准备，成像和定量的细菌表面运动性测定
April 7th, 2015
群体运动受物理和环境因素的影响。我们描述了一个两阶段的方案和指南，以规避通常与 swarm 测定制备和数据收集相关的挑战。采用宏观成像技术来获取有关当前分析技术未提供的群体行为的详细信息。
该程序的总体目标是以标准和可重复的方式可视化和量化称为蜂群的细菌表面运动。这是通过首先准备和固化表面运动板来实现的。第二步是用细菌接种表面运动测定板，并在受控环境中孵育这些板。
接下来，对平板测定上的细菌生长模式进行实时成像。该过程的最后一步是处理图像以进行定量。最终，该程序为表面运动板测定制备提供了标准化方案，以生成定量动态信息，例如表面模态细菌的群体扩张速率或生物产物密度分布。
许多小组进行表面运动测定。这种技术的主要优点是我们提供了一个系统的协议，可以最大限度地减少可能导致不一致的多个变量。这种方法可以帮助回答细菌表面运动领域的关键问题，例如细菌如何在不同类型的表面定植。
虽然这种方法可以通过一些修改深入了解假单胞菌的蜂群运动，但它也可以应用于研究其他表面模态细菌。通常，刚接触这种方法的个体会很挣扎，因为方案或实验室环境的微小变化会极大地影响群体检测结果。演示该程序的是我实验室的研究生 Morgan。
首先，通过将 200 毫升 FAB 减去硫酸铵群培养基、0.9 克惰性琼脂和 0.2 克菜酸混合到 500 毫升培养基瓶中来制备农业混合物。使用搅拌板充分混合培养基。接下来，在设置为 121.1 摄氏度的高压灭菌器中对培养基消毒 22 分钟，并带有快速排气选项。
灭菌后，立即拧紧培养基瓶盖以防止水分蒸发。将培养基放在磁力搅拌板上，在环境温度环境中通过主动搅拌将 AED 冷却至 50 摄氏度。如果要在以后的实验时间点使用琼脂，则可以在 60 摄氏度的水浴或培养箱中保温 15 小时，无需主动搅拌。
当培养基在 2 毫升过滤灭菌葡萄糖中达到约 50 摄氏度时，使用标准无菌技术，与磁力搅拌棒充分混合，以防止培养基中形成气泡。在通风橱中，使用无菌血清移液管将 7.5 毫升 edia 分装到单独的 60 毫米培养皿中。如果需要更大的蜂群表面积，将 25 升 edia 分装到 100 毫米培养皿中。
将所有培养皿分开，并用靶心水平检查罩子，以确保琼脂凝固的水平表面均匀。对于 60 毫米的培养板，将培养皿盖放在一边，将未覆盖的琼脂在通风橱中固化 30 分钟。较大的 100 毫米培养皿需要更长的固化时间。
给定实验室的湿度、气流和温度可能需要测试固化时间，以实现细菌的最佳蜂群。干燥后，应立即用已单独预生长到所需生长期的细胞接种 APL。首先，从新鲜的 LB 平板中挑选分离的细菌菌落，并接种到 6 毫升培养物中。媒体。
将培养物在 37 摄氏度下水平振荡孵育过夜。第二天，根据细菌菌株，用无菌牙签或金属丝接种针戳琼脂表面，在干燥的蜂群琼脂平板上接种 1 至 5 微升过夜培养物，将蜂群检测板转移到温度设置为 30 摄氏度、 37 摄氏度、 或 42 摄氏度。倒置板，使多余的水分凝结在板盖上而不是琼脂上，在延时成像前在菌株特定温度下平衡细菌 2 或 4 小时。
接下来，将板转移到体内成像装置中，使农业表面的细菌朝下朝向装置的倒置相机。用少量水填充所有培养皿盖。然后将每个盖子放在倒置的 AER 板顶部，水面朝上。
在成像单元内部，密封成像箱体以保持恒定的湿度水平，调整成像单元的成像设置，并开始对蜂群活动进行延时成像。实时成像后，可以使用标准图像分析（例如表面运动实验中的图像 J）来分析细菌的蜂群动力学。在接种前测定琼脂水分含量对于获得成功的蜂群结果至关重要。
最佳情况下，AER 板将促进紧密的接种点并增强细菌聚集活动，而过度干燥的板除了水分含量外还会抑制表面运动，培养基添加剂的存在与否也会通过利用细菌菌株、表达发光或荧光蛋白来影响细菌的聚集活动作为孵育温度的函数。两种不同细菌物种之间的蜂群竞争动态可以在延时视频中捕捉。此外，也可以通过延时荧光显微镜确定和定量细菌群内局部细胞密度的变化和促进流动性的脂质的生物合成速率。
遵循此过程。可以采用其他方法，例如共聚焦显微镜，以回答有关单个细胞行为的问题，以生成细菌表面运动的详细、微观和微观分析。观看本视频后，您应该对如何进行标准且可重复的群体测定有很好的了解，并通过制备、固化和接种表面运动测定以及处理和分析细菌生长模式的结果来获得细菌表面运动的全面分析。
概览
本文介绍了一种标准化的协议，用于可视化和量化细菌聚集运动。它解决了聚集测定准备和数据收集中的常见挑战，并利用宏观成像技术进行详细分析。
关键研究组成部分
科学领域
- 微生物学
- 细菌运动性
- 成像技术
背景
- 聚集运动受各种物理和环境因素的影响。
- 标准化的协议对实验的可重复性至关重要。
- 当前的分析技术可能缺乏对聚集行为的详细洞察。
- 了解细菌在表面的定殖对各种应用至关重要。
研究目的
- 提供表面运动性测定的系统协议。
- 最小化导致不一致结果的变量。
- 生成关于聚集膨胀率和生物产物密度的定量数据。
使用的方法
- 用特定培养基准备表面运动性平板。
- 用细菌接种平板并控制孵育。
- 实时成像细菌生长模式。
- 图像处理用于聚集动态量化。
主要结果
- 展示了评估细菌表面运动性的可重复方法。
- 确定了影响聚集行为的关键因素，如水分含量。
- 提供了关于细菌竞争动态的见解。
- 使用延时成像实现了细菌行为的详细分析。
结论
- 标准化的协议提高了聚集测定的可靠性。
- 它可以适应各种细菌菌株和条件。
- 该方法有助于更好地理解细菌运动性和定殖。
常见问题
Executive Industry Relevance
Bacterial surface motility assays face reproducibility challenges due to sensitivity to agar concentration, moisture content, and environmental variables, complicating target validation in antimicrobial discovery. This protocol standardizes swarm assay preparation and quantification, enabling reliable phenotypic screening and mechanistic de-risking of motility-related targets. By providing quantitative dynamic outputs such as swarm expansion rate and bio-product density, it supports predictive confidence in early discovery workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses related to bacterial colonization and surface adherence mechanisms.
- Operational Value: Reduces mechanistic ambiguity by isolating motility as a phenotypic readout for target validation.
- Predictive Value: Supports portfolio triage through quantitative assessment of swarm dynamics under varying genetic or chemical perturbations.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream compound screening by ensuring reproducible swarm phenotypes.
- Operational Value: Standardizes agar preparation, inoculation, and imaging conditions to minimize inter-assay variability.
- Scalability: Supports time-lapse imaging and quantification workflows compatible with high-content screening platforms.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects in vitro motility observations to preclinical models of biofilm formation and host colonization.
- Biomarker Alignment: Enables tracking of fluorescent or luminescent reporters to correlate motility with virulence factor expression.
- Risk-Adjusted Advancement: Provides quantitative thresholds for go/no-go decisions in anti-virulence target validation.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to lead identification, particularly for anti-infective programs targeting virulence or colonization factors.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of genes or compounds affecting surface motility as a virulence-associated trait.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized media preparation and environmental controls for reliable compound evaluation.
- Analytics: Generates quantitative dynamic readouts such as radial expansion rate and fluorescence intensity distribution for comparative analysis.
- Translational Research: Links motility phenotypes to preclinical relevance in persistent infection and colonization models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging and quantification platform for multiple bacterial strains and experimental conditions.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing false negatives from assay irreproducibility in motility-based screens.
- Operational Value: Enhances standardization and reproducibility across laboratories through defined curing, inoculation, and imaging protocols.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early de-risking of targets involved in surface adherence and biofilm initiation.
- Portfolio Impact: Facilitates risk-adjusted prioritization of anti-virulence candidates based on motility inhibition efficacy.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microbiological techniques and sterile media preparation.
- Dependent on controlled environmental conditions (humidity, temperature, airflow) for optimal agar solidification.
- Necessitates standardization of inoculation volume and incubation timing across users and sites.
- Requires adaptation of agar concentration (0.4%-0.8% wt/vol) based on bacterial strain swarming sensitivity.
- Limited by the need for time-lapse imaging infrastructure and image analysis proficiency (e.g., ImageJ) for quantification.
