现代树轮研究的技术视角——如何应对树木生态学与木材解剖学挑战

以下实验的总体目标是获得重复性良好且分辨率高的木材样本，以建立解剖学数据集，用于研究时间及环境因素对树木和灌木生长的影响。该目标通过使用非牛顿流体在切片过程中稳定植物细胞来实现，从而在第二步中能够对样本进行详细的显微分析。

通过双重染色微切片以区分木质化和非木质化细胞，然后对样品进行数字成像。最终可进行基于细胞的自动化分析及相关的时序分析，从而评估目标木材解剖参数。该技术相较于现有方法的主要优势在于，传统方法中样品常被锯末填充，而本技术避免了这一问题，从而获得更清晰、质量更高的样品，便于图像分析。

此外，在切片过程中向细胞中添加非牛顿流体，可避免耗时的石蜡包埋样本技术。我们将在视频中看到的新型切片机由我们实验室与苏黎世Shang Dubs和中央Lu Netti合作开发。这些切片机因其导引系统的高稳定性而突出，可实现对大而致密样本的切割。

用于树木茎干的钻芯取样。首先将 sharpened increment core 垂直于树干的生长轴放置。然后旋转钻取，并使用提取器从树干中取出所获得的芯样。

用软铅笔在样本表面标记特定编号以标识核心样本，并在采集完所有样品后，于茎的另一侧重复此操作。将标记好的核心样本存放在合适的容器中，以防止运输过程中受损。返回实验室后，使用防水木胶将核心样本按纤维方向垂直固定在木制支撑梁上，待其干燥后用于显微取样。

首先，根据需要使用凿子去除部分树皮。然后将特制的取样钻垂直于茎的生长轴放置在茎上，如前所示，并用锤子将钻头穿透茎的木质部，深度约两厘米。旋转取样钻，使钻头内部形成的微小芯样断裂。

然后从茎中取出髓心，并将其存放在已标记的微量离心管中。为了在髓心样本上切出平整的表面，首先将感兴趣的增量髓心固定在新开发的髓心切片机的髓心夹持器中，以便在整个髓心范围内切割平面表面。接着抬起髓心，直至其轻微接触刀片；该刀片固定在球轴承导轨上，覆盖髓心的整个范围，然后拉动刀片以切去髓心顶部的第一部分。

接着，将刀片推至核心后方。将样品台提升约10微米，重复切割步骤，直至核心直径的约三分之一被切削，形成一个连续的平面表面。

为了对样本的解剖结构进行详细的图像分析，需使用另一种类型的切片机制备微切片。首先，将感兴趣的岩心样本固定在切片机的样本夹持器中。然后，在滚珠轴承导向系统的引导下定位切片刀，并将刀片沿岩心拉过。

向后推动刀片，将样本抬高20至30微米。然后将刀片拉过样本表面。重复此过程，直至在样本顶部形成连续的表面。

现在使用画笔，将玉米淀粉溶液涂覆在制备好的表面上。然后将样品提升15微米，将画笔置于样品表面。缓慢将刀片向样品方向拉动，在画笔下方开始进行薄切，并用画笔引导切片在刀片表面移动，直至整个切片完全切下。

使用另一支毛笔和水将组织从刀片上移除，并将其放置在载玻片上，以便区分木质化与非木质化结构。用移液管吸取水洗去甘油。接着，在湿润的切片上滴加数滴藏红与亚甲蓝混合染液进行覆盖。

五分钟后，用水洗去染料，然后立即用连续的乙醇处理对切片进行脱水。乙醇脱水处理后，用100%二甲苯反复冲洗切片，直至二甲苯保持透明。

用一滴100%加拿大树胶覆盖组织，并加盖盖玻片，注意避免产生气泡。然后将制备好的载玻片置于两条耐热塑料条之间，并放置在金属板上。在载玻片上方放置重物以保持切片平整，随后将载玻片放入60°C的烘箱中。

12小时后，让载玻片冷却至室温，然后取下重物和塑料条。最后，使用剃刀片清理载玻片，去除多余的树胶，随后按照此前介绍的切片和染色步骤进行操作，即可制备各种不同大小和形态的样品；也可使用特殊夹具对样品进行处理，以获取用于导管分析的芯样表面数字图像。首先，如前所述用芯样切片机切割芯样表面平面，然后用记号笔将所得表面染成黑色。

染料干燥后，用白粉笔擦拭岩心表面，再用手指将粉笔末压入细胞孔隙中。清除多余的粉笔末，然后将岩心置于配备有数字相机的双目显微镜载物台上，从岩心一端开始。随后连续拍摄一系列轻微重叠的图像，直至完整覆盖整个表面。

然后将单张图像拼接在一起，以生成岩心表面的完整图像，从而从显微玻片创建数字图像。将玻片放置在显微镜载物台上，并根据待分析结构选择合适的放大倍数。最后，采集固定在已清洁的显微玻片上的切片重叠图像（如同前面对岩心表面样品所演示的那样），并将这些图像拼接成一张完整的切片图像。

具有开放细胞的能力是将解剖学上的树轮生态结构应用于时间序列分析的第一步。为了对针叶树的早材或晚材导管进行更详细的分析，需要制备高质量的显微切片。应避免出现细胞壁破裂等潜在的人工假象。

将非牛顿流体（如上文演示的玉米淀粉溶液）应用于样品，有助于维持细胞结构的稳定性。显微切片能够更可靠地确定年轮数量，这一点对于生长在其自然分布边缘的针叶树尤其适用。

如图所示，极窄的年轮经常出现，但在宏观上难以检测。在极端情况下，年轮仅由一至两列细胞组成，可能只有在使用显微切片时才能观察到。在高倍放大下分析图像时，可观察到单个细胞。

半自动分析软件可测定图像中所有可见年轮的单一参数（如细胞壁厚度）的变化，从而揭示进行扩展时间序列分析的必要性。对显微切片进行双重染色，可实现木质化不同阶段的可视化观察。随后可将这些信息与相应生长季的环境数据进行关联，以在发育完成后确定更详细的气候-生长关系。

该技术为从事DRO生态学研究的科研人员探索树木和灌木的各种解剖学参数提供了可能。使用该方法可显著缩短制备大尺寸、高质量切片所需的时间。在操作过程中，应始终采取预防措施，例如在通风橱下操作并佩戴手套。

观看本视频后，您应能够充分理解如何生成具有良好重复性和高分辨率的解剖学数据集，以支持时间序列分析。