快速鉴定化学遗传相互作用 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）

本实验的总体目标是利用酵母细胞来确定某种目标化学物质所作用的生物学过程。首先需要测定该化学物质对酵母的剂量反应曲线。第二步是在亚致死浓度的化学物质条件下以及对照平板上，培养一套完整的酵母基因敲除菌株集合。

接下来鉴定对这种化学物质高度敏感的酵母突变株。通过生物信息学分析该列表，以揭示所有耐受该化学物质所必需的基因。最后一步是在低通量条件下重复进行生物学重复实验。

这可以验证所发现的化学物与基因之间的相互作用。最终，这种高通量化学遗传筛选方法可用于揭示细胞耐受目标化学物所依赖的基因产物及生物学通路。与现有的方法（如在液体培养基中对带条形码的突变体进行竞争性生长实验）相比，该技术的主要优势在于无需使用分子生物学技术。

该方法有助于回答化学生物学领域的一些关键问题，例如一种新型小分子如何抑制真核细胞的生长。首先，通过在A-Y-E-P-D平板上划线接种BY 4 7 4 1细胞来制备过夜酵母培养物，并在30摄氏度下培养48小时，直至出现可见菌落。当菌落准备就绪时。

通过挑取单菌落并接种于无菌容器中的5毫升YEPD液体培养基中，制备过夜液体培养物。然后在30摄氏度下持续旋转或振荡培养过夜。接着，制备含有不同浓度待测化学物质的固体琼脂培养基。

为此，首先用合适的溶剂配制若干份目标化学物质的储备液，浓度为最终浓度的100倍。然后，针对每个待测浓度，将3毫升熔化的YEPD琼脂分装至若干无菌培养管中。

将含有琼脂的试管置于55摄氏度的水浴中，以防止琼脂凝固。现在，针对每种待测试的化合物浓度，在13个浓度下，将100倍浓缩的化合物溶液加入到一份熔融琼脂培养基中，涡旋混匀2至3秒，然后从每支试管中吸取1毫升，分别加入12孔板中的两个重复孔内，于室温下静置过夜，使琼脂凝固。次日，取10毫升YEPD液体培养基，接种2微升过夜饱和培养的酵母菌液。

然后取25微升该培养物，用移液器滴加到12孔鲸板各孔中含化学物质的琼脂上，使用无菌玻璃珠或无菌涂布棒均匀涂布。将平板置于火焰下晾干，随后在30°C条件下培养48小时。培养结束后，评估各孔中菌落的总数和大小。

确定一种亚致死浓度的化合物，该浓度对生长的抑制不超过10%至15%，用于筛选实验。通过在含有每毫升200微克G418的16块YEPD琼脂平板上复制，保持每个平板384个菌落的密度。每三个月使用微生物阵列机器人系统或手动针印工具进行一次操作。

将平板置于 4 摄氏度保存备用。然后配制 250 毫升 YEPD 琼脂培养基，其 G418 浓度与五块琼脂平板相同，并将平板置于平坦均匀的表面上，室温下静置过夜冷却。从 4 摄氏度的储存环境中取出含有基因敲除突变体文库的平板，使其恢复至室温。

使用精细任务擦拭纸清除每个培养皿盖上形成的冷凝水，以防止水滴落在阵列上导致阵列突变体之间的交叉污染。使用微生物阵列点样机器人将缺失突变体阵列从每块培养皿384个菌落的密度，压缩至每块培养皿1,536个菌落，共转移至四块培养皿上。在30°C条件下过夜培养后，检查阵列以确保菌落从源培养皿均匀转移。

阵列中将包含多个空白位置，用于确认缺失突变体阵列已正确压缩。这些空白位置对应的源板将用于复制到含有目标化合物的培养基上。单个源板可用于多次点样。

此外，许多机器人具有偏移功能，可确保每次转移相似数量的酵母。为了建立复制平板缺失突变体阵列修复实验，需准备700毫升仅含对照载体的YEPD琼脂和含有目标化学物质的实验用YEPD琼脂。这些足以进行三次重复实验。

使用对照和实验用琼脂倒平板，每板加入 50 毫升。将平板置于平坦、均匀的表面上，在室温下静置过夜冷却，并使用机器人复制平板。

将双突变体阵列接种到三组含有经实验确定浓度的化学物质的平板上，同时接种到含有溶剂对照的平板上。将平板在室温下置于实验台上孵育，总时间为24至48小时。通过移去平板盖并将平板倒置于平板扫描仪上，对孵育24小时和48小时的平板进行成像。

以至少 300 DPI 的分辨率拍摄图像。或者，可使用数码相机拍摄图像。若采用此方法，应将培养皿正面朝上放置于深色背景上，并取下盖子进行成像。

然后使用若干开源程序之一（包括 ball SGA 工具和 screen mill）对阵列菌落大小进行定量和比较。在此阶段，若干酵母基因敲除突变体会表现为对该化学物质高度敏感，从酵母基因敲除文库中将目标高度敏感突变体划线接种至含有 200 微克/毫升 G418 的 YEPD 琼脂平板上，在 30 摄氏度下培养至菌落形成。

通过诊断性 PCR 和 Agel 电泳验证菌株基因型后，将每种菌株分别接种至 5 毫升 YPD 液体培养基中，于 30 摄氏度条件下旋转或振荡培养过夜。测定每种培养物的 OD 600 值，并用无菌蒸馏水将每种菌株稀释至 OD 600 为 1。此时即得到标准化的酵母培养物。

接下来，将100微升经标准化的野生型4 7 4 1酵母菌液加入96孔板的A1孔中，并将最多七种其他菌株各100微升分别加入B1至H1孔。接着，向A2至H2以及A6至H6各孔中分别加入90微升无菌水。最后，制备一系列1至10倍的稀释梯度的标准化G雕塑菌株（G sculptures）菌液。

首先使用多通道移液器将第一列中的10微升依次移液至第二列，并继续在96孔板中进行，直至完成六次稀释。然后使用多通道移液器将稀释后的酵母培养物取2至5微升，以网格形式点样于含有化学物及溶剂对照的YEPD固体培养基平板上。将平板置于适宜温度下孵育24至48小时，孵育结束后进行后续观察。

观察平板，在24小时和48小时时间点，比较所选突变株与BY 47 41对照菌株在化学物质处理下的敏感性差异。以下图像仍为测定该化学物质亚抑制浓度的实验结果。第一张图像显示了将饱和培养的BY 4 7 4 1菌液稀释5,000倍后，接种于含不同浓度5-氟尿嘧啶的平板上的生长情况。

选择10微摩尔浓度作为亚抑制剂量。该图像显示了BY4741细胞在含有5-氟尿嘧啶的液体培养基中的生长曲线。大约4×10⁴个细胞被接种至三个重复孔中，并加入不同浓度的5-氟尿嘧啶，每10分钟测量一次光密度，持续22小时。

同样可以看出，10 微摩尔剂量为亚抑制浓度。接下来的图像显示了五氟尿嘧啶化学遗传学筛选的结果。此处展示的是酿酒酵母（S. cerevisiae）基因缺失突变体阵列在含有 10 µM 五氟尿嘧啶的 YPD 琼脂平板（右侧）与 DMSO 对照（左侧）上的生长情况。

该图展示了化学遗传学绿色实验的结果，即在10 µM 5-氟尿嘧啶条件下，突变株相对于DMSO对照的相对生长情况，此处按射线位置排列。突变株在10 µM 5-氟尿嘧啶条件下相对于DMSO对照的相对生长情况按菌落大小比率排序。

两个图中均标示了小于 0.8 的比值阈值。此最终图像显示了三项验证实验的结果。若干分离突变菌株的连续稀释液分别在左侧的 DMSO 对照、中心的 10 微摩尔五氟代 UIL 以及右侧的 0.015% 甲基甲烷磺酸盐上培养生长。

在进行该实验操作时，务必确保使用可靠的基因敲除突变体阵列，并通过独立的方法（如酵母点种实验或酵母四分体解剖）验证任何实验结果。该技术为小分子研究领域的科研人员提供了一种高效手段，可利用芽殖酵母中的系统水平方法来探究化合物的作用机制。