人和小鼠侧脑室的三维建模及室周组织的组织学表征

以下实验方案的总体目标是提供一种研究心室扩大原因与效应的方法，并突出展示可用于研究脑室系统健康状况及其在大脑中重要屏障和过滤功能的技术。该目标通过采集小鼠脑的冠状切片或人脑的 MRI 扫描图像，进而对脑室进行三维重建并计算脑室容积来实现。随后，对包含脑室顶面完整制备的死后组织样本进行细胞特异性抗体染色，以揭示脑室衬层的细胞完整性。接着，制备覆盖整个脑室表面的细胞结构拼接图像，并将其叠加至脑室的三维模型上，以展示胶质增生区域与完整纤毛细胞区域的分布情况。

结果表明，基于脑室的纵向三维建模，可观察到脑室扩张的区域，以及脑室衬层的附随热细胞层不再完整、而被胶质瘢痕所取代的区域。通过将三维建模数据与免疫组织化学数据相结合，可生成脑室衬层细胞组成的三维区域特异性图谱。该技术的应用前景涵盖脑损伤、神经退行性疾病（如阿尔茨海默病）以及正常衰老的治疗或诊断，这些病理状态通常均表现出一定程度的脑室扩张，因而可能伴随脑室表面脊柱畸形。

演示小鼠实验操作的是来自我们实验室的理查德·沃尔弗（Richard Wolffer）和一名本科生；使用人类 MRI 数据和死后人脑组织进行的操作将由叶云（Yeun）演示，她目前是一名医学生，以及实验室的研究生蔡瑞贝卡（Rebecca Chu）。按照方案书面部分所述，通过固定、切片、免疫染色和封片等步骤制备待成像的小鼠脑切片。开始操作时，为追踪小鼠侧脑室，打开直立式荧光显微镜及计算机，显微镜应配备自动载物台和数字 CCD 相机。

启动荧光模式下的成像软件，打开显示选项以加载用于追踪所需的工具栏和泊坞面板。接着点击选项，选择显示选项附件，并在同一菜单中选中主工具栏和标记工具栏。在泊坞面板中，选择相机直方图、多通道控制、相机设置和图像采集。

根据标记附着细胞的强 S100β 荧光来确定包含侧脑室的第一块组织，该荧光沿侧脑室壁分布。通过识别切片过程中造成的小切口来确定左半球和右半球的方向。

现在创建一个新的数据文件，并通过在图像窗口中侧脑室左侧上方点击来设定一个用于移动载物台的参考点。在不同轮廓文件之间，保持该参考点相对于侧脑室的位置一致。为便于导入轮廓进行连续重建，请从轮廓下拉菜单中选择合适的预设轮廓类型。

为左侧和右侧侧脑室的每条描记线使用不同的颜色。现在，沿着心房内衬的整个顶面点击，以描记脑室的轮廓。使用方向键移动描记窗口。

描记轮廓后，单击右键并选择闭合轮廓。使用不同颜色对右心室进行同样的描记。接下来，从左侧的标记工具栏中选择合适的标记，然后在描记屏幕上沿中线点击以放置标记，以辅助对齐连续的轮廓，用于三维重建。

重复此步骤以制作第二个标记。通过选择“文件”中的“另存数据文件为”，创建一个新文件夹并命名文件，根据连续切片的标记惯例，将轨迹文件编号为切片编号-组织编号，以便于识别连续切片中的轨迹。然后对所有包含脑室的切片重复上述操作。

进行侧脑室的三维重建。打开三维重建程序，然后点击文件打开，选择第一个连续切片的轮廓文件。

导入左心室和右心室的所有轮廓描记，以及任何添加的标记。根据方案文字部分的说明对轮廓进行对齐。然后在左侧面板中选择所有轮廓，再点击3D可视化按钮，以显示最终的3D重建结果。

该图像显示了包含侧脑室的冠状面小鼠脑切片，侧脑室由S100β免疫反应性附属细胞勾勒出轮廓。星号指示侧脑室位置，方括号标示黏附区域，比例尺代表500微米。

小鼠侧脑室被勾画为轮廓，并按子段区域进行排列。脑室内区域被剔除，以避免对体积分析造成干扰。该图像显示了侧脑室轮廓的最终三维重建结果。

黄色表示包含侧脑室的目标区域的全脑体积轮廓。您应充分掌握如何对冠状面切片的脑组织进行三维脑室重建。以下列出了创建侧脑室三维图像重建和体积定量，以及通过纵向叠加分析评估随时间变化的体积改变的实验方案。需要注意的是，磁共振（MR）数据采集的一致性以及采集后处理的一致性是数据集纳入的极为重要的标准。为进行脑室分割，需使用 ITK-SNAP 软件从高分辨率 T1 加权磁共振图像中分割脑室。启动程序后，打开灰度图像，选择所需文件，并以 NIfTI 文件格式打开。

然后依次浏览每个解剖平面，观察心室异常情况，例如鼻部区域、扩大或缩小的颞角等。接下来，在主工具箱中点击蛇形 ROI 工具。随后进行三维分割，并选择强度区域选项。

现在点击预处理图像并选择上述选项。使用滑动条记录最大强度值。然后将阈值设为最大强度的15%，并记录该数值。

这应以白色突出显示感兴趣区域。将平滑度参数设置为10。单击确定。

接着，在每个脑室中加入10到12个小型2号气泡：前额角2个，侧脑室体部上表面均匀分布7个，枕角1个，侧脑室颞角1个。

接下来，选择参数并将曲率力设置为 0.4。然后点击播放符号以开始主动轮廓演化。现在点击更新网格以可视化表面。

然后检查自动更新。当侧脑室的所有区域均已被包含在感兴趣区域内时，停止分割过程。避免将第三脑室包含在内。

最后，单击完成并将分割结果保存为 nifty 文件格式。为获得总脑室体积，请选择分割、体积和统计功能，使用设定的颜色标签获取脑室的总体积。在本部分中，使用 mango 软件叠加纵向 ROI，以对受试者随时间推移的脑室体积变化进行定性和定量展示。

打开软件后，点击“打开”，加载先前保存的 nifty 文件。图像文件加载完成后，点击“文件”→“加载 ROI”，将基线 ROI 时间点的 ROI 加载为绿色。再次点击“文件”→“加载 ROI”，将第二个 ROI 时间点的 ROI 加载为红色。

通过选择“文件保存ROI”来保存纵向叠加图像，并根据屏幕上显示的命名规范为每个图像分配文件名。接下来，打开ITK-SNAP，然后重新打开组合的ROI作为灰度图像，通过选择“分割”→“从图像加载”→“组合ROI文件”，以获取纵向体积数据，随后运行以下分割体积及统计分析。

标记一：红色代表扩张体积，标记二：绿色代表狭窄体积，标记三：蓝色代表基础体积。从一个完整的半球开始，该半球已用10%福尔马林固定，固定时间最长为六周，并用0.1摩尔PBS充分冲洗，使用大刀具沿冠状面切取整个半球厚度为1.5厘米的切片，再用显微外科手术刀进行修整。从脑室壁向内解剖深度达1厘米，保持外侧壁完整连续的一整片，并根据需要将脑室壁进一步细分，以获得适合染色的适当大小的组织片。在脑室壁对侧做一缺口标记。

为了确定上-下方位，按照书面方案进行免疫组织化学染色并封片。在解剖显微镜下，使用针固定组织，并用显微外科刺刀刀片切取侧脑室壁的均匀薄片，将软脑膜面朝上置于载玻片上。待载玻片完全干燥后，通过免疫荧光共聚焦显微镜观察切片。根据β-catenin（一种顶端黏附标志物）的定位，将成像焦平面设定在脑室表面。

附属细胞的连接蛋白。然后根据脑室表面GFAP染色结果，界定附属细胞覆盖区域及表面星形胶质细胞增生的范围，以记录并拼接整个脑室表面。采用覆盖整个表面的重叠图像，生成一系列图像的拼接图。

打开 Adobe Photoshop，使用文件自动合并（Automate Auto-Align）交互式布局功能选择需要叠加的图像，并根据需要进行手动调整。创建一个新图层用于勾画拼贴图像，以生成完整结构的示意图。依据细胞覆盖范围或脑室表面的 G 型脊柱侧弯情况，整合所有切片以重建脑室壁的分布图，并将其与 MRI 重建图像上的相应区域进行关联。

这是人类磁共振图像的组合。侧脑室被定义为红色标注的兴趣区域。如图所示的三维图像重建，可实现对侧脑室的体积定量和定性可视化。

此图像显示了一位老年患者脑室纵向扩张的评估结果。通过将多个时间点的纵向磁共振成像进行配准和叠加，可以直观地观察并量化同一受试者随时间推移的脑室容积扩张情况。最后这三幅图像展示了人脑侧脑室表面的免疫组织化学评估及区域定位图。此处。

由β-catenin染色标记的完整附着细胞区域呈现铺路石样外观，如星号所示，并通过虚线与GFAP染色标记的脑室表面星形胶质细胞增生区域分隔开来。连续的共聚焦图像叠加形成区域镶嵌图，并使用Adobe Photoshop绘制，或以示意图形式展示脑室表面的细胞排列结构。该镶嵌图的示意图被映射至相应MRI基础上的三维脑室重建模型的脑室表面。

如图所示，绿色表示完整的附着物，红色区域表示胶质增生。在执行该操作过程中，重要的是要仔细记录每个组织样本，以便进行连续重建和细胞完整性的定位分析。在完成该操作后，可进一步采用其他方法，例如对侧脑室进行亚区划分，以回答有关特定区域随时间推移发生扩张的其他问题。