细菌表面电位测量用开尔文探针力显微镜
2014年11月28日
在这里，我们提出了一个协议，解释了使用开尔文探针力显微镜作为生成高分辨率纳米级表面电位图的工具。该工具用于评估表面电位对微生物与基材表面结合能力的作用。
以下实验的总体目标是观察粘附在不同材料基材上后细胞膜电荷的变化。这是通过在营养丰富的培养基中培养微生物以增加其数量来实现的。接下来，对微生物将粘附的材料表面进行清洁和功能化处理，以实现最佳的微生物附着率。
然后将微生物接种在各种材料基材上，以进行开尔文探针力显微镜检查或 KPFM 成像。结果表明，材料基材类型及其固有电荷对细胞活性有影响，从细胞膜电荷和细胞粘附的变化可以看出。与电泳、光散射和等电点测定等现有方法相比，该技术的主要优点是 KPFM 允许检查单个细胞和生物膜的电荷，而不是整个培养物或菌落的电荷。
当想要以高精度和精密度比较细胞间以及生物膜的电特性时，这是有益的。首先，准备 5% 羊血琼脂板，将 MRSA 细菌划线到准备好的板上，并在 24 摄氏度下孵育 37 小时，以产生单孔分离的菌落。制作 500 毫升三联酱油汤，补充有 1% 葡萄糖和 0.1% 氯化钠高压灭菌器，以及两个干净的玻璃试管和一盒一毫升移液器小口。
让培养基和试管在生物安全柜下或面包和燃烧器附近冷却后，将 6 毫升 TSB 移液到每个试管中。使用先前制备的绵羊血琼脂平板之一，将 MRSA 的单个菌落接种到其中一个试管中。使用第二根试管作为阴性对照，以确保无菌，将试管在倒易培养箱中以 37 摄氏度和 200 RPM 孵育 24 小时。
MRSA 试管应显示生长或对照试管中不应生长任何内容。接下来，使用 24 小时培养物中的 1 毫升接种 6 毫升新鲜胰蛋白酶大豆汤，并在 37 摄氏度和 200 RPM 下再孵育 6 小时，从而创建传代培养物。然后将 1 毫升培养物移液到 afus 管中，以 850 倍 G 离心 3 分钟。
取出滑囊，用惯用手的镊子用去离子水清洗沉淀两次。拿着一个 20 毫米的不锈钢 FM 样品盘，用 5 毫升的去离子水清洁每一面。将干净的圆盘放入装有去离子水的烧杯中，超声处理后超声处理 1 分钟。
使用镊子从烧杯中取出样品盘，并将它们以大约 60 度角靠在纸巾上打开的培养皿的边缘要完全干燥，请使用培养皿的盖子盖住干燥盘。干燥后，将圆盘转移到培养皿中，以使圆盘表面功能化。将 200 至 400 微升 0.1% 多元醇赖氨酸移液到生物安全柜中的圆盘上，并使用镊子固定圆盘，在室温下孵育 1 小时。
使用去离子水清洗它们，如本视频前面所示。下一个板，将 200 至 400 微升重悬的细胞（已洗涤两次）放在涂层样品盘上。在室温下孵育 30 分钟后，轻轻使用 1 毫升去离子水清洗光盘。
在成像前让圆盘干燥过夜，以进行 Kelvin Probe Force 显微镜成像。打开计算机以及原子力显微镜或 AFM、HEB 和 MAC 三个控制器。打开 A FM 成像软件，例如 Ulence P ovu 概述。
选择 A-C-A-F-M 或正确的名称，以便在间歇接触模式下成像。用惯用手拿 FM 镊子，另一只手打开弹簧夹支架，小心地将 A-K-P-F-M 悬臂伸入头件。小心地将头件装入 A FM 并连接激光灯和舞台升降电机线。
然后将激光器对准悬臂的尖端。将激光器对准悬臂的尖端。将前后旋钮顺时针旋转几次，以将激光器移动到悬臂芯片顶部。
当激光到达芯片时，它将被阻挡，不再可见。然后逆时针旋转前后旋钮，直到激光点再次出现。激光器现在位于芯片的边缘。
从左向右旋转旋钮，将激光器定位在悬臂上。当激光穿过悬臂时，它会迅速连续地消失并重新出现。激光光斑应在稍后放置半导体光电管装置的磨砂玻璃盖上可见。
逆时针旋转从前到后的旋钮，将点沿着悬臂向下移动到尖端，直到磨砂玻璃上的点消失。现在只需稍微顺时针旋转从前到后的旋钮，以便定位激光器，使其刚好位于悬臂尖端，激光光斑将重新出现在磨砂玻璃上。激光器对准后，将载物台升降电机保持在打开位置 10 秒钟，以确保悬臂和样品之间有足够的空间。
将样品连接到 A FM 时，现在将样品放在 KPFM 载物台上。使用铜线将样品接地，并将适当的电线从 A FM 连接到样品台。然后将舞台连接到 A FM 软件中的 A FM。
确保设置时间不超过 10 毫秒，并且接近速度不超过每秒 2 微米。为避免尖端损坏，然后调整悬臂并开始将悬臂尖端移向样品。一旦悬臂尖端到达样品表面，选择成像窗口大小和理想的成像区域，优化眼增益和 P 增益以及悬臂设定点，从而优化形貌成像。
优化地形成像后，在 FM 模式下打开 KPFM 模块。将成像窗口设置为 5 微米 x 5 微米，分辨率为 5 12 x 5 12 或较慢的扫描速度。对于 FM KPFM 设置，将驱动器设置在 5% 到 10% 之间将驱动频率设置为 1 到 5 kHz 之间，带宽为 2 kHz。
将 F-M-K-P-F-M 的铁 NP 增益设置为 0.3%获取 KPFM 图像后，使用后成像处理软件分析图像并使用本视频演示中概述的设置收集 SP 数据。KPFM 图像是在不锈钢和金表面上的 15 个 MRSA 细胞上拍摄的。此处显示的是收集的图像类型。
由于 KPFM 使用双频率运行，因此可以同时收集细胞表面的地形图像和电数据。将热过滤器应用于表面电位图，以便更容易地识别表面电位的微小变化。在此图中，分析图像以确定微生物膜表面电位，然后用于比较不同基材上的生长情况。
裸露不锈钢和裸金基材的表面电位扫描显示整体表面电位为负。多元醇赖氨酸涂层不锈钢和金盘都表现出向正表面电位的转变。MRSA 细胞膜电位在不锈钢和金表面之间变化。
与金衬底上的 MRSA 细胞相比，不锈钢对细胞表现出明显更大的正膜表面电位，而金衬底上的 MRSA 细胞显示出负表面电位。为了演示 KPFM 的全部功能，这里显示了不锈钢上 MRSA 的台阶高度图示例。这显示了基材表面和微生物膜之间的表面电位差异。
观看此视频后，您应该对如何使用开尔文探针力显微镜来检查电荷对不同材料基材表面微生物细胞粘附和活动的影响有很好的了解。
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概述
本研究提出了一种使用开尔文探针力显微镜（KPFM）创建高分辨率纳米尺度表面电位图的协议。该技术被应用于研究表面电位如何影响微生物对各种基底表面的结合能力。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 微生物学
- 表面科学
背景
- 微生物对不同材料基底的附着力不同。
- 表面电位在微生物附着中起着关键作用。
- 传统方法评估的是体积属性而不是单个细胞特性。
- KPFM提供了单个细胞和生物膜电荷的见解。
研究目的
- 观察细胞在附着于不同基底后膜电荷的变化。
- 评估基底电荷对微生物附着速率的影响。
- 展示KPFM相对于现有方法的优势。
使用的方法
- 在富含营养的培养基中培养微生物。
- 清洁和功能化材料表面以获得最佳附着。
- 将微生物接种在各种基底上。
- 使用KPFM进行细胞膜电荷的成像和分析。
主要结果
- 材料基底类型影响细胞活性和附着力。
- 细胞膜电荷的变化与基底特性相关。
- KPFM允许对单个细胞特性进行详细检查。
- 该技术在特异性方面优于传统方法。
结论
- KPFM是研究微生物与表面相互作用的强大工具。
- 理解表面电位可以为更好的微生物粘附材料设计提供信息。
- 这种方法增强了我们在纳米尺度上研究微生物行为的能力。
常见问题
Executive Industry Relevance
Kelvin probe force microscopy (KPFM) enables nanoscale measurement of microbial membrane surface potential, providing critical insights into electrostatic interactions that govern bacterial adhesion to biomaterials. This capability supports target validation in anti-infective development by de-risking mechanistic hypotheses about surface-mediated pathogenesis. The technique offers predictive value for screening antimicrobial coatings and implant materials by quantifying cell-surface charge dynamics at single-cell resolution.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses linking microbial membrane charge to adhesion mechanisms on medically relevant surfaces.
- Operational Value: Enables functional target validation by correlating surface potential changes with cellular metabolism and motility phenotypes.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by identifying surface properties that modulate pathogenic biofilm formation.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream antimicrobial screening by mapping surface potential heterogeneity.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible quantitative outputs for assay optimization across material substrates.
- Scalability: Facilitates platform reuse for evaluating lead compounds against adhesion-resistant strains.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery-stage surface potential metrics to preclinical validation of anti-adhesion therapeutics.
- Risk-Adjusted Decisions: Informs advancement criteria by linking membrane charge shifts to reduced biofilm burden on implant materials.
- Mechanistic De-risking: Focuses on predictive de-risking of surface-targeted interventions through nanoscale charge mapping.
Pipeline & Workflow Integration
KPFM integrates into the discovery continuum from target hypothesis testing through lead identification to preclinical efficacy assessment, particularly for anti-infective programs targeting microbial adhesion.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of charge-mediated adhesion pathways and biological de-risking of surface targets.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized surface potential mapping and topographical correlation.
- Analytics: Provides quantitative surface potential readouts and step-height graphs that enable condition comparison and hit selection.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by linking membrane potential changes to reduced adherence on functionalized surfaces.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable capability for screening material libraries and compound effects on microbial electrostatic interactions.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation, reduction of mechanistic ambiguity in adhesion mechanisms.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of single-cell electrostatic measurements.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions on antimicrobial coatings, capital efficiency in biomaterial screening, reduced late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization of leads based on surface charge modulation efficacy.
Implementation Considerations
- Requires expertise in atomic force microscopy, KPFM operation, and nanoscale electrical data interpretation.
- Dependent on AFM instrumentation with KPFM module, conductive probes, and vibration isolation for stable measurements.
- Necessitates cross-team standardization of sample preparation, substrate functionalization, and environmental controls.
- Involves adaptation considerations for varying microbial strains, biofilm states, and substrate material properties.
- Practical limitations include sample dehydration artifacts and the need for conductive substrate coating for non-conductive materials.
