛症状。采用规定手法通过手动排空动物膀胱，即轻柔触诊动物腹部以定位膀胱，并施加轻柔的向下压力，直至膀胱排空。 由于动物在术后活动能力降低，需采取必要措施，通过提供湿粮和水凝胶确保动物能够接触到食物和水。有关在25毫米处评估椎板切除和脊髓受压所致组织损伤的详细步骤，请参见文本方案。在12只小鼠中分别于35毫米或55毫米处实施操作，并在损伤后3天或7天通过心脏灌注处死动物，如图所示。脊髓受压会导致损伤，其损伤中心位于受压部位，且损伤效应向头侧和尾侧方向延伸数毫米。该图显示，随着间隔物之间距离的减小，损伤程度加重。例如，在受压后3天，25毫米和35毫米的压迫点产生了空腔，而在55毫米模型中则未观察到；在损伤中心及其周围区域可见出血，但在损伤7天后该出血现象消失；7天后，损伤中心处的背侧和腹侧白质体积明显缩小。灰质结构高度紊乱，空洞化现象持续存在，如先前所示，细胞构筑学改变导致动物行为出现运动和感觉功能障碍，通过贝索小鼠运动功能评分、von Frey 毛发试验和氯乙烷试验对感觉功能进行评估。在此操作之后，可进一步开展其他方法，例如将细胞直接移植或注射其他治疗性试剂至脊髓，以回答特定疗法是否能够改善脊髓损伤后预后等进一步的科学问题。

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脊髓压迫损伤的校准钳型

使用无限视野冲击器建立单侧颈段脊髓损伤的挫伤模型

来源：Elzat, E. Y. Y.，等，基于微创技术建立小鼠挫伤性脊髓损伤模型。J. Vis.

使用脊髓损伤同轴平台在小鼠模型中诱导脊髓挫伤

来源：Zheng, W. 等.，慢性脊髓受压中的弥散张量磁共振成像。J. Vis. Exp.

利用扩散张量成像评估脊髓受压

介绍了一种严重的脊髓损伤挫伤模型。详细描述了为获得稳定模型所需的术前、术中和术后各个步骤。...

大鼠重度脊髓损伤挫伤模型

脊柱稳定对于减少变异性和产生一致的实验性脊髓损伤至关重要。...

一种用于制造挫伤性脊髓损伤的新型椎体稳定方法

本文介绍了一种在新生小鼠中建立可重复性脊髓压迫损伤（SCI）的方法。该模型为研究自发性功能恢复背后的适应性可塑性机制提供了一个有利的平台。...

一种新生小鼠脊髓压迫性损伤模型

我们介绍一种基于组织位移的挫伤性脊髓损伤模型，可在成年小鼠中产生一致的挫伤性脊髓损伤。...

一种基于组织位移的挫伤性小鼠脊髓损伤模型

微创技术与简易实验装置通过减少对实验动物的手术损伤并维持解剖形态，提高了脊髓损伤模型的可重复性。该方法具有重要价值，因为可靠的结果和可重复的操作流程有助于深入研究疾病修复的机制。...

基于微创技术建立小鼠挫伤性脊髓损伤模型

本方案通过在小鼠中模拟中央束综合征（CCS），提高了实验的可重复性，并最大限度地减少了对实验动物的操作损伤，避免过度破坏解剖结构。本研究的策略具有优势，因其能够产生一致的结果，从而有利于对损伤机制的研究。...

C57BL/6J 小鼠中央束综合征模型的建立

本文展示了一种用于小鼠的新型自动化脊髓损伤挫伤装置，该装置能够精确地制备不同程度的脊髓损伤挫伤模型。...

用于小鼠脊髓挫伤模型的自动化撞击器

了解使用校准钳型在小鼠中建立可重复的脊髓压迫损伤模型的详细手术步骤。该方法通过椎板切除术暴露脊髓，利用组织化学技术评估损伤程度，为神经科学研究提供标准化的实验方案。

校准镊子模型用于脊髓压迫性损伤

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