Name: 现代树轮研究技术的角度 - 如何克服Dendroecological和木解剖挑战 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 33 s
Description: 学习现代树木年轮采样与显微切片技术，利用非牛顿流体稳定植物细胞并进行双重染色，以生成高分辨率木材解剖数据集，用于分析树木生长与环境因子的关系。

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作者谨此感谢 Sandro Lucchinetti（Schenkung Dapples，苏黎世）在构建样品制备所需装置方面所付出的努力，这些装置对保障实验进展至关重要。

1. 采样技术
<ol>
	<li>钻芯取样
	<ol>
		<li>为采集树干样本，使用生长锥从每棵树木的树干中至少提取两个钻芯样本，以分析其生长发育情况。根据研究任务的不同调整取样位置，例如，在常规气候重建研究中，应沿坡向平行方向取芯。在处理热带树种时，应至少采集三个或更多的钻芯样本。</li>
		<li>使用 sharpened 生长锥（直径为 5、10 或 12 mm），并将生长锥垂直于树干的生长轴放置。 
		注意：为确保生长锥位置稳定可控，建议使用推杆，以避免钻入树木时除旋转外的其他移动。将生长锥钻入树干，直至穿过髓心。对于木材密度极高的树种（即热带树种），可使用经特殊改装的链锯机身配合生长锥适配器，以便对如 Diospyrus ebenum （乌木）等高密度木材进行钻芯。</li>
		<li>使用取出器将获得的钻芯从树干中取出。反转并拔出生长锥。</li>
		<li>使用软铅笔在胶带上书写特定编号，并将胶带直接贴在钻芯上，为提取的钻芯标记唯一标识。在树干的对侧重复此操作。</li>
		<li>将同一棵树的两个样本分别存放于塑料管、纸管或专用盒中，以防损坏。 
		注意：在热带环境中，使用纸管尤为有利，因其可防止钻芯发霉。</li>
		<li>最后，将钻芯（纤维方向竖直）固定在木质支撑梁上。使用耐冷水的木工胶粘合，并使其自然干燥。 
		注意：若研究目的包括后续的化学、同位素或密度分析，则切勿将钻芯固定在木质支撑物上。对于此类用途，应将钻芯固定在敞开的电缆槽或单面波纹纸板中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>微钻芯取样
	<ol>
		<li>使用特制冲孔装置或针头（开口为 2 mm）。根据树皮厚度，使用凿子去除必要部分的树皮。</li>
		<li>如上所述，将装置垂直于树干生长轴放置，并用锤子将其打入木质部，深度约 2 cm。</li>
		<li>旋转针头，使形成的微钻芯在工具内部断裂，然后将其从树干中取出。将微钻芯存放在微量离心管中并做好标记。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>圆盘取样
	<ol>
		<li>在特殊情况下（尤其是在热带地区），例如采集树桩或倒伏树木样本时，或在条件允许的情况下，使用链锯截取圆盘样本（即垂直于生长轴的横截面）。直接对圆盘进行标记并妥善保存，以备后续分析。 
		注意：该取样方法通常用于所有枯死干燥木材、历史样本、考古材料、亚化石材料，以及因木材密度过高而无法使用生长锥采集的硬木样本。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 样品制备
<ol>
	<li>砂纸
	<ol>
		<li>将圆盘安装在砂轮机上，使用粒度逐渐变细的磨料对表面进行研磨，依次使用80目、120目、220目和300目的砂纸。对于大多数针叶树，最后用400目砂纸抛光即可。对于硬木尤其是热带树种，应使用最高达1200目的砂纸，以便清晰分辨年轮边界。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>对钻取的木材样本芯进行平面切割
	<ol>
		<li>将生长锥钻取的样本芯固定在新开发的样本微切片机的夹持器中，使其在整个样本长度上切出平整的平面。 
		注意：调整样本芯在夹持器中的方向，使样本的纤维方向保持垂直，即与切片机刀片成直角。</li>
		<li>将样本芯向上抬升，直至轻微接触刀片。拉动固定在滚珠导轨上的刀片，使其沿样本全长移动，切去顶部的一小部分。</li>
		<li>将刀片推回样本后方，将带有样本的样本台向上抬升约10 µm，重复切割操作。重复此过程，直至样本直径约三分之一被切削，形成连续的平整表面。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过添加玉米淀粉溶液制备显微切片
	<ol>
		<li>为进行详细的解剖结构图像分析，将样本芯或从圆盘上分离的其他样本固定在切片机的夹持器中。将新开发的滑动式切片机的刀片（由滚珠导轨引导）置于样本上边缘，然后向前拉动完成切削。</li>
		<li>将刀片退回，将样本向上抬升约20至30 µm，再次拉动刀片通过样本。重复此操作，直至在样本表面形成连续的平整切面。</li>
		<li>用普通毛刷将玉米淀粉溶液（10 g玉米淀粉、8 ml水和7 g 100%甘油）均匀涂布于所得表面。 
		注意：淀粉颗粒可填充样本中的开放细胞，从而在后续薄切片过程中稳定其结构。</li>
		<li>将样本抬升15 µm，在样本表面放置毛刷，缓慢将刀片向样本方向拉动，开始切下薄切片（位于毛刷下方）。在切割过程中，生成的切片在毛刷引导下沿刀片滑动。</li>
		<li>当整个切片完成后，用毛刷和水（以减少摩擦）将显微切片从刀片上取下，并将其转移至载玻片上进行后续处理。为防止切片干燥，可用少量甘油（33% = 一份100%甘油加两份水）覆盖。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 微型载玻片的制备
<ol>
	<li>在制备永久切片之前，首先用移液管和水将甘油从显微切片上冲洗掉。</li>
	<li>在湿润的切片上滴加数滴藏红（1 g 藏红粉末 + 100 ml 水）和阿斯特拉蓝（0.5 g 阿斯特拉蓝粉末 + 2 ml 100% 乙酸 + 100 ml 水），以区分木质化与非木质化结构，同时增强后续图像分析的对比度。</li>
	<li>让切片在染液中染色5分钟，然后再次用移液管和水将染液冲洗干净。</li>
	<li>一旦多余的染液被去除，即使用移液管依次用75%、96%和最终100%的乙醇对切片进行脱水处理。</li>
	<li>使用移液管直接在载玻片上的样品上进行冲洗，而不是将样品浸入染色缸中，以将整个脱水过程的时间缩短至约2到3分钟。 
	注意：乙醇脱水可防止脆弱样品破裂。</li>
	<li>随后用100%二甲苯冲洗切片。 
	注意：二甲苯具有致癌性，使用时实验室必须保证通风。虽然存在可替代二甲苯的其他产品，但如果计划长期（数年甚至数十年）保存样品以备将来重新分析，则只有加拿大树胶（见步骤3.5.2）作为封片介质能够长时间保持透明且不发生颜色变化。遗憾的是，加拿大树胶必须与二甲苯配合使用。</li>
	<li>只要二甲苯呈现乳白色（浑浊），就需重复脱水步骤，表明脱水尚未完全。</li>
	<li>一旦二甲苯保持清澈，立即在切片上滴加一滴100%加拿大树胶，并加盖盖玻片，盖玻片尺寸应至少覆盖整个切片区域。 
	注意：应轻轻按压盖玻片，注意排除气泡。</li>
	<li>将制好的显微切片置于两条耐热塑料条之间，并放置在金属板上。在切片上方放置一个重物（例如，磁铁），以压平切片，确保其在后续干燥过程中保持平整。</li>
	<li>将切片放入60 °C的烘箱中约12小时。12小时后，将切片从烘箱中取出并置于架上，使其冷却至室温（约20 °C）。冷却后，取下重物和塑料条，并使用剃刀片清洁载玻片，去除多余的加拿大树胶。</li>
</ol>
4. 观察细胞内容物
<ol>
	<li>制备Nawashin溶液25。
	<ol>
		<li>配制溶液A：称取5 g铬酸，加入50 ml 96%乙酸和320 ml去离子水。另配制溶液B：取200 ml甲醛溶液与175 ml去离子水混合。</li>
		<li>将溶液A与溶液B按1:1体积比混合，得到Nawashin溶液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>为观察细胞内容物，用Nawashin溶液固定样品10分钟&#160;，以终止细胞内所有降解过程。 
	注意：固定可保存细胞核结构，从而评估细胞存活性（细胞存活性 = 核存在 / 核缺失；细胞核的存在或缺失可指示细胞是否存活）。</li>
	<li>固定后，用清水彻底清洗切片，完全去除Nawashin溶液，随后用番红-固绿染色，再用苦味酸-苯胺蓝进行复染（1份饱和水溶性苯胺蓝与4份10%苦味酸混合）。</li>
	<li>小心加热样品至约80 °C（务必低于沸点），以加快染色过程。样品的脱水与包埋步骤请参照第3.4至3.8步的实验方案。</li>
</ol>
5. 准备解剖特征的数字图像
<ol>
	<li>创建岩心表面的数字图像以进行导管分析。
	<ol>
		<li>使用岩心切片机切割岩心表面平面，并用记号笔将所得表面染成黑色。</li>
		<li>染料干燥后，立即用白粉笔擦拭岩心表面。用手指在表面来回摩擦，使粉笔灰渗入细胞腔内，同时去除多余的粉笔灰。 
		注意：结果应使细胞壁呈黑色，导管腔部分呈白色。这种对比度是实现自动图像分析的前提条件。</li>
		<li>将制备好的岩心置于配备数码相机的双目显微镜下。从岩心的一侧开始，拍摄一系列轻微重叠（约10%）的图像，直至覆盖整个表面。将各张单幅图像拼接，生成完整的岩心表面图像。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>从显微切片创建数字图像
	<ol>
		<li>将清洁后的显微切片置于显微镜下，对整个切片区域拍摄重叠图像。</li>
		<li>根据待分析结构的具体情况，选择适当的放大倍数，通常在40X至1,000X之间。</li>
		<li>将单幅图像拼接成一幅完整的切片图像。为避免拼接过程中可能出现的畸变，显微镜应使用“平场”型物镜。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. 解剖学特征的量化
<ol>
	<li>使用图像分析工具 ROXAS18 或类似软件检测细胞和环状边界时，加载显微切片的完整图像及对应的空间校准信息，以获得以公制单位表示的定量结果。通过测量在相同放大倍数下拍摄的显微测微尺图像中刻度之间的像素数量，并将该数值除以刻度间距（以公制单位表示，例如 1,000 µm），计算空间校准值。</li>
	<li>在开始分析的自动部分之前，从软件提供的列表中选择合适的配置。 
	注意：配置是一组先前已优化的程序设置，例如可考虑样本的染色颜色以及待检测细胞的大小和形状范围。因此，定制化的配置能够针对不同物种和图像质量生成最佳的识别结果。
	<ol>
		<li>根据需要，选择其他选项，例如指定图像中应包含或排除的区域，以避免例如空白图像边缘或样本中的裂纹。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>点击“分析”按钮开始分析。如已选择相关选项，可使用多边形、矩形或圆形工具在图像中定义需包含或排除的区域。随后的自动分析将采用灵活的算法，针对某些图像缺陷（例如 对比度不足）进行校正，并基于图像质量提升对比度。</li>
</ol>

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</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

将木材解剖学成功且可持续地整合到树木生态学研究中所面临的挑战，除了多种分析问题外，主要源于技术层面。这些挑战涵盖了从基本的取样方法到高质量显微切片的制备及其后续分析的各个环节19。
乍一看，钻取树芯甚至圆盘样本似乎是一个已知多年的简单操作。然而，该过程中有许多环节容易出错，取样时的微小误差都可能在后续的制备和分析阶段引发严重问题。如果研究目的仅限于年轮宽度测量，那么取样时未完全垂直于茎轴钻取，或使用刃口不够锋利的取样器等问题尚可接受。然而，若目标是对样本进行显微分析，则不正确的取样方向可能导致细胞壁在显微观察中出现光学畸变，而使用钝的取样器则会在树芯内部产生微裂纹。结果，在尝试对这些树芯切取显微切片时，薄切片极易碎裂，无法保证高效的样品制备。微型取样（micro-core sampling）同样如此：钝的取样头在冲头敲击进入茎木质部时会产生巨大压力，导致形成层受到压缩，形成层细胞（图5）因此被挤压，无法进行有效分析。
在分析生长变异并将其与环境变化相关联时，圆盘取样确实是最佳策略。然而，要从所有拟采样的树木中获取圆盘以进行后续分析，实际上是不可行的。尽管如此，特别是在热带树木年轮学研究中，仍需结合使用一定数量的树干圆盘和生长锥钻取的年轮样芯。这些圆盘可用于界定年轮边界，并为基于年轮样芯分析所确定的边界提供支持依据12,27,28。
打磨与切割的优缺点经常被讨论1,11,21。如上所述，最佳操作方法始终取决于研究问题及待分析的参数（宏观或微观）。如果后续工作步骤中计划进行同位素或化学分析，则必须特别注意，打磨过程中产生的磨料粉尘可能充满整个样本的细胞腔，需通过真空或压缩空气仔细清除。
制备显微分析样品时，切取微小切片是最适宜的方法，适用于所有显微镜分析。首先，从样品上切下切片后，可确保样品免受污染，便于后续可能的进一步分析；其次，这些切片能够实现对单个细胞参数的高分辨率测量。此外，通过使用玉米淀粉溶液26来稳定细胞，避免了耗时的包埋技术，这是微切片技术的一大优势。
显微切片的一个缺点仍然是样本尺寸有限，导致制备时间较长。对于需要回溯数个世纪甚至数千年的时间序列实时分析，有必要进一步改进现有的切割装置17,19，以及图像处理和分析技术18。朝这一方向迈出的第一步是核心切片机的开发21，该设备最初被制造用于在岩心上切割平面表面（图1）。最近的测试表明，该设备能够对整个岩心进行显微切片（图1）。
高质量的显微切片是有效图像分析的基本前提。在显微镜下获取图像是常规操作19，但其有效分析仍是一项有待进一步发展的任务17。所有现有的图像分析系统均为半自动，i.e., 均需技术人员不同程度地进行干预。在许多情况下，需要对图像进行校正，甚至重新获取图像，以增强对比度，从而帮助软件更好地识别结构，同时不改变图像中的细胞壁厚度。
专用图像分析工具，例如 ROXAS18，WinCell 或 ImageJ 的特定脚本29 能够提供基本的解剖学数据，如细胞数量、细胞尺寸、细胞壁厚度以及细胞在年轮内的位置。从这些基本测量值中还可计算出多种与树木生态学相关的附加解剖指标，例如最大导管的尺寸、导管尺寸分布、早材或首列导管的尺寸、（光学）木材密度、年内导管尺寸和细胞壁厚度的变化轮廓，以及导管的排列模式（单个、多个） 等等。).
利用软件 ROXAS18，可自动识别导管腔（即 输水细胞）和年轮边界的轮廓，并以叠加图的形式直观地显示在原始图像之上。导管的检测算法基于颜色、大小和形状信息，而年轮边界的检测算法则依赖于每个导管的局部上下文信息。通过一个工具箱，我们可以手动优化这些结果，直接编辑叠加图中的特征，即 删除、添加或修改年轮边界和导管轮廓。编辑完成后，系统将自动生成最终数据输出（包括细胞壁厚度，适用于针叶树），并保存至电子表格中。目前尚无完全自动化的系统，即使是结构相对简单的针叶树也尚未实现完全自动化，但这将是未来发展的目标。这一进展将有力推动木材解剖参数在时间序列分析中的全面整合。

树木以及灌木、矮灌木甚至草本植物，均会表现出与环境变化相关的多种响应模式。这些模式自19世纪中期以来一直是植物学和植物生理学的研究对象1。当时，对木本植物的研究主要集中在树木上，并侧重于在生态学背景下对年轮结构及其变异性的描述性分析1。当安德鲁·埃利科特·道格拉斯（Andrew Ellicott Douglass）发明了树木年轮研究中的交叉定年技术后2，这种生态学背景在很大程度上被考古学中精确测定木质遗存年代的新能力所掩盖。交叉定年首次实现了将树木年轮准确对应到具体日历年份，至今仍被视为所有应用领域中树木年轮研究的基石1。
与此同时，自19世纪末以来，木材解剖学已发展成为一个重要的研究学科，与自然科学和应用科学的许多其他领域密切相关3。该学科确立了两个主要领域：系统木材解剖学，这是考古学中木材鉴定的基础4；以及应用木材解剖学，涉及木材技术、生理学、病理学和生态学3,5。
在树木年轮研究中，树木生态学（dendroecology）如今被定义为涵盖与树木年轮相关的环境研究领域，例如地貌过程（树木地貌学，dendrogeomorphology）、温度与降水重建（树木气候学，dendroclimatology）、水位变化（树木水文学，dendrohydrology），甚至冰川波动（树木冰川学，dendroglaciology）6。正如该定义所示，树木年轮分析在环境过程的定年与重建研究中正变得日益重要，例如：（i）通过分析年轮宽度的年际变化7,8、木材密度9或同位素组成10来重建过去的气候条件；或（ii）确定地貌过程的重复发生周期11。这些关于年轮宽度变化及其同位素含量的详细研究，表明有必要对年轮进行更深入的分析，即，研究年轮的解剖结构。然而，将木材解剖特征与环境变化关联起来的精细研究仍然较为罕见12,13。尽管这些微观特征已被认知14，但在微观层面上将其应用于树木生态学研究的情况却很少见。此外，对于天然生长树木中生长响应的精确时间记录——这对于精确定年至关重要——近年来也鲜有报道15。
关于全球变暖的影响16，有必要改进现有技术并发展新技术，以记录和量化过去及当前的环境过程，尤其是在气候影响研究方面11。通过将传统的木材解剖学研究拓展为基于生态学的木材解剖学17，树木年轮科学家可以分析新的参数并开发新的方法，以理解特定环境因子对木本植物解剖结构的短期和长期影响18。要理解树木年轮形成的变异性，基本前提是深入了解个体年轮内不同细胞参数的变化及其与特定驱动因素（例如，机械力、气候变化）之间的关系。与常规的年轮宽度测量相比，识别木材解剖结构的变化需要更复杂且耗时耗力的制样技术。样品切割、染色和包埋等详细操作步骤繁多，且始终取决于研究目的19。
对于针叶树年轮宽度的宏观分析，或阔叶材中导管的数量、大小或分布等结构特征的分析，通常使用细粒度砂纸或专用研磨机对样品表面进行抛光处理20。该方法的一个缺点是细胞腔内会填满粉尘，从而阻碍后续的半自动显微分析21。在制备用于宏观观察的样品时，若使用剃刀刀片或其它锋利刀具切割样品表面，可获得最佳效果。
对于小样本，剃刀片是理想的工具；而对于较大的样本（如钻芯），则需要在整个钻芯范围内切割出平整的切面。与打磨不同，该方法不会使细胞腔内充满粉尘，从而便于后续进行连续的图像分析。此外，开放的细胞腔、完整切割的细胞壁以及整个样本的平整表面，使得高频密度测定法22可应用于整个钻芯样本。对于图像分析，可通过黑色墨水对样本表面（细胞壁）进行染色，随后用白色粉笔填充开放的细胞腔，以增强细胞壁与腔体区域之间的对比度19,23。这种相对简单的方法能够实现对较大细胞结构的宏观初步评估，适用于导管尺寸的测量。
这些切削平面表面的技术足以用于宏观分析。对于详细的木材解剖学（即， 显微分析中，透射光显微镜法是树木科学中最常用的方法。木质部细胞通过包括细胞类型决定、细胞分裂、细胞分化以及程序性细胞死亡在内的复杂过程进行分化。24由于这些过程发生的时间和速率决定了细胞的解剖学特征，因此影响这些过程的环境条件可能导致年轮结构出现解剖学上的变异。作为此类分析的重要前提，需要使用切片机制备显微切片。19在制备切片样品时，导管或纤维方向的可见性至关重要。建议使用手动滑动式切片机来制备显微切片，因为该技术能够制备出满足图像分析所需的高质量切片。19根据特定研究目的，可将显微切片切割成与细胞纵向垂直或平行的切面。随后在显微镜下对切片进行拍照，并使用专业的图像分析软件测量细胞尺寸。
直到最近，制备微小切片的能力仅限于小尺寸样品（约1&#160;cm × 1&#160;cm）。这种方法适用于分析特定年份中单一事件（如干扰）的影响，但无法满足环境重建所需的长时间序列分析。只有通过开发新的、高效且经济的样品制备方法和分析技术，才能实现这一目标。近年来，瑞士联邦森林、雪与景观研究所（WSL）树木年轮实验室的成员已就此课题开展了深入研究。由此开发出一系列新设备和分析技术，以推动将木材解剖特征整合到广泛的环境研究领域中的理念。

<table><tbody><tr><td>增量取样器</td><td></td><td></td><td>http://www.haglofinc.com/index.php?option=com_content&amp;amp;view=article&lt;br/&gt; &amp;amp;id=57&amp;amp;Itemid=88&amp;amp;lang=en</td></tr><tr><td>Core-Microtome</td><td></td><td></td><td>http://www.wsl.ch/dendro/products/microtomes/index_EN</td></tr><tr><td>实验室切片机</td><td></td><td></td><td>http://www.wsl.ch/dendro/products/microtomes/index_EN</td></tr><tr><td>Trephor 微型取芯器</td><td></td><td></td><td>http://intra.tesaf.unipd.it/Sanvito/trephorEn.asp</td></tr><tr><td>Nawashin 溶液</td><td></td><td></td><td>十份 1% 铬酸，四份 4% 甲醛，一份乙酸</td></tr><tr><td>苦味酸-苯胺蓝</td><td></td><td></td><td>一份饱和苯胺蓝和四份三硝基苯酚溶于 95% 乙醇中</td></tr><tr><td>番红</td><td></td><td></td><td>经验式（希尔记法）C&lt;sub&gt;20&lt;/sub&gt;H&lt;sub&gt;19&lt;/sub&gt;ClN&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>星蓝</td><td></td><td></td><td>经验式（希尔记法）C&lt;sub&gt;47&lt;/sub&gt;H&lt;sub&gt;52&lt;/sub&gt;CuN&lt;sub&gt;14&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;6&lt;/sub&gt;S&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>乙醇</td><td></td><td></td><td>线性式 CH&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;CH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;OH&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>二甲苯（Xylene）</td><td></td><td></td><td>线性式 C&lt;sub&gt;6&lt;/sub&gt;H&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;(CH&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;)&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>加拿大树胶</td><td></td><td></td><td>显微镜用封片剂</td></tr><tr><td>Roxas 软件</td><td></td><td></td><td>http://www.wsl.ch/dienstleistungen/produkte/software/roxas/index_EN</td></tr><tr><td>ImageJ 软件</td><td></td><td></td><td>http://imagej.nih.gov/ij/</td></tr><tr><td>WinCell</td><td></td><td></td><td>http://imagej.nih.gov/ij/</td></tr></tbody></table>

现代树轮研究的技术视角——如何应对树木生态学与木材解剖学挑战

A Technical Perspective in Modern Tree-ring Research - How to Overcome Dendroecological and Wood Anatomical Challenges

树木年轮生态学研究利用树木年轮中储存的信息，来理解单株树木乃至整个森林生态系统对环境变化的响应，并最终重建这些环境变化。该方法通过分析树木生长在时间上的变化，并将各种植物特异性参数与（例如）温度记录进行关联来实现。在这些分析中整合木材解剖学参数，将增强重建结果的可靠性，甚至达到年内分辨率。因此，本文提供了一套实验方案，介绍如何对木材样本进行取样、制备和分析，以适用于常规的宏观分析，以及后续的微观分析。此外，我们还提出了一种潜在解决方案，用于分析由常见大小样本生成的数字图像，以支持时间序列分析。本方案介绍了目前可应用的基本操作步骤。在此基础上，仍需持续改进现有技术，并发展新技术，以记录和量化过去及当前正在进行的环境过程。传统的木材解剖学研究需要拓展，以纳入生态学信息，推动该研究领域的发展。这将有助于树木年轮科学家分析新的参数，并开发新的方法，以理解特定环境因子对木本植物解剖结构的短期和长期影响。

所有树木年轮生态学分析都依赖于准确的样品，无论采集的是圆盘、钻芯还是微钻芯。为此，采样工具必须保持良好状态（准确磨锐），以避免木材样品内部产生微裂纹。在对生长轮钻芯样品进行表面处理时，使用钻芯切片机至关重要。能够获得开放的细胞结构，并可进一步处理以增强图像分析和导管尺寸测量的对比度（图1），这是将解剖结构特征纳入时间序列分析的第一步重要工作。有时硬木样品的密度较高，无法使用切片机，在这种情况下，适当的抛光处理，随后用压缩空气或真空设备清除导管中多余的锯末，是最佳选择。
为了对针叶树早材和晚材管胞等较小的细胞结构进行更详细的分析，需要制备高质量的显微切片。在此过程中，应避免出现次生细胞壁从初生壁剥离等潜在的人工假象图2）。如果数字图像中出现这些伪影，将无法再对细胞尺寸进行自动分析。此时必须手动校正这些伪影，这一过程耗时较长，且大多数情况下会导致细胞尺寸测量结果不准确。通过简单地使用一种非牛顿流体， 即，一种玉米淀粉溶液，加至样品顶部，可在最大程度减少伪影产生的同时支持结构的稳定性（图2)26玉米淀粉的应用适用于所有木材样本，包括热带树种，这使得在切片前对样本进行包埋处理变得多余。
微切片技术有助于更准确地确定年轮，对于生长在其自然分布边缘的针叶树而言，这一点尤为明显。 即，位于高海拔山区的林木线处。年轮极窄，宏观上常难以识别图3）。在极端情况下，年轮由一至两列早材细胞和一列扁平的晚材细胞组成，这些晚材细胞（与普通晚材细胞不同）缺乏增厚的细胞壁，因此在显微切片下才能更好地观察，甚至只能通过显微切片识别。此外，使用显微切片可更清晰地区分密度波动与年轮边界，从而简化了在地中海地区和热带地区年轮的识别。图3).
在以40倍或更高倍数放大分析图像时，可观察到单个细胞，并能检测其细胞壁的厚度。半自动分析软件能够沿指定路径测量特定参数，以追踪其时间和空间上的发育方向（图4）。通过该方法，可确定单个参数（如细胞腔或细胞壁厚度）在整个年轮范围内的变化（图4）。此分析可针对图像中可见的所有年轮进行，充分满足长时间序列分析的需求。
图像分析还可用于确定生长季内年轮的发育阶段（图5）。在使用偏振光分析经藏红花素和天青蓝染色的切片图像时，即使是从细胞壁最外角开始到次生细胞壁完全木质化的不同木质化阶段，也能清晰可见。这是因为木质化（成熟）的细胞壁在偏振光下会发亮（图5）。这些详细信息可与相应生长季记录的环境数据相关联，以进一步阐明气候与生长之间的关系。
<img alt="树木年轮分析、图表和木材横截面、树轮年代学研究、生长模式比较。" src="/files/ftp_upload/52337/52337fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 
图1. 橡木显微切片及制备平面表面的示例，包含年轮宽度和导管尺寸测量。 左图：橡木生长锥钻取样本的最外部分。使用生长锥切片机切割出直径为5 mm的样本芯，随后用记号笔将表面染成黑色，并在染料干燥后用白粉笔填充细胞空腔。右图：图表显示了对左图样本芯表面进行的年轮宽度和导管尺寸测量结果。由于生长锥切片机能产生清晰的切面，因此无需制作显微切片即可完成这些测量（修改自21）。底部：从生长锥样本上切下的显微切片，经染色、脱水后用加拿大树胶封固。厚度：20 µm，长度：25 cm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52337/52337fig1highres.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="植物组织结构、显微镜图像、木质部和韧皮部细胞排列、横切面分析。" src="/files/ftp_upload/52337/52337fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 
图 2. 未经稳定处理与使用玉米淀粉溶液处理后切取的显微切片图像对比。 左图：显示在针叶树早材管胞中存在切片伪影的显微切片。该样品未进行包埋直接切片，导致早材细胞较薄的次生壁从初生壁上剥离（蓝色箭头所示）。右图：针叶树早材管胞中无任何伪影的显微切片。该切片（与左侧为同一样品）在切片前于样品表面涂抹了玉米淀粉溶液。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52337/52337fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="显示木材结构细胞组织的显微图像，比例尺表示放大倍数。" src="/files/ftp_upload/52337/52337fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 3"> 
图3. 难以检测的年轮界限示例。 左图：生长轮钻取样本的显微切片（此处为Larix decidua），显示由单列扁平的晚材细胞构成的年轮界限（黑色箭头），细胞壁无明显增厚。该年轮在宏观上不可见。右图：年内密度波动（白色箭头）在地中海地区树种中较为常见（显微切片：Quercus ilex）。细胞结构从早材逐渐过渡为晚材，再返回早材结构（白色箭头），这种渐变特征可用于区分密度波动与真正的年轮界限（黑色箭头）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52337/52337fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="植物组织研究中管胞腔面积和壁厚的显微图像与图表。" src="/files/ftp_upload/52337/52337fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图4"> 
图4. 针叶树年轮内管胞腔面积与壁厚测量示意图。 上图：裁剪图像，显示欧洲赤松（Pinus sylvestris）树轮中ROXAS分析的典型结果。年轮边界以黄色显示，管胞腔轮廓以青色勾勒。对于一个径向细胞列（蓝色管胞腔），所测得的细胞壁厚度以红色圆圈表示。黑色标尺 = 100 µm。下图：整个年轮中管胞腔面积和管胞细胞壁厚度的年内变化。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52337/52337fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="Microscopic plant tissue diagram; cambial zone, xylem, phloem, cell development phases labeled." src="/files/ftp_upload/52337/52337fig5.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 5"> 
图5. 年轮形成示例。 该图像为2023年7月7日采集的微钻样品经微切片后，使用番红-固绿染色，在偏振光显微镜下拍摄所得th，2007年来自一个 Larix decidua 生长于海拔1300米的勒奇山谷。在此显微切片中，可识别出形成层细胞、扩大阶段细胞、细胞壁增厚阶段细胞以及成熟细胞。图像的切向宽度覆盖了约1 mm的木质部横切面。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52337/52337fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>

本文介绍了一种用于采集木材样本以全面评估其生长结构的实验方案。描述了制备和可视化木材解剖学及树木生态学数据所必需的宏观与微观技术，以获得重复性好、分辨率高的数据集。

树木年轮生态学研究利用树轮中储存的信息，来理解单个树木乃至整个森林生态系统如何响应……

以下实验的总体目标是获得重复性良好且分辨率高的木材样本，以建立解剖学数据集，用于研究时间及环境因素对树木和灌木生长的影响。该目标通过使用非牛顿流体在切片过程中稳定植物细胞来实现，从而在第二步中能够对样本进行详细的显微分析。通过双重染色微切片以区分木质化和非木质化细胞，然后对样品进行数字成像。最终可进行基于细胞的自动化分析以及相关的时序分析，从而评估目标木材解剖参数。该技术相较于现有方法（如送样评分）的主要优势在于，采用本技术处理的样品细胞中不会残留锯末，从而获得更清晰、质量更高的样品，便于图像分析。此外，在切片过程中向细胞中添加非牛顿流体，可避免耗时的石蜡包埋样本技术。我们将在视频中看到的新型切片机由我们实验室与苏黎世联邦理工学院的中央卢·内蒂（Lu Netti）合作开发。这些切片机因其导引系统的高稳定性而突出，能够切割大而致密的样本。用于树木茎干的钻芯取样。首先将 sharpened increment core 垂直于树木茎干的生长轴放置。接着旋转钻取，并使用 extractor 将获得的芯样从树体中取出。用软铅笔在样本表面标记特定编号以标识样本核心，并在采集完所有样品后，于茎的另一侧重复此操作。将标记好的样本核心存放于合适的容器中，以防止运输过程中受损。返回实验室后，使用防水木胶将样本核心按纤维方向垂直固定在木制支撑梁上，待其干燥，以便进行微核心取样。首先，根据需要使用凿子去除部分树皮。然后将特制的取样钻垂直于茎的生长轴放置，如之前所示，并用锤子将钻头穿透茎的木质部，深度约两厘米。旋转取样钻，使钻头内部形成的微小样本芯断裂。 然后从茎中取出髓心，并将其存放在已标记的微量离心管中。为了在髓心样品上切出平整的表面，首先将感兴趣的增量髓心固定在新开发的髓心切片机的髓心夹持器中，以便在整个髓心范围内切割平面。接着抬起髓心，直至其轻微接触刀片；该刀片固定在球轴承导轨上，并覆盖髓心的整个长度。拉动刀片，切去髓心顶部的第一部分。接下来，将刀片推至核心后方。将样品台提升约 10 µm，重复切片操作，直至核心直径的约三分之一被切去，形成连续的平面表面。为了对样本的解剖结构进行详细的图像分析，需使用另一种切片机制备显微切片。首先，将感兴趣的样本芯固定在切片机的样本夹持器中。然后，在滚珠轴承导引下定位切片刀，并将刀片拉过样本芯。向后推动刀片，将样本抬升20至30微米。然后将刀片拉过样本表面。重复此过程，直至在样本顶部形成连续的表面。现在使用画笔，将玉米淀粉溶液涂覆在所得表面上。然后将样品抬升15微米，并将画笔置于样品表面。从画笔下方开始，缓慢将刀片向样品方向拉动，进行薄切；当整个切片完成时，利用画笔引导切片在刀片表面移动。使用另一支毛笔和水将组织从刀片上冲洗下来，并将其置于载玻片上，以便区分木质化和非木质化结构。用移液器吸取水洗去甘油。接着，用几滴藏红与天蓝染料的混合液覆盖湿润的切片。五分钟后，用水洗去染料，然后立即用连续的乙醇处理对切片进行脱水。经过脱水乙醇处理后，用100%二甲苯反复冲洗切片。当二甲苯保持清澈时即可。用一滴100%加拿大树胶覆盖组织，并加盖盖玻片，注意避免产生气泡。然后将制备好的显微载玻片置于两条耐热塑料条之间，并放置在金属板上。在载玻片上方放置重物以保持切片平整，随后将载玻片放入60°C的烘箱中。12小时后，让载玻片冷却至室温，然后取下重物和塑料条。最后，使用剃刀刀片清理载玻片，去除多余的树胶，随后按照此前介绍的切片和染色步骤进行操作，即可制备各种尺寸和形态的样品；也可使用特殊夹具，对样品进行处理以获取岩心表面的数字图像，用于孔隙结构分析。首先，如前所述，用岩心切片机切割岩心表面平面，然后用记号笔将所得表面染成黑色。染料干燥后，用白粉笔擦拭岩心表面，然后用手指将粉笔末压入孔隙中。清除多余的粉笔末，将岩心置于配备数码相机的双目显微镜载物台上，从岩心一端开始。随后连续拍摄一系列轻微重叠的图像，直至覆盖整个岩心表面。然后将单个图像拼接在一起，以生成岩心表面的完整图像，并从显微玻片创建数字图像。将玻片放置在显微镜载物台上，选择适合待分析结构的放大倍数。最后，采集固定在已清洁的显微玻片上的切片重叠图像（如同前面对岩心表面样品所演示的那样），并将这些图像拼接成一幅完整的切片图像。具备开放细胞的特性是将解剖学上的树木年轮生态结构应用于时间序列分析的第一步。若需对针叶树的早材或晚材管胞进行更详细的分析，则需要高质量的显微切片，同时应避免细胞壁破裂等潜在的人为假象。将非牛顿流体（如上文演示的玉米淀粉溶液）应用于样品，有助于维持细胞结构的稳定性。微切片技术能够更准确地确定年轮数量，这一点对于生长在其自然分布边缘的针叶树尤其重要。如图所示，极窄的年轮很常见，但在宏观上难以检测。在极端情况下，年轮仅由一至两列细胞组成，可能只有在使用显微切片时才能观察到。在高倍放大下分析图像时，可观察到单个细胞。半自动分析软件可测定图像中所有可见年轮的单一参数（如细胞壁厚度）的变化，从而表明需要进行扩展的时间序列分析。对显微切片进行双重染色，可实现木质化不同阶段的可视化观察。随后可将这些信息与相应生长季的环境数据进行关联，以在发育完成后确定更详细的气候-生长关系。该技术为从事DRO生态学研究的科研人员探索树木和灌木的各种解剖学参数提供了可能。使用该方法可显著缩短制备大尺寸、高质量切片所需的时间。在操作过程中，应始终采取预防措施，例如在通风橱下操作并佩戴手套。观看本视频后，您应能够充分理解如何生成具有良好重复性和高分辨率的解剖学数据集，以支持时间序列分析。

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