实时电生理学：利用闭环协议探究神经元动态及其更广泛应用

以下实验的总体目标是使用免费提供的软件工具箱 LCG，在皮层神经元中进行体外动态钳制。首先制备大鼠体感皮层的脑片，用于对顶叶细胞进行膜片钳记录。第二步，对记录的细胞施加一系列自动化的电生理实验方案，以对细胞进行标准化表征，从而为后续分析及不同细胞类型间的比较提供依据。

接下来，模拟兴奋性和抑制性突触事件的输入。为了重现新皮层神经元在体所经历的高电导状态，结果展示了背景突触输入如何调节皮层神经元的增益。该技术相较于现有方法的主要优势在于，可以通过将一种实验方案的结果作为另一方案的输入，将实验记录嵌入更为复杂的操作流程中。

该方法有助于标准化电生理学实验方案，加快数据分析，并为实验室间的数据共享奠定基础。尽管该方法最初是为体外全细胞膜片钳记录而开发的，但它也可方便地用于其他实验制备和实验方案，例如体内膜片钳记录、细胞外记录，或使用微电极阵列进行的加速度记录。取出大鼠脑组织后，弃去小脑，并用手术刀沿中线将两个半球分开，去除其中一个半球上的多余液体，并用一滴瞬干胶将其粘附在倾斜的平台上。

然后迅速在脑组织上滴加几滴人工脑脊液（CSF），并将脑组织转移至振动切片机中。用刀片切除最前端2.5至3毫米的脑组织。随后，调整切片速度和频率，以尽量减少对切片表面的损伤。

接下来，将厚度设置为 300 微米并开始切片。当刀片切过皮层后，使用剃刀刀片或弯针在海马上方以及目标皮层区域的边缘处进行切割。随后，将切片转移至 36 摄氏度的多孔孵育 chamber 中。

在此步骤中，将切片置于记录室中，并使用40倍放大镜。在脑表面以下5层且深度为600至1000微米处寻找健康的细胞。这些细胞通常对比度较低，外观平滑，且无肿胀现象。

找到健康的细胞后，用细胞内液填充微量移液管的三分之一，然后将其放入预设的 Linux 操作系统中的显微操作仪支架内，启动指令。

Shell 会添加其提示符。输入此命令以确保数据采集板未驱动放大器。然后通过按压连接至移液管 holder 的注射器活塞，施加 30 至 50 毫巴的正压。

接下来，将移液管置于切片上方约100微米处，并使用显微操作仪的接近模式将移液管移向目标细胞。随后，在电生理放大器上调整移液管偏移量，并在电压钳模式下输出10毫伏的测试脉冲。使用命令LCG SEAL测试来监测移液管电阻，然后通过回抽注射器活塞将压力降低至10至30毫巴。

轻柔地接近细胞，并通过观察摄像机监视器上的图像来检查是否形成凹陷。同时，通过监视显示器上显示的电流波形，观察测试脉冲引起的电阻增加。当移液管电阻增加且细胞表面出现凹陷时，立即释放正压，并对移液管施加轻微负压，以促进封接的形成。

在此期间，逐渐将钳制电位降低至负70毫伏。施加轻柔的负压以破裂细胞膜，形成全细胞记录构型。随后根据细胞的电学特性对其进行表征。

使用LCGE代码。这是一次膜片钳记录的五层顶盖神经元的平均动作电位，其阈值为-50.5毫伏。该图显示了对超极化电流的被动反应的测量结果。

确定细胞的基本放电特性可揭示该细胞为规则放电神经元，并且在施加模拟兴奋性突触后电位时几乎无适应性。通过在 shell 的命令提示符下输入此命令，将目录更改为下一个实验将要保存的位置。此操作无需依赖放大器的传统硬件控制。为实施桥平衡和电容补偿，请执行此命令以估算完成有源电极补偿所需的电极核函数。

完整的核函数由两个部分组成：一个快速的电极核函数和一个较慢的膜核函数，后者导致完整核函数中观察到的指数衰减尾部。前者构成了微电极的非参数化模型。在施加电流注入以分离膜核函数和电极核函数时，LCG核函数命令将提示用户输入构成快速电极核函数的点数。接下来，请选择一个合适的数值，使得电极核函数覆盖指数衰减尾部的末端。

然后使用此命令执行动态钳实验。最后，可视化结果。以下是使用动态钳重建的类似体内活动。

红色和蓝色轨迹分别表示兴奋性与抑制性突触的模拟结果。此处显示的是从一个L5椎旁神经元记录到的电压轨迹，该神经元受到兴奋性或抑制性突触后电流的持续作用。细胞中相应的兴奋性电流、抑制性电流以及总电流如图表所示。

20次试验中产生的脉冲光栅图显示，该神经元在相同输入下的反应可以极为可靠且精确。观看本视频后，您应能充分理解如何使用免费提供的软件工具箱LCG进行动态钳实验。该方法可进一步扩展至其他闭环实验方案，用于研究从神经元兴奋性到复杂神经网络相互作用等多种课题。