利用多细胞模式生物 C. elegans 研究类朊病毒蛋白的扩散与毒性

以下实验的总体目标是利用后生动物模式生物 C. elegans 研究 Prion样蛋白的扩散及其复杂的毒性。通过使用延时荧光显微镜监测含有Prion样蛋白的囊泡在细胞内和细胞间的运输来实现这一目标。接下来使用组织特异性折叠传感器和普遍表达的应激报告系统。

报告基因用于评估细胞自主性和非细胞自主性对细胞适应性的影响。随后进行全基因组RNAi筛选，以鉴定PreOn诱导毒性的新调控因子。该筛选在液体培养条件下进行，以颤动行为作为毒性读出指标。

最后，使用 Worm Tracker（ImageJ 的一个插件）来定量分析秀丽隐杆线虫（C. elegans）的运动情况。这些方法可用于解析参与PreOn样蛋白细胞间移动及其非细胞自主毒性的遗传通路。在根据随附的文字版实验方案制备同步化的秀丽隐杆线虫对照株和PreOn结构域转基因株以及10%琼脂垫后，用移液器将3微升浓度为100纳克的聚苯乙烯微球和3微升4毫摩尔的利马唑（limassol）加入琼脂垫中。

使用铂金丝挑取工具将处于所需发育阶段的线虫从培养皿转移到溶液中，并用盖玻片覆盖，以便在亚细胞水平上观察线虫。将载玻片放入共聚焦显微镜的载物台夹持器中，使用63×或100× 1.4 NA油镜物镜。接着，打开METAMORPH软件，选择多维采集模式。

在主选项卡下，勾选时间间隔和运行日志的复选框。在保存选项卡下，选择或创建用于保存文件的目录文件夹，并为文件指定名称。在波长选项卡下，使用Yoko quad red或等效的MRFP成像照明，并将曝光时间调整为100至300毫秒之间，相机增益调整为100至300之间。接下来，在时间间隔选项卡下，将时间间隔设置为1秒，持续时间为5分钟，时间点数量设置为301个。

在“期刊”选项卡下。对于期刊，选择 A FC 设置、Z 保持，以及 A FC 返回至 Z 保持；对于类型，选择“特殊”两次；对于初始点，选择时间点的起始和结束。设置完成后，按下“采集”。完成此操作后，可使用其他方法（如颗粒追踪应用）来测量盘状物的动态特性。

在同步化朊病毒结构域转基因线虫和野生型线虫，并根据文本方案复制干扰RNA文库平板后，将重复的RNAi平板在37摄氏度、300 RPM条件下孵育，使用HT115大肠杆菌（携带空载体L4440）作为对照。将其在培养管中单独培养，然后使用多通道移液器将65微升培养物转移至含有自动化工作站多通道分配头的2块96孔板的四分之一孔中。

向每个RNAi细菌和对照平板中加入10微升浓度为5毫摩尔的稀释IPTG。在细菌培养期间，将平板重新密封并孵育3小时。将同步化的野生型对照和转基因L1幼虫与M9缓冲液充分混合，然后用移液器吸取5至10微升滴加到玻璃显微镜载片上。

对线虫进行计数，并计算每微升中的线虫数量。在三小时的细菌孵育后，将培养板从培养箱中取出，使其恢复至室温，以避免线虫受到热应激。随后，根据文本方案，向M九缓冲液中添加IPTG、胆固醇和抗生素。

将适量的PreOn结构域转基因蠕虫溶液加入，使混合液中蠕虫终浓度为每微升15只，混匀以确保分布均匀。随后，将50微升该混合液分别加入RNAi平板以及其中一个空载体对照平板的各孔中。将野生型蠕虫溶液加入第二个对照平板的各孔中。

然后将所有培养板保持未密封状态，以利于通气，并通过将四到五个培养板叠放在一起，先用湿润的纸巾包裹，再用铝箔包裹，防止液体培养物蒸发。将培养板在20摄氏度、200 RPM条件下培养四天。对于培养板，使用连接至带显示器计算机的Falcon四M 60相机，通过视觉筛选与对照处理的PreOn结构域转基因动物相比摆动动作增加的情况。

使用自动化液体处理工作站将线虫分配到RNAi平板上的主要优势在于，它能显著降低每个孔中线虫数量的变异性。在固体平板上进行运动能力检测并验证候选RNAi克隆时，需按照文本方案所述，将RNAi细菌过夜培养。随后使用1 mM IPTG诱导dsRNA表达3小时。

取每种RNAi细菌克隆150微升，接种至先前准备好的NGM平板上，并涂布成薄层。在避光条件下，于体视显微镜下室温静置干燥两天。按照前述方法确定同步化线虫的数量及悬浮液体积，并将25至30条L1期幼虫加入每个实验平板中。

将线虫在20摄氏度下培养四天，直至线虫达到成虫第二天。为定量分析线虫运动能力，打开相机和Simple PCI成像软件。单击相机图标以调节成像条件。

接下来，按如下条件设置成像参数：将增益设为零光模式，高速指数设为1，合并像素（binning）设为2。然后点击“实时”和“自动曝光”，通过调节显微镜的反射镜以及亮度和对比度旋钮来优化照明条件。

点击时间，扫描并输入文件夹名称和文件名，将字段延迟设置为 20 毫秒，停止时间设置为 30 秒。按下实时预览以选择需要记录的孔板区域。然后在载物台上轻敲孔板三到四次。

快速确认其在视野中的位置，视频录制完成后立即右键点击图像，选择“导出拼接序列”，将电影从 CXD 格式导出为 AVI 文件。为分析运动性视频，请打开 ImageJ，选择“插件”选项卡，然后选择“线虫追踪器”（Worm Tracker），点击“Worm Tracker Batch”（批量线虫追踪），在 Worm Tracker Batch 的主输入窗口中选择包含所有待分析文件的目录，并按照此处详述的参数加载输入值。每个参数的具体说明可在插件附带的使用说明中找到。

单击“确定”并允许进行运动分析。最后，为整理分析结果，请确认所有检测到的轨迹均来自真实的海兔，排除伪迹。打开为每段视频生成的 TXT 文件，并将信息复制到数据分析软件文件中。

打开生成的标签压缩文件，运行其中的标签TIFF图像，以手动检查并剔除错误的线虫轨迹。实验室前博士后研究员Yesper Peterson最先提出线虫追踪器的构想，旨在替代我们对秀丽隐杆线虫（C. elegans）运动能力的手动评估，后者是毒性检测的一种读数指标。借助延时成像技术，线虫追踪器使我们能够以自动化方式开展这些实验，避免人为偏差，同时在更短时间内评估更多实验条件。

标记了RFP的R二E二蛋白在管状囊泡中聚集，通过共表达折叠传感器或应激报告基因可观察到其在细胞内及细胞间的转运过程。结合PreOn样蛋白，可同时评估细胞自主性和非细胞自主性效应。在肌肉细胞中表达R二E二可导致肠道中Q四四聚集提前发生，表明R二E二对蛋白质稳态具有非细胞自主性影响。R二E二与SOD三PGFP转录氧化应激报告基因共表达时，可在不同组织中诱导报告基因上调，证明PreOn结构域在全基因组筛选后可非细胞自主地引发氧化应激反应。

本视频显示，通过计算机屏幕进行高分辨率成像和可视化，可同时筛选一个孔板四分之一区域的样本。一旦掌握该筛选流程，每次可完成25块孔板、共12轮的筛选。若每周进行两次筛选，则可在六周内完成整个RNAi文库的筛选。此处所示，利用线虫追踪系统对秀丽隐杆线虫（C. elegans）的运动能力进行了定量分析。

Worm Tracker 将原始视频转换为二值格式，并为每条线虫分配一条轨迹。可查看已处理的视频，其上叠加有轨迹，以便手动消除任何伪影。每秒体长参数可校正潜在的大小差异。线虫。

该方法鉴定出35种抑制PreOn诱导毒性的因子，与对照处理的线虫相比，这些因子使运动表型提高至至少133%，最高达256%。在使用线虫追踪系统时，务必手动验证所获得的线虫轨迹。尽管该软件在识别线虫方面表现优异，但有时仍可能将背景误识别为生物体。

因此，请务必在使用蠕虫追踪系统分析视频后检查视频结果。这些方法有助于回答神经退行性疾病领域中的一些关键问题，例如某种致病相关蛋白是否能够在细胞间传播，是否存在类似前体的特性，或这些蛋白的细胞间传播与其复杂毒性之间是否存在关联。