Name: 调查的传播和毒性朊病毒样蛋白使用后生动物模式生物温度。线虫 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 57 s
Description: 了解朊病毒样蛋白在秀丽隐杆线虫中的传播与毒性机制。本研究利用延时荧光显微镜和全基因组RNAi筛选技术，揭示神经退行性疾病中蛋白质聚集的调控新靶点。

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感谢Cindy Voisine和Yoko Shibata对本文手稿提出的有益讨论和宝贵意见。感谢西北大学高通量分析实验室（HTAL）和生物成像中心（BIF）提供的协助。本研究由美国国立卫生研究院（NIGMS、NIA、NINDS）、艾略特医学基金会以及丹尼尔·F·和阿达·L·赖斯基金会（资助对象：R.I.M.）提供的资助支持。C.I.N.-K. 受德国研究基金会（KR 3726/1-1）资助。

1. 通过跨细胞传播监测类朊病毒蛋白 体内 延时成像
注意：培养 秀丽隐杆线虫 野生型（WT）（N2）及转基因品系，按照标准方法培养，并严格控制培养温度47.
<ol>
	<li>生成转基因品系 秀丽隐杆线虫 表达带有单体红色荧光蛋白（mRFP）标签的类朊病毒蛋白。观看此视频，了解如何使用显微注射技术48有关整合这些染色体外品系的更多详细信息和方法，请参见49.</li>
	<li>根据标准方法通过产卵或漂白制备同步化群体50.
	<ol>
		<li>通过产卵进行同步化
		<ol>
			<li>将10 - 20只怀卵成虫转移至培养皿中，让其产卵1 - 2小时。移除成虫，让后代在培养皿中生长至所需年龄。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>漂白同步化
		<ol>
			<li>收集未同步的成年 gravid 线虫群体，用碱性次氯酸盐溶液（250 mM NaOH 和商用漂白剂在 H₂O 中 1:4 (v/v) 稀释）处理2O). 用M9缓冲液洗涤卵子两次（218 × g，1分钟）47 (21 mM Na2HPO4·7H2O₂, 22 mmol/L KH2PO4，86 mM NaCl，1 mM MgSO₄4·7H2O，加入dH₂O2最多可达 1 L。</li>
			<li>在M9缓冲液中，于温和振荡条件下过夜孵化 20 °C线虫在缺乏食物来源时，其发育将在L1阶段停滞，从而获得同步化的群体。将L1幼虫转移至接种了OP50的大肠杆菌的新型线虫培养基（NGM）平板上。 E. coli 细菌并让后代发育至所需年龄47.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>制备2%琼脂糖垫（溶于H2O）置于载玻片上，具体操作如所述50.
	<ol>
		<li>准备两张载玻片，在其整个长度上贴上标签胶带，用作间隔物。将第三张载玻片置于二者之间。</li>
		<li>将2%琼脂糖溶解于H2O，用移液器吸取一滴至洁净的载玻片上。</li>
		<li>将第四张载玻片垂直置于琼脂液滴上方的另外三张载玻片之上，轻轻按压，使琼脂垫的厚度与标签胶带的厚度一致。</li>
		<li>静置1分钟使其干燥，然后移除间隔物，轻轻将载玻片分开。琼脂垫将附着在其中一张载玻片上。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>移液器 ~10 µl 麻醉剂（M9缓冲液中含2 mM左旋咪唑）滴加到载玻片上，用铂金丝挑取约10只动物转移至液滴中，盖上盖玻片（约22 × 22 mm），并在1小时内完成成像。</li>
	<li>或者，为了延长成像时间，或进一步降低动物移动的可能性，可采用麻醉剂与微珠固定相结合的方法51.
	<ol>
		<li>制备10%琼脂糖垫（使用M9缓冲液），方法如所述51 并加入线虫 3 µl 纳米球尺寸标准溶液（聚苯乙烯微珠，100 nm）加 3 µl 麻醉剂（M9缓冲液中含4 mM左旋咪唑）。轻轻盖上盖玻片。为防止干燥，用VALAP（等量凡士林、羊毛脂和石蜡的混合物）密封盖玻片。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用共聚焦显微镜对固定在载玻片上的线虫进行成像。 
	注意：结果使用配备 EM-CCD 相机和显微镜自动系统的转盘共聚焦显微镜获得 &amp; 图像分析软件（如 MetaMorph）可实现下述具体功能，但其他类似的共聚焦成像系统也可使用。
	<ol>
		<li>使用63X或100X/1.4NA油镜物镜，将载有线虫的显微镜载玻片放入显微镜载物台夹中。</li>
		<li>打开软件。调整激光功率和滤光片以进行 mRFP 成像。使用 561 nm 激光，功率设为 10%，并选择相应的发射滤光片 &gt;600 nm</li>
		<li>打开“多维采集”模块。在“主”选项卡下，勾选“时间序列”和“运行日志”（硬件自动对焦：关闭）。</li>
		<li>在“保存”选项卡中，选择或创建用于保存文件的目录文件夹，并为文件命名。</li>
		<li>在“Wave Length”选项卡下选择合适的照明条件，并调整曝光时间和增益。使用“YokoQuad Red”（或适用于mRFP成像的等效照明设置），曝光时间设置在100至300毫秒之间，相机增益设置在100至300之间，具体数值根据样品情况（通过实时图像评估）进行调整。</li>
		<li>在“时间序列”选项卡中，选择“时间点数量” = 301，“持续时间” = 5 min，“时间/间隔” = 1 sec。</li>
		<li>在“Journals”选项卡下，选择期刊：“AFC SET Z HOLD”和“AFC Return to Z HOLD”，类型：“Special”（两次），起始点：“Start of time point”和“End of time point”。此自动对焦选项对于在较长时间内对同一区域进行成像至关重要。</li>
		<li>当设置完成后，按下“Acquire”。时间序列视频将被保存为独立的 TIFF 文件。</li>
		<li>打开 ImageJ 中给定时间序列的所有 .tiff 文件。依次选择“图像”→“堆栈”→“图像成堆栈”。可选地，调整亮度和对比度，添加比例尺等。在“文件”→“另存为”→“AVI…”中导出视频（示例见对应于 图1).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 利用折叠传感器和应激报告基因研究细胞自主性和非细胞自主性对蛋白质稳态及毒性的效应
<ol>
	<li>构建共表达折叠传感器或应激报告基因与朊病毒样蛋白的转基因品系。有关建立杂交或生成转基因品系的方法，请参见48,49,52。可用于本实验的C. elegans菌株列表见表1。</li>
	<li>制备同步化的转基因动物群体，并按照上述方法（第1.2节）培养至所需年龄50。</li>
	<li>使用体视显微镜观察折叠传感器或应激报告基因对应的表型。
	<ol>
		<li>对于折叠传感器，测定每次同步化后每一天含有蛋白聚集体的动物数量（示例见图2E和F）。</li>
		<li>对于应激报告基因，检测共表达朊病毒样蛋白是否导致报告基因荧光增强（示例见图3）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 在 C. elegans 中进行全基因组筛选以抑制朊病毒诱导的毒性
<img alt="RNAi 实验流程、孵育步骤、L1 期线虫、方法：基因筛选、示意图。" src="/files/ftp_upload/52321/52321fig4highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 4"> 
图 4. RNAi 筛选实验流程的示意图。 有关各个步骤的详细说明，请参见第 3 节实验方案部分。
<ol>
	<li>同步化 C. elegans 线虫与RNAi文库的扩增
	<ol>
		<li>对于RNAi筛选，使用Ahringer RNAi文库（或Vidal RNAi文库）53,54将RNAi文库从原始的384孔板重新排列至96孔板，通过向孔板中加入 100 µl LB-amp 培养基（50 μg/ml 在含氨苄青霉素的LB培养基中加入10%甘油，并使用96针复制器接种。于37℃培养 37 °C 过夜振荡，于 -80 °C.</li>
		<li>维持 C. elegans 野生型和转基因品系在 20 °C 在接种了OP50的NGM平板上 E. coli 根据标准方法对细菌进行处理47.</li>
		<li>通过漂白法同步化朊病毒样结构域转基因和野生型（对照）线虫（参见第1.2节）。</li>
		<li>在对线虫进行漂白的同一天，准备添加补充剂的LB培养基 50 μg/ml 氨苄青霉素。使用自动试剂分配器分配（或手动移液） 65 μl 将LB-amp培养基加入96孔板的每孔中。</li>
		<li>从 -80 °C 中取出 96 孔 Ahringer RNAi 文库板80 °C 并将它们放入铺有纸巾的无菌操作台中。在培养皿仍处于冷冻状态时，立即将培养皿倒置，小心撕去封口胶带，注意避免培养皿外表面的冰晶造成污染。随后将培养皿重新正置，室温解冻约30分钟。</li>
		<li>将一个无菌的96针复制器浸入一个RNAi文库板，然后浸入一个新鲜的LB-amp平板中。每个平板均需使用新的无菌复制器。用压敏封板膜密封所有平板，并将文库板放回-80 °C复制器可浸泡在漂白剂中，冲洗后高压灭菌，以便再次使用。</li>
		<li>让重复的RNAi平板在设定的培养箱中过夜培养 37 °C 和 300 rpm。使用 HT115 E. coli 携带空载体（L4440）的细菌作为对照，分别在培养管中培养，然后用移液器转移 65 μl 使用多通道移液器将培养物加入两块96孔板的各一个象限中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>诱导细菌产生双链RNA并添加线虫
	<ol>
		<li>将异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷（IPTG）用ddH₂O稀释至5 mM浓度2O. 使用带多通道头的自动化工作站进行分液（或手动移液） 10 μl 将稀释的IPTG加入RNAi细菌和对照组平板的每个孔中。重新密封后，将平板放回培养箱。在37°C下振荡培养3小时 37 °C.</li>
		<li>当细菌处于振荡状态时，准备线虫。充分混匀M9/线虫悬液，并用移液器吸取少量样品（约5 - 10 µl) 转移至玻璃显微镜载玻片上。在体视显微镜下计数线虫数量，并计算每单位中的线虫数目 μl.</li>
		<li>使用无菌技术，配制添加物M9（M9+）溶液，终浓度如下：0.20 mg/ml IPTG 8.0 μg/ml 胆固醇 50 μg/ml 氨苄青霉素 9.6 μg/ml 四环素， 0.0835 μg/ml 两性霉素B，每份15条蠕虫 50 μl.
		<ol>
			<li>分别为朊病毒样结构域转基因线虫和野生型线虫配制独立的溶液。所需M9缓冲液加线虫溶液的最终体积取决于复制的RNAi平板数量（见下文），此外若使用自动分配仪，还需额外预留约30 ml无法分配的残留体积。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>在细菌dsRNA诱导3小时后，将培养板从培养箱中取出，室温下静置约30分钟，使其冷却，以避免对动物造成热应激。</li>
		<li>分配 50 μl 将M9+ 朊病毒结构域转基因线虫溶液加入RNAi平板以及一个空载体对照平板的每个孔中。每次操作前务必混匀线虫溶液，因为线虫容易沉降到储液槽底部。</li>
		<li>将野生型蠕虫分配至第二个对照培养皿中。保持培养皿未密封，以确保通气。为防止液体培养基蒸发，将4-5个培养皿叠放在一起，并用湿润的纸巾和铝箔包裹。在200 rpm条件下孵育。 20 °C 4天。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>评分 
	注意：线虫在培养箱中培养4天后将进入成虫第二天，此时可进行筛选。筛选前让动物在无振荡条件下适应30分钟，以确保其自由、不受干扰地运动。
	<ol>
		<li>使用连接至带显示器计算机的 Falcon 4M60 相机，观察与对照处理的朊病毒结构域转基因动物相比是否出现加剧的剧烈抽搐行为。</li>
		<li>使用 wrMTrck 编制一份初步筛选结果列表以进行验证（见下一节）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 初筛阳性结果的验证
<ol>
	<li>固体平板上的运动能力检测
	<ol>
		<li>根据标准方法制备含有NGM培养基的平板，并添加100 µg/ml氨苄青霉素、12.5 µg/ml四环素和1 mM IPTG47。如有可能，使用平板倾注仪以确保所有平板的培养基高度一致，从而便于后续视频采集过程的标准化。</li>
		<li>在约1 ml LB培养基（含50 µg/ml氨苄青霉素）中培养不同的RNAi菌株，37 °C、250 rpm条件下过夜培养。</li>
		<li>次日，加入1 mM IPTG诱导dsRNA表达，持续3小时。将每种RNAi细菌克隆各取150 µl接种至平板上，并涂布成薄层。将平板置于室温、避光条件下干燥2天。每种RNAi克隆准备3个平板。</li>
		<li>按照标准方法通过漂白法同步线虫群体50（见第1.2节），并将卵置于M9培养基中过夜孵化。</li>
		<li>取少量线虫悬液，在体视显微镜下测定每µl中的线虫数量。然后用移液器将适量的M9缓冲液与线虫加入各实验平板，使每个平板含有25–30条L1期幼虫。将线虫在20 °C下培养4天，直至其发育至成虫第2天。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用ImageJ的wrMTrck插件对线虫运动能力进行定量分析 
	注：视频使用体视显微镜在10倍放大倍数下拍摄，配备Hamamatsu Orca-R2数字相机C10600-10B及Hamamatsu Simple PCI成像软件。
	<ol>
		<li>打开相机和Simple PCI成像软件。点击“Live”以调整成像条件。</li>
		<li>设置视频参数如下：增益（Gain）= 0；光照模式（Light Mode）= 高；速度指数（Speed Index）= 1；像素合并（Binning）= 2。点击“Auto Expose”，然后调整照明条件，调节显微镜反光镜以及亮度和对比度旋钮。 
		注：视频需具有高对比度但不能过曝，使动物呈现为明亮背景上的黑色轮廓。</li>
		<li>点击“Time Scan”，选择保存文件夹和文件名。将“Field Delay”设为20 msec，“Stop at Time”设为30秒。点击“Live Review”以选择待录制区域（线虫最集中的区域）。快速轻敲载物台上的平板3至4次，迅速确认其在视野中的位置，然后点击“Start”开始录制。</li>
		<li>视频录制完成后，右键单击图像，选择“Export Montage Sequence”，将视频从.cxd格式导出为.avi格式。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>分析运动视频
	<ol>
		<li>打开ImageJ软件，进入“Plugins”选项卡，选择“wrmtrck”，然后点击“wrMTrck Batch”。选择包含所有待分析文件的目录。</li>
		<li>在wrMTrck_Batch的主输入窗口中，加载如图5C所示的输入参数。各参数的具体说明可在插件附带的使用说明中查阅。点击“OK”，开始运行运动分析程序。</li>
		<li>为校验分析结果，确认所有检测到的轨迹均来自真实的C. elegans并排除伪迹，需打开每个视频生成的.txt文件，将数据复制到数据分析软件中。打开生成的“*_labels.zip”文件，运行其中的“*_labels.tif”图像，手动检查并删除错误的线虫轨迹。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

作者声明不存在竞争性财务利益。

本文所述方法有助于阐明类朊病毒蛋白的扩散行为及其复杂的细胞自主性和非细胞自主性毒性。我们最近发现，一个易于聚集的细胞质朊病毒结构域可通过一种与自噬相关的过程被摄入膜结合囊泡中。其中特定亚群的囊泡可在细胞内以及细胞与组织之间运输该朊病毒结构域40。在活体动物中监测这些囊泡运动的关键在于，目标蛋白必须标记mRFP，因为只有标记mRFP的蛋白才能在这些可能呈酸性的囊泡中被观察到。采用相同方法，我们目前正在研究某些与疾病相关的蛋白是否具有潜在的类朊病毒特性，例如超氧化物歧化酶1（SOD1）（与肌萎缩侧索硬化症ALS相关）、α-突触核蛋白（与帕金森病PD相关）或TAR DNA结合蛋白43（TDP-43）（与ALS相关）。尽管这种囊泡介导的细胞间运输可能也被其他多种蛋白所利用，但仍可能存在其他促进扩散的途径。
使用特征明确的折叠传感器是监测 C. elegans 细胞内蛋白质折叠环境变化的有力工具63-66。本文展示了如何利用在组织特异性启动子驱动下表达的荧光标记易聚集蛋白，通过其随年龄增长的累积情况，实现对不同组织折叠能力的可视化...

许多神经退行性疾病，包括阿尔茨海默病（AD）、帕金森病（PD）、肌萎缩侧索硬化症（ALS）和传染性海绵状脑病（TSEs），均与易于聚集的蛋白质相关，因此统称为蛋白质错误折叠疾病（PMDs）。TSEs 或朊病毒疾病是一类独特的 PMDs，因其在人类和动物中均具有传染性1。在分子水平上，朊病毒通过招募并转化单体形式、富含α-螺旋的宿主编码细胞型PrP（PrPC）成为富含β-折叠的致病型PrPSc构象来实现自我复制2,3。自我传播的蛋白质聚集体也在真菌中被发现，其具有与哺乳动物朊病毒相似的重要特征4,5。此外，哺乳动物朊病毒能够在细胞间传播并感染未受感染的细胞6,7。
尽管除TSEs以外的PMDs不具有传染性，但它们与朊病毒疾病具有一种共同的致病机制8,9尽管与每种PMDD相关的蛋白质在结构或功能上并无关联，但它们均通过一种类似结晶的过程（称为成核或种子化聚合）形成聚集体；此外，这些蛋白质种子通过招募其可溶性同种异型体而不断生长。2,10,11自我增殖的效率存在差异 体内，取决于蛋白质的内在特性，这些特性与分子伴侣等其他细胞因子共同最终决定了聚集体的成核、接种、断裂和扩散速率12-15因此，这些因素之间必须存在一种精细的平衡，以实现蛋白质聚集的高效传播。这也可能解释为何仅部分淀粉样聚集物具有朊病毒的特征，因而并非所有蛋白质构象病（PMDs）都具有传染性。朊病毒似乎代表了广泛存在的自复制蛋白聚集物中的“高性能者”，这使其成为研究蛋白质构象病的有力工具8,13.
引人注目的是，与疾病相关的蛋白聚集物所引发的毒性通常具有非细胞自主性成分16,17。这意味着它们会影响那些不表达相应基因的邻近细胞，这与严格的细胞自主性效应不同，后者仅指表达该基因的细胞表现出特定表型。这一现象已在多种神经退行性疾病模型中通过组织特异性表达或敲低相关蛋白得到了有力证明18-26。目前已有多种机制被提出用于解释蛋白质错误折叠疾病（PMDs）中的非细胞自主性毒性，包括营养供应减少、神经元信号失衡、谷氨酸兴奋性毒性以及神经炎症16,27,28。此外，疾病相关聚集物在细胞间的类朊病毒样传播也可能参与其中29,30。越来越多的证据表明，除朊病毒外的其他蛋白包涵体也可在细胞间传递，这或许可以解释许多蛋白质错误折叠疾病中所观察到的病理特征的典型扩散模式30-36。然而，目前尚不清楚致病蛋白的细胞间传播与对邻近细胞的毒性效应之间是否存在明确的因果关系。因此，深入理解介导蛋白在细胞间传播及非细胞自主性毒性的细胞通路，对于开发新型治疗策略至关重要。然而，在多细胞生物中，尤其是从整体生物体水平来看，关于类朊病毒样扩散过程以及影响错误折叠蛋白细胞间传递的细胞因子，仍有许多方面尚未明确。
线虫 秀丽隐杆线虫 具有多项优势，提供了潜在的可能性 发现后生动物中类朊病毒传播的新层面17透明，便于观察 体内 在活体生物中对荧光标记蛋白进行示踪。此外，许多受疾病影响的细胞和生理过程从线虫到人类均具有保守性， 秀丽隐杆线虫 也可进行多种遗传操作以及分子和生化分析37-39成年雌雄同体秀丽线虫由恰好959个体细胞组成，其身体结构简单，但仍包含多种不同的组织类型，包括肌肉、神经元和肠道。
建立新的朊病毒模型 秀丽隐杆线虫， 我们选择外源表达细胞质酵母朊病毒蛋白 Sup35 的特征明确的富含谷氨酰胺/天冬酰胺（Q/N）的朊病毒结构域 NM，因为线虫中不存在已知的内源性朊病毒蛋白4,40酵母朊病毒在阐明朊病毒复制的基本机制方面具有重要价值41-44此外，NM 是首个在哺乳动物细胞培养中被证实能够重现朊病毒完整生命周期的胞质类朊蛋白。45,46同样，当表达在 秀丽隐杆线虫与酵母细胞相比，Sup35 朊病毒结构域在动物细胞中传播的不同需求下表现出显著的适应性，并展现出朊病毒生物学的关键特征40. NM 聚集与显著的毒性表型相关，包括在线粒体完整性受损和细胞水平上出现多种与自噬相关的囊泡，以及在个体水平上导致胚胎和幼虫停滞、发育延迟，以及蛋白质折叠环境的广泛紊乱。值得注意的是，朊病毒结构域表现出细胞自主性和非细胞自主性毒性，可影响未表达该转基因的邻近组织。此外，可在活体中实时监测朊病毒结构域在细胞内及细胞间的囊泡运输过程。 体内40.
本文介绍了如何在C. elegans中研究类朊病毒的扩散过程。我们将阐述如何利用延时荧光显微镜监测含有朊病毒结构域的囊泡在细胞内和细胞间的运输。我们将重点介绍使用组织特异性折叠传感器和普遍表达的应激报告系统，以评估对细胞适应性的细胞自主性和非细胞自主性影响。最后，我们将描述最近开展的一项全基因组范围RNA干扰（RNAi）筛选实验的操作流程，以鉴定调控朊病毒诱导毒性的新修饰因子。综合这些方法，有助于解析参与蛋白质细胞间转移及其非细胞自主性毒性的遗传通路。

<table><tbody><tr><td>试剂</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>纳米球尺寸标准 100 nm</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>3100A</td><td></td></tr><tr><td>左旋咪唑</td><td>Sigma</td><td>L-9756</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Sigma</td><td>15502-10G</td><td></td></tr><tr><td>Ahringer RNAi文库</td><td>来源 生物科学 生命科学&amp;nbsp;</td><td></td><td>http://www.lifesciences.sourcebioscience&lt;br/&gt; .com/克隆产品/非哺乳动物/秀丽隐杆线虫/秀丽隐杆线虫RNAi文库/</td></tr><tr><td>设备</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sorvall Legend XTR 制冷离心机，120 VAC</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>75004521</td><td>http://www.coleparmer.com/Product/Thermo_Scientific_Sorvall_Legend_&lt;br/&gt; XTR_制冷离心机_120&lt;br/&gt; VAC/EW-17707-60</td></tr><tr><td>96针复制器&amp;nbsp;</td><td>Scionomix&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td></td><td>http://www.scinomix.com/all-products/96-pin-replicator/</td></tr><tr><td>HiGro 高容量恒温培养摇床&amp;nbsp;</td><td>Digilab</td><td></td><td>http://www.digilabglobal.com/higro</td></tr><tr><td>Multidrop Combi 试剂分配器&amp;nbsp;</td><td>Titertrek</td><td></td><td>http://groups.molbiosci.northwestern.edu/hta/titertek.htm</td></tr><tr><td>Biomek FX AP96 自动化工作站&amp;nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td>http://groups.molbiosci.northwestern.edu/hta/biomek_multi.htm</td></tr><tr><td>Innova44 摇床</td><td>新不伦瑞克</td><td></td><td>http://www.eppendorf.com/int///index.php?sitemap=2.3&amp;amp;pb=d78efbc05310ec&lt;br/&gt; 04&amp;amp;action=products&amp;amp;内容编号=1&amp;amp;&lt;br/&gt; catalognode=83389</td></tr><tr><td>M205 FA&amp;nbsp;</td><td>Leica</td><td></td><td>http://www.leica-microsystems.com/de/produkte/stereomikroskope-makroskope/fluoreszenz/details/product/leica-m205-fa/</td></tr><tr><td>ORCA-R2 C10600-10B 数字化 CCD 相机</td><td>滨松</td><td></td><td>http://www.hamamatsu.com/jp/en/community/life_science_camera/product/search/C10600-10B/index.html</td></tr><tr><td>转盘共聚焦显微镜&amp;nbsp;</td><td>Leica</td><td></td><td>http://www.leica-microsystems.com/products/light-microscopes/life-science-research/fluorescence-microscopes/details/product/leica-sd-af/</td></tr><tr><td>Falcon 4M60 相机&amp;nbsp;</td><td>Teledyne Dalsa&amp;nbsp;</td><td></td><td>http://www.teledynedalsa.com/imaging/products/cameras/area-scan/falcon/PT-41-04M60/</td></tr><tr><td>软件</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MetaMorph 显微镜自动化 &amp;amp; 图像分析软件</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td>http://www.moleculardevices.com/products/software/meta-imaging-series/metamorph.html</td></tr><tr><td>滨松 SimplePCI 图像分析软件</td><td>Meyer Instruments</td><td></td><td>http://meyerinst.com/imaging-software/hamamatsu/index.htm</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>美国国立卫生研究院</td><td></td><td>http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html</td></tr><tr><td>ImageJ 的 wrMTrck 插件</td><td></td><td></td><td>http://www.phage.dk/plugins/wrmtrck.html</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;秀丽隐杆线虫&lt;/em&gt; 品系</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>N2（野生型）</td><td>秀丽隐杆线虫遗传学中心（CGC）</td><td></td><td>http://www.cgc.cbs.umn.edu/strain.php?id=10570</td></tr><tr><td>AM815&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; rmIs323[myo-3p::sup35(r2e2)::rfp]</td><td>Morimoto 实验室</td><td></td><td>可从本实验室获取&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>参见表1获取折叠传感器和应激报告基因品系的来源</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

利用多细胞模式生物 c. elegans 研究类朊病毒蛋白的扩散与毒性

Investigating the Spreading and Toxicity of Prion-like Proteins Using the Metazoan Model Organism C. elegans

朊病毒是一类非传统的、可自我传播的蛋白质颗粒，不含任何编码核酸。这些蛋白质种子可作为模板，介导其良性细胞异构体的构象转换与复制。越来越多的证据表明，许多蛋白质聚集体可作为自我传播的模板，并诱导同源蛋白质发生错误折叠。尽管在某些情况下聚集体具有功能作用，但这一过程通常会破坏细胞内的蛋白质稳态（蛋白稳态），最终导致阿尔茨海默病（AD）、帕金森病（PD）、肌萎缩侧索硬化症（ALS）或传染性海绵状脑病（TSEs）等毁灭性疾病。目前，关于朊病毒传播机制以及蛋白质聚集体在细胞间扩散的具体过程仍在深入研究之中。为了进一步推动该领域的认知，近期已建立了一种在秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）中表达酵母细胞质朊病毒蛋白Sup35朊病毒结构域的多细胞动物模型。该朊病毒模型具有多项优势，例如可在活体动物中直接监测荧光标记的朊病毒结构域，并便于开展遗传学研究。本文所述方法可用于研究蛋白质聚集体的类朊病毒行为，并利用C. elegans鉴定调控朊病毒诱导毒性的相关因子。

通过监测类朊病毒蛋白的细胞间扩散 体内 延时成像
转基因 C. elegans 表达朊病毒结构域的细胞系特别适用于对类朊病毒蛋白某些方面的分析， 例如，细胞间传播以及非细胞自主毒性。动物的透明性使得能够在整个生命周期的各个阶段，在活体生物体内追踪荧光标记的蛋白质。利用这一特性，可通过荧光显微镜观察类朊病毒蛋白在细胞和组织间的移动。必须使用63X或100X/1.4NA油镜物镜，以清晰分辨囊泡结构。重要的是，朊病毒结构域必须用mRFP标记，以便在这些可能呈酸性的囊泡中保持荧光可见性40黄色荧光蛋白（YFP）常被用作标签，但由于其在低pH环境中会发生荧光淬灭，因此不适用。40,55菌株 AM815 表达带有 RFP 标签的 R2E2（一种高度易于聚集且具有毒性的朊病毒结构域 NM 的形式），该蛋白会积聚在管状囊泡中，而单独的 RFP 标签则保持可溶状态图1A...

蛋白质聚集体的朊病毒样传播最近被发现与多种神经退行性疾病相关。本实验方案的目的是介绍如何利用线虫 C. elegans 作为模式系统来监测蛋白质的扩散，并研究朊病毒样现象。

利用多细胞模式生物 C. elegans 研究类朊病毒蛋白的扩散与毒性

朊病毒是一类非传统的、可自我传播的蛋白质颗粒，不含任何编码核酸。这些蛋白质种子可作为模板，用于……

以下实验的总体目标是利用后生动物模式生物 C. elegans 研究 Prion样蛋白的扩散及其复杂的毒性。通过使用延时荧光显微镜监测含有Prion样蛋白的囊泡在细胞内和细胞间的运输来实现这一目标。接下来使用组织特异性折叠传感器和普遍表达的应激报告系统。报告基因用于评估细胞自主性和非细胞自主性对细胞适应性的影响。随后进行全基因组RNAi筛选，以鉴定PreOn诱导毒性的新调控因子。该筛选在液体培养条件下进行，以颤动行为作为毒性读出指标。最后，使用 Worm Tracker（ImageJ 的一个插件）来定量分析秀丽隐杆线虫（C. elegans）的运动情况。这些方法可用于解析参与PreOn样蛋白细胞间移动及其非细胞自主毒性的遗传通路。在根据随附的文字版实验方案制备同步化的秀丽隐杆线虫对照株和PreOn结构域转基因株以及10%琼脂垫后，用移液器将3微升浓度为100纳克的聚苯乙烯微球和3微升4毫摩尔的利马唑（limassol）加入琼脂垫中。使用铂金丝挑取工具将处于所需发育阶段的线虫从培养皿转移到溶液中，并用盖玻片覆盖，以便在亚细胞水平上观察线虫。将载玻片放入共聚焦显微镜的载物台夹持器中，使用63×或100× 1.4 NA油镜物镜。接着，打开METAMORPH软件，选择多维采集模式。在主选项卡下，勾选时间间隔和运行日志的复选框。在保存选项卡下，选择或创建用于保存文件的目录文件夹，并为文件指定名称。在波长选项卡下，使用Yoko quad red或等效的MRFP成像照明，并将曝光时间调整为100至300毫秒之间，相机增益调整为100至300之间。接下来，在时间间隔选项卡下，将时间间隔设置为1秒，持续时间为5分钟，时间点数量设置为301个。在“期刊”选项卡下。对于期刊，选择 A FC 设置、Z 保持，以及 A FC 返回至 Z 保持；对于类型，选择“特殊”两次；对于初始点，选择时间点的起始和结束。设置完成后，按下“采集”。完成此操作后，可使用其他方法（如颗粒追踪应用）来测量盘状物的动态特性。在同步化朊病毒结构域转基因线虫和野生型线虫，并根据文本方案复制干扰RNA文库平板后，将重复的RNAi平板在37摄氏度、300 RPM条件下孵育，使用HT115大肠杆菌（携带空载体L4440）作为对照。将其在培养管中单独培养，然后使用多通道移液器将65微升培养物转移至含有自动化工作站多通道分配头的2块96孔板的四分之一孔中。向每个RNAi细菌和对照平板中加入10微升浓度为5毫摩尔的稀释IPTG。在细菌培养期间，将平板重新密封并孵育3小时。将同步化的野生型对照和转基因L1幼虫与M9缓冲液充分混合，然后用移液器吸取5至10微升滴加到玻璃显微镜载片上。对线虫进行计数，并计算每微升中的线虫数量。在三小时的细菌孵育后，将培养板从培养箱中取出，使其恢复至室温，以避免线虫受到热应激。随后，根据文本方案，向M九缓冲液中添加IPTG、胆固醇和抗生素。将适量的PreOn结构域转基因蠕虫溶液加入，使混合液中蠕虫终浓度为每微升15只，混匀以确保分布均匀。随后，将50微升该混合液分别加入RNAi平板以及其中一个空载体对照平板的各孔中。将野生型蠕虫溶液加入第二个对照平板的各孔中。然后将所有培养板保持未密封状态，以利于通气，并通过将四到五个培养板叠放在一起，先用湿润的纸巾包裹，再用铝箔包裹，防止液体培养物蒸发。将培养板在20摄氏度、200 RPM条件下培养四天。对于培养板，使用连接至带显示器计算机的Falcon四M 60相机，通过视觉筛选与对照处理的PreOn结构域转基因动物相比摆动动作增加的情况。使用自动化液体处理工作站将线虫分配到RNAi平板上的主要优势在于，它能显著降低每个孔中线虫数量的变异性。在固体平板上进行运动能力检测并验证候选RNAi克隆时，需按照文本方案所述，将RNAi细菌过夜培养。随后使用1 mM IPTG诱导dsRNA表达3小时。取每种RNAi细菌克隆150微升，接种至先前准备好的NGM平板上，并涂布成薄层。在避光条件下，于体视显微镜下室温静置干燥两天。按照前述方法确定同步化线虫的数量及悬浮液体积，并将25至30条L1期幼虫加入每个实验平板中。将线虫在20摄氏度下培养四天，直至线虫达到成虫第二天。为定量分析线虫运动能力，打开相机和Simple PCI成像软件。单击相机图标以调节成像条件。接下来，按如下条件设置成像参数：将增益设为零光模式，高速指数设为1，合并像素（binning）设为2。然后点击“实时”和“自动曝光”，通过调节显微镜的反射镜以及亮度和对比度旋钮来优化照明条件。点击时间，扫描并输入文件夹名称和文件名，将字段延迟设置为 20 毫秒，停止时间设置为 30 秒。按下实时预览以选择需要记录的孔板区域。然后在载物台上轻敲孔板三到四次。快速确认其在视野中的位置，视频录制完成后立即右键点击图像，选择“导出拼接序列”，将电影从 CXD 格式导出为 AVI 文件。为分析运动性视频，请打开 ImageJ，选择“插件”选项卡，然后选择“线虫追踪器”（Worm Tracker），点击“Worm Tracker Batch”（批量线虫追踪），在 Worm Tracker Batch 的主输入窗口中选择包含所有待分析文件的目录，并按照此处详述的参数加载输入值。每个参数的具体说明可在插件附带的使用说明中找到。单击“确定”并允许进行运动分析。最后，为整理分析结果，请确认所有检测到的轨迹均来自真实的海兔，排除伪迹。打开为每段视频生成的 TXT 文件，并将信息复制到数据分析软件文件中。打开生成的标签压缩文件，运行其中的标签TIFF图像，以手动检查并剔除错误的线虫轨迹。实验室前博士后研究员Yesper Peterson最先提出线虫追踪器的构想，旨在替代我们对秀丽隐杆线虫（C. elegans）运动能力的手动评估，后者是毒性检测的一种读数指标。借助延时成像技术，线虫追踪器使我们能够以自动化方式开展这些实验，避免人为偏差，同时在更短时间内评估更多实验条件。标记了RFP的R二E二蛋白在管状囊泡中聚集，通过共表达折叠传感器或应激报告基因可观察到其在细胞内及细胞间的转运过程。结合PreOn样蛋白，可同时评估细胞自主性和非细胞自主性效应。在肌肉细胞中表达R二E二可导致肠道中Q四四聚集提前发生，表明R二E二对蛋白质稳态具有非细胞自主性影响。R二E二与SOD三PGFP转录氧化应激报告基因共表达时，可在不同组织中诱导报告基因上调，证明PreOn结构域在全基因组筛选后可非细胞自主地引发氧化应激反应。本视频显示，通过计算机屏幕进行高分辨率成像和可视化，可同时筛选一个孔板四分之一区域的样本。一旦掌握该筛选流程，每次可完成25块孔板、共12轮的筛选。若每周进行两次筛选，则可在六周内完成整个RNAi文库的筛选。此处所示，利用线虫追踪系统对秀丽隐杆线虫（C. elegans）的运动能力进行了定量分析。Worm Tracker 将原始视频转换为二值格式，并为每条线虫分配一条轨迹。可查看已处理的视频，其上叠加有轨迹，以便手动消除任何伪影。每秒体长参数可校正潜在的大小差异。线虫。该方法鉴定出35种抑制PreOn诱导毒性的因子，与对照处理的线虫相比，这些因子使运动表型提高至至少133%，最高达256%。在使用线虫追踪系统时，务必手动验证所获得的线虫轨迹。尽管该软件在识别线虫方面表现优异，但有时仍可能将背景误识别为生物体。因此，请务必在使用蠕虫追踪系统分析视频后检查视频结果。这些方法有助于回答神经退行性疾病领域中的一些关键问题，例如某种致病相关蛋白是否能够在细胞间传播，是否存在类似前体的特性，或这些蛋白的细胞间传播与其复杂毒性之间是否存在关联。

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

调查的传播和毒性朊病毒样蛋白使用后生动物模式生物<em&gt;温度。线虫</em

被广泛研究的线虫秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）可通过转基因技术表达人类β-淀粉样蛋白肽（Aβ）。在秀丽隐杆线虫（C.

使用转基因 C. elegans 模型检测β-淀粉样蛋白毒性

本视频演示了对表达与红色荧光蛋白标记的类朊病毒蛋白的 C. elegans...

利用延时成像技术监测朊病毒样蛋白在转基因线虫中的跨细胞传播

我们介绍了在秀丽隐杆线虫（C.

一种用于淀粉样病变研究的 Caenorhabditis elegans 模式系统

本文中，我们介绍线虫Caenorhabditis...

秀丽隐杆线虫——一种多功能的模式生物 体内 研究宿主-微生物相互作用的模型

本文介绍一种从转基因生物中简单分离表达绿色荧光蛋白的特定活神经元细胞群的实验方案 秀丽隐杆线虫 线条.

从线虫 Caenorhabditis elegans 中分离特定神经元群体

本文介绍并描述了一种广泛可及的方法体系，利用一些多功能的线虫模型，包括由离子通道过度激活引起的细胞坏死和由蛋白质聚集物诱导的神经毒性模型，以监测并解析与年龄相关的神经退行性疾病的细胞与分子基础。...

模拟年龄相关性神经退行性疾病 秀丽隐杆线虫

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Caenorhabditis elegans 作为发现抗多聚谷氨酰胺介导神经毒性的生物活性化合物的模型系统

本文介绍了一种用于分析线虫Caenorhabditis...

监测蛋白质聚集动力学 在体 内 使用自动包涵体计数在 秀丽隐杆线虫

本视频演示了通过显微注射将外源DNA导入秀丽隐杆线虫（C.

利用显微注射法构建稳定的转基因秀丽隐杆线虫

将电生理学技术应用于可及的突触，可对突触活动进行量化测量，有助于分析突触突变体。本文描述了一种用于暴露秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans (C.

解剖并记录秀丽隐杆线虫神经肌肉接头

了解朊病毒样蛋白在秀丽隐杆线虫中的传播与毒性机制。本研究利用延时荧光显微镜和全基因组RNAi筛选技术，揭示神经退行性疾病中蛋白质聚集的调控新靶点。

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