化学遗传相互作用的快速鉴定酿酒酵母

该程序的总体目标是使用酵母细胞找到目标化学物质所针对的生物过程。这是通过首先确定酵母化学品的剂量反应曲线来实现的。第二步是在亚致死剂量的化学品和对照板上培养完整的酵母基因敲除菌株集合。

接下来鉴定对该化学品过敏的酵母突变体。该列表经过生物信息学分析，以揭示耐受该化学物质所需的所有基因。最后一步是在低通量下进行实验的生物学复制。

这验证了发现的任何化学基因相互作用。最终，这种高通量化学遗传学筛选方法用于显示哪些基因产物和生物途径用于耐受感兴趣的化学物质。与现有方法（例如液体培养物中条形码突变体的竞争性生长）相比，该技术的主要优点是不需要分子生物学技术。

这种方法可以帮助回答化学生物学领域的关键问题，例如新型小分子如何抑制真核细胞的生长。首先，通过在 A-Y-E-P-D 板上划线 BY 4 7 4 1 个细胞来制备过夜酵母培养物，并在 30 摄氏度下孵育 48 小时或直到形成可见的菌落。当菌落准备好时。

通过挑选单个菌落并在无菌容器中接种 5 ml YEPD 液体培养基来制备过夜液体培养物。然后在 30 摄氏度下连续旋转或摇动孵育过夜。接下来，准备含有各种剂量的待测化学品的固体琼脂培养基。

要做到这一点。首先，在适当的溶剂中以最终浓度的 100 倍制备几种目标化学品的储备液。然后，对于要测试的每种浓度，将 3 毫升熔融的 YEPD 琼脂等分装到几个无菌培养管中。

将含有琼脂的试管放入 55 摄氏度的水浴中，以防止琼脂凝固。现在，对于在 13 时测试的每种浓度的化学品，将 100 x 化合物白色释放到等分试样的熔融琼脂中，将试管混合 2 到 3 秒，然后从每个试管中吸取 1 毫升到 12 世界板中的两份孔中，让板在室温下凝固过夜。第二天，用 2 微升饱和过夜酵母培养物接种 10 毫升 YEPD 液体培养基。

然后将 25 微升这种培养物移液到 12 鲸鱼板孔中含有化学物质的琼脂上，并使用无菌玻璃珠或无菌棒均匀涂抹。让板在火焰下干燥，然后在 30 摄氏度下孵育板 48 小时。孵育时间过后，评估孔中菌落的总数和大小。

确定一种亚致死浓度的化合物，该浓度对生长的抑制作用不超过 10% 至 15%，以用于筛选。通过在 16 个 YEPD 琼脂平板上复制，将缺失突变率维持在每板 384 个菌落的密度，每毫升含有 200 微升的 G 4 18。每三个月使用一次微生物排列机器人系统或手动固定工具。

将板储存在 4 摄氏度下，直到需要为止。然后制备 250 毫升具有相同浓度 G 的 YEPD 琼脂培养基，4 个 18 或 5 个琼脂板，并在室温下在平坦的表面上冷却过夜。将含有缺失突变体集合的板从 4 摄氏度的储存中取出，并让板达到室温。

使用精细的任务擦拭去除每个板盖上形成的任何冷凝水，以防止水滴沉积在阵列上和阵列突变体的交叉污染。让微生物阵列固定机器人将缺失突变体阵列从 16 个培养皿上每板 384 个菌落的密度浓缩到 4 个培养皿上每板 1， 536 个菌落。将阵列在 30 摄氏度下孵育过夜后，检查阵列以确保菌落从源板均匀转移。

数组中将包含几个空白位置，这些位置用作删除突变数组已正确压缩的指南。这些将是用于复制到含有目标化合物的培养基上的源板。单个源板可用于多个引脚。

此外，许多机器人具有偏移功能，这将确保每次转移相似数量的酵母。为了建立复制板缺失突变体阵列修复，仅使用 700 毫升对照载体和含有目标化学物质的实验 YEPD 琼脂。这足以一式三份进行测定。

使用对照琼脂和实验琼脂倒入板。向每个板中加入 50 毫升。让板在室温下在平坦、平坦的表面上冷却过夜，使用机器人复制板。

将双突变体阵列接种到三组含有实验测定浓度化学物质的平板上，以及含有载体对照的平板的重置上。在室温下将板放在工作台上孵育，总共 24 至 48 小时成像。板经过 24 小时和 48 小时的孵育，取下盖子，面朝下放在平板扫描仪上。

以至少 300 DPI 的分辨率捕获图像。或者，使用数码相机拍摄图像。如果这样做，请将板面朝上放在深色背景上，然后取下盖子进行成像。

然后使用几个开源程序之一（包括 Ball SGA 工具和 Screen mill）对阵列集落大小进行定量和比较。在这个阶段，几个酵母缺失突变体将评分为对感兴趣的化学物质过敏，从酵母缺失集合中划出所需的超敏突变体到 YEPD 上。每微升 G 4 18 含有 200 微克的 Agger，在 30 摄氏度下孵育直至形成菌落。

通过诊断 PCR 和 Agel 电泳验证菌株的基因型后，用每个菌株接种 5 毫升 YPD 液体，并在 30 摄氏度下旋转或摇动孵育过夜。测量每种培养物的 OD 600，并在无菌蒸馏水中将每个菌株稀释至 OD 600 为 1。这些现在是标准化的酵母培养物。

接下来，通过 4 7 4 1 酵母培养物将 100 微升标准化野生型分配到 96 孔板之一的 A 孔中，将 100 微升最多 7 种额外菌株分配到孔中，B 1 到 H 1。接下来，将 90 微升无菌水分配到井中，A 2 到 H 2 到 6 到 H 6。最后，准备一系列 1 到 10 稀释的标准化 G 雕塑。

首先用多通道移液器连续移液 10 μL 第 1 列至第 2 列，然后继续在 96 孔板上移液，直到稀释 6 次。然后使用多通道移液器在 YEP D 上将 2 至 5 微升稀释的酵母培养物放在网格中，含有化学和载体对照的固体培养基。孵育后，将板在适当的温度下孵育 24 至 48 小时。

检查板，并在 24 小时和 48 小时比较相对于 BY 47 41 对照图像板的选定突变体对化学的敏感性。与以前一样，下图显示了确定化学品的 subin 抑制浓度的程序的结果。第一张图显示了稀释 1 至 5， 000 的饱和 BY 4 7 4 1 培养物的生长，并接种在浓度递增的 5 氟尿嘧啶上。

选择 10 μmol 浓度作为 sub-in 抑制剂量。该图显示了 BY 4 7 41 细胞在含有 5 氟尿嘧啶的液体培养基中的生长曲线。将大约 4 乘以 10 到 4 个细胞一式三份沉积，每 10 分钟测量一次浓度递增的 5 氟尿嘧啶和光密度，持续 22 小时。

同样，可以看出 10 μmol 剂量是 subin 抑制剂量。接下来的这些图像显示了 5 种氟尿嘧啶的化学遗传学绿色的结果。在这里，显示了在 YPD 琼脂上复制的 S sachar visier 缺失突变体阵列，右侧含有 10 微摩尔的 5 Fluor 尿嘧啶，左侧显示了 DMSO 对照。

该图显示了绿色化学遗传学的结果，即突变体在 10 微摩尔上的相对生长。与 DMSO 对照相比，5 Fluor 尿嘧啶在此处按射线位置排序。与 DMSO 对照相比，突变体在 10 微摩尔、5 菌群尿嘧啶上的相对生长按菌落大小比排序。

两个图表上都表示了小于 0.8 的比率阈值。这张最终图像显示了三种验证分析的结果。几种分离的突变菌株的连续稀释液在 DMSO 对照上生长（左侧）、10 微摩尔、5 个氟 UIL 在中心，右侧 0.015% 甲基甲烷磺酸盐。

在尝试此程序时，请务必确保您使用的是缺失突变体阵列的可靠副本，并使用独立的方法（如酵母点样测定或酵母四分体解剖）验证任何结果。该技术为小分子研究领域的科学家提供了一种有效的方法，可以在出芽酵母中使用系统级方法探索化合物的作用模式。