SDF-1α-壳聚糖-硫酸葡聚糖纳米颗粒的制备与表征

以下实验的总体目标是制备并表征SD F1 Alpha趋化因子与右旋糖酐硫酸盐纳米颗粒。纳米颗粒的制备首先通过将干细胞归巢因子——基质细胞衍生因子1α（SDF-1α）与右旋糖酐硫酸盐混合，使其结合带负电荷的聚糖。第二步，向混合物中加入带正电荷的聚糖——壳聚糖，从而与右旋糖酐硫酸盐形成聚电解质复合物。

随后加入硫酸锌，以通过锌桥稳定复合物。所得颗粒具有致密的核心，外围包裹着带负电荷的壳层。接着对颗粒的粒径、zeta 电位以及纳米颗粒中 SDF-1α 的含量和活性进行测定。SDF-1α 甘露糖纳米颗粒的主要优势在于，所包载的 SDF-1α 无需从颗粒中释放即可保持完全活性。

因此，这些颗粒可作为干细胞治疗中稳定的示踪信号。首先，按照文本方案中的描述配制储备液，并通过0.22微米滤膜进行灭菌。使用超低内毒素阿米巴细胞裂解物凝胶凝块法检测所配制溶液中的内毒素水平。

确保内毒素水平低于每毫升0.06个内毒素单位。接下来，向含有磁力搅拌子的1.5毫升玻璃小瓶中加入0.18毫升超纯水。将搅拌速度设定为800 RPM，然后加入0.1毫升1%硫酸葡聚糖溶液，搅拌2分钟后即可。

加入 0.08 毫克 SD F1 alpha，搅拌 20 分钟。逐滴加入 0.33 毫升 0.1% 硫堇（tizen），搅拌 5 分钟。将搅拌速度调至最大，用气密注射器缓慢加入 0.1 毫升硫酸锌。

将搅拌速度调回800 RPM，继续搅拌30分钟。然后加入0.4毫升15%甘露醇，5分钟后再次搅拌。将反应混合物转移至1.5毫升离心管中，在4°C条件下以16,000 ×g离心10分钟。

离心后，吸除上清液，并用移液器移去最后一滴液体。缓慢加入 0.2 毫升 5%甘露醇，用 0.5 毫升 29 号针头注射器重悬沉淀。然后在离心前再加入 1 毫升 5%甘露醇。

再次在16,000 × g下离心15分钟。重复重悬沉淀物并离心的操作后，吸除上清液，并将沉淀物重悬于0.2毫升5%甘露醇溶液中。粒径和泽塔电位分别通过动态光散射和电泳光散射进行分析。

首先，从标准操作程序（SOP）列表中选择一个操作流程，该流程包含通过动态光散射法测量粒径的参数。根据文本版实验方案，用水稀释 SD F1 alpha 粒子样品。然后将 100 微升样品加入一次性紫外比色皿（如 Einor Q Vet）中。

将Q vet插入细胞架中，并等待强度调节达到最佳状态，然后开始数据采集。测量完成后，记录粒径和多分散性指数的累积结果。对四次重复测量得到的结果取平均值，并计算通过电泳光散射法测定的Zeta电位的标准偏差。

将500微升十倍稀释的颗粒样品加入流动池中。从Zeta电位标准操作程序（SOP）列表中选择一个操作程序，该程序包含文本方案中列出的测量参数。记录Zeta电位的测量结果。

然后对五次重复测定得到的结果取平均值，并计算标准偏差。将游离态和颗粒结合态SD F1 alpha的稀释样品在1×上样缓冲液中于100摄氏度加热10分钟。在10分钟加热过程中涡旋振荡样品两次，以充分解离颗粒；待样品冷却至室温2分钟后，于10,000 ×g离心0.5至1分钟，使冷凝水沉至管底，再次涡旋振荡以充分混匀。

此时，样品溶液应澄清，无可见沉淀物。然后将每个样品 10 微升加样至 4%～20% 的 SDS-ESAL 硫酸钠凝胶或 SDS 凝胶中。以 200 伏电压电泳运行 20 分钟，随后用考马斯亮蓝蛋白染色液对凝胶进行染色。

使用分子成像仪和密度分析软件检测SD F1 alpha的蛋白条带密度。根据游离SDF one alpha标准品绘制的标准曲线，计算颗粒中S DF one alpha的含量，以进行体外释放实验。将SD F1 alpha糖颗粒与不含钙和镁的磷酸盐缓冲液（DPBS）按1:1比例混合。将颗粒悬液分装至1.5毫升离心管中，每管0.05毫升。

将样品加至管底。避免引入气泡或扰动液体表面。用帕拉膜密封管口。

然后将离心管置于37摄氏度的旋转微量管混合器上旋转。在指定时间从离心管中取出等分试样，并立即在4摄氏度下以16,000 ×g离心10分钟。离心后，分离上清液和沉淀物。

然后用 0.05 毫升 DPBS 重悬沉淀。待所有样品收集完毕后，在 SDS 凝胶上检测上清液和沉淀物。与之前相同，该检测用于测定 S df 的趋化活性。

SDF1α与其受体的相互作用可诱导细胞向SDF1α浓度梯度方向迁移。首先，用迁移缓冲液将游离态或颗粒结合态的SDF1α进行三倍系列稀释，得到文本方案中列出的最终浓度。取0.6毫升稀释后的SDF1α溶液加入24孔板中的一个孔，作为阴性对照。

对迁移缓冲液进行同样操作，然后向输入细胞对照孔中加入0.57毫升迁移缓冲液。将培养板在37摄氏度下孵育30分钟。然后将可渗透的细胞培养小室（如Transwell）放置在下层孔的上方，并向Transwell小室内加入0.1毫升Jurkat细胞。

然后将0.03毫升的细胞直接加入到输入细胞控件中。将培养板置于含5%二氧化碳的培养箱中，在37摄氏度下孵育2小时。孵育结束后，移除细胞培养小室。

将迁移至下层孔中的细胞转移至一个4毫升的聚苯乙烯管中。使用流式细胞仪对迁移的细胞进行计数。最后，扣除阴性对照组的细胞数后，根据初始细胞数量计算迁移率的百分比。

图中显示的是 SD F1 alpha 右旋糖酐硫酸酯 ozan 粒径测量的分析结果。CUMUL 结果显示，该颗粒的流体动力学直径为 671 纳米，多分散系数为 0.24。此截图展示了 SD F1 alpha DExT 链硫酸酯 ozan 颗粒的五次重复测量中的一次 zeta 电位测量结果。

Zeta电位为-24.7毫伏。通过SDS凝胶电泳法估测S df1 alpha在S df1 alpha-右旋糖酐硫酸酯ozan颗粒中的含量。图中显示的是考马斯亮蓝染色的SDS凝胶，加样内容包括SD F1 alpha标准品、右旋糖酐硫酸酯kaizan对照纳米颗粒以及SD F1 alpha-右旋糖酐硫酸酯kaizan纳米颗粒样品。

通过分析SD F1 Alpha标准品条带的密度，并根据标准曲线进行计算，结果表明SDF1α纳米颗粒样品中SDF1α的浓度为0.03毫克/毫升。为确定SDF1α从纳米颗粒中的体外释放速率，采用考马斯亮蓝染色SDS凝胶后结合流式细胞术分析，分别测定上清液中释放的SDF1α含量以及沉淀中颗粒结合的SDF1α含量。颗粒结合型SDF1α的活性通过细胞迁移实验进行检测，并与游离SDF1α的活性进行比较，结果如图所示。

在所有测定的浓度下，与颗粒结合的SDF-1α诱导的迁移程度与游离SDF-1α相同。在进行该操作时，需注意糖蛋白颗粒的配方可以进行调整。根据具体应用需求，可引入其他蛋白质，并可采用不同的配方以调节颗粒大小。

我们希望本视频已展示了收集纳米颗粒并对其进行所掺入的SDF-1α功能分析的基本技术。