Name: 化学遗传相互作用的快速鉴定酿酒酵母 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 13 s
Description: 学习利用酿酒酵母进行化学遗传相互作用的高通量筛选方法，通过鉴定化学敏感突变体揭示基因耐受机制。该方法无需分子生物学技术，适用于中小规模化合物库的功能研究。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

CJN 实验室的研究工作得到了加拿大自然科学与工程研究理事会（NSERC）、加拿大癌症研究所（CCSRI）以及加拿大乳腺癌基金会（BC-育空地区分会）运营基金的支持。

注意：本实验流程的总体步骤如图2所示。
1. 生长抑制剂量的确定
<ol>
	<li>酵母过夜培养物的制备 
	注意：本实验方案中使用的酵母提取物-蛋白胨-葡萄糖培养基（YEPD）为标准配方13。
	<ol>
		<li>将 BY4741 (MATahis3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0) 菌株在 YEPD 琼脂平板上划线，并于 30 °C 培养 48 小时&#160;，直至可见菌落形成。</li>
		<li>挑取单菌落接种于无菌培养容器中的 5 ml YEPD 液体培养基中，30 °C 条件下振荡培养过夜。培养液通常在次日早晨达到饱和状态（约 2 × 108 个细胞/ml）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>含不同化学物浓度的固体琼脂培养基制备
	<ol>
		<li>用适当的溶剂配制待测化学物的多种母液，使其浓度为预期终浓度的 100 倍&#160;。 
		注意：有效浓度取决于具体化学物，需通过实验确定。因此建议初始测试时采用较宽的终浓度范围；例如，从低 µM 到高 mM 范围。</li>
		<li>针对每种待测化学物浓度，将 3 ml 融化的 YEPD 琼脂分装至若干无菌试管中，并置于 55 °C 水浴中以防止凝固。</li>
		<li>对每种待测浓度，向融化的培养基中加入 30 µl 的 100 倍浓缩化合物溶液，涡旋混匀 2–3 秒，然后将 1 ml 混合液分别加入 12 孔板中的每对重复孔中。务必设置仅含溶剂的对照组。将平板置于室温下过夜凝固，多余培养基应弃去。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>涂布接种细胞
	<ol>
		<li>取 2 µl 过夜培养的饱和酵母菌液，接种于 10 ml YEPD 液体培养基中（酵母菌液按步骤 1.1.2 所述方法培养）。</li>
		<li>每孔加入 25 µl 稀释后的酵母菌液，使用无菌玻璃珠或涂布棒均匀涂布，并在火焰下晾干。于 30 °C 培养 48 小时。</li>
		<li>评估酵母在平板上的生长情况（包括菌落数量和大小）。选择一种亚致死浓度的化合物，其对生长的抑制率不超过 10%–15%，用于后续筛选实验。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 系统性化学遗传筛选
<ol>
	<li>缺失突变体阵列（DMA）的维护与源板制备
	<ol>
		<li>有关从甘油菌种构建缺失突变体阵列的详细说明，请参见 Baryshnikova 等14将缺失突变体以每板384个菌落的密度排列后，DNA可于4 °C保存数月。必要时，在含有200 µg/ml G418的YEPD琼脂培养基上进行复制，以防止菌落相互重叠生长。 
		注意：应避免多次连续传代，以防止生长缓慢的菌株丢失，并减少抑制性突变体的出现。此点在以单倍体形式保藏菌种时尤为重要。</li>
		<li>使用微生物阵列机器人系统完成所有复制平板步骤。或者，使用手动打孔工具操作阵列菌落。 
		注意：酵母基因敲除文库可从多个商业来源获得单倍体和二倍体形式，通常以96孔板中的甘油菌种形式运输。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>压缩缺失突变体阵列
	<ol>
		<li>制备含有 200 µg/ml G418 的 250 ml YEPD 琼脂培养基。G418 的有效浓度可能因批次而异，需通过实验对每批试剂进行测试。</li>
		<li>提前一天准备五块YEPD琼脂平板，每块平板倒入50 ml含有200 µg/ml G418的YEPD琼脂。将平板置于平坦均匀的表面上，室温过夜冷却凝固。 
		注意：在1,536菌株密度下收集需要四块平板，额外倾注第五块平板作为备用。</li>
		<li>取出含有突变体缺失文库的16个培养皿，每皿含384个菌落，置于室温下平衡约1小时。</li>
		<li>使用精细擦拭纸擦去每块平板盖子上形成的冷凝水。若不这样做，可能导致水滴落在阵列上，造成阵列突变株之间的交叉污染。</li>
		<li>使用微生物阵列点样机器人，将DNA阵列从每板384个菌落（16个培养皿）压缩至每板1,536个菌落（4个培养皿）。操作时确保st 来自1号平板的菌落点接到浓缩阵列的第1行第1列，第1个st 2号培养皿的菌落转移至第1行第2列，1st 3号培养皿的菌落转移至第2行第1列，以及第1个st 4号培养皿的菌落转移至第2行第2列。</li>
		<li>在30°C下孵育整合后的阵列过夜。</li>
		<li>检查阵列，以确保菌落从源平板上均匀转移。阵列中会包含若干故意设置的空白位置，用作参照，以确认DNA阵列（DMA）已正确浓缩。图 4A). 
		注意：这些将作为点种到含测试化合物培养基上的源板。单个源板可用于多次点种。此外，许多机器人具有偏移功能，可确保每次转移的酵母数量相近。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>复制平板缺失突变体阵列
	<ol>
		<li>准备700 ml对照培养基（仅含溶剂）和700 ml实验培养基（含化学物质）。该用量足以进行三份重复实验（每种条件12块板，另加2块备用）。</li>
		<li>每块平板倒入含测试化学物或对照物的 YEPD 琼脂 50 ml，在平坦均匀的表面上室温静置过夜冷却。</li>
		<li>使用机器人进行复制平板，将 DMA 接种到三组含有实验确定浓度化学物质的平板上，同时接种到三组含有溶剂对照的平板上。将平板在室温下孵育 24–48 小时。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 成像板与数据分析
<ol>
	<li>从培养箱中取出培养板，在成像前使其恢复至室温（约1小时），以防止成像过程中产生冷凝水。</li>
	<li>在24小时和48小时时间点进行成像：取下培养皿盖，将培养板倒置放置在平板扫描仪上，以至少300 dpi的分辨率采集图像。或者，也可使用数码相机进行成像；若采用此方法，将培养板正置放在深色背景上，取下盖子后进行拍摄。 
	注意：文件格式和培养板的摆放位置取决于所使用的定量分析软件。</li>
	<li>使用多种开源程序之一对阵列菌落大小进行定量分析与比较，包括 Balony 15、SGAtools 16 和 ScreenMill 17。</li>
</ol>
4. 筛选验证
注意：在此阶段，多种酵母基因敲除突变体会表现出对该目标化学物质的超敏感性。这些化学生物遗传相互作用需通过两种方式进行验证。首先，应通过 PCR 确认敏感菌株的身份。其次，必须独立评估其对化学物质的敏感性。下文概述了一项简要的点种实验方案，用于验证菌株的超敏感性，该技术在酵母生物学中较为常见。
<ol>
	<li>从酵母基因敲除文库中挑取目标（高敏感性）突变株，划线接种于含有200 µg/ml G418的YEPD琼脂平板上。30 °C培养至菌落形成。根据制造商提供的方案，使用特异性引物通过诊断性PCR验证菌株基因型。</li>
	<li>对每种菌株接种5 ml YEPD液体培养基，30 °C旋转或振荡培养过夜。</li>
	<li>测量OD600 并将每种菌株稀释至OD600&#160;= 1 在无菌 dH₂O 中2O. 这些即为已归一化的酵母培养物。</li>
	<li>将100 µl标准化的野生型酵母（BY4741）培养物加入96孔板的A1孔中。将最多七种其他菌株各100 µl分别加入B1至H1孔。</li>
	<li>使用多通道移液器分装 90 µl 无菌 dH₂O2O&#160;至A2-H2至A6-H6孔。最后，制备一系列1:10稀释的标准化酵母培养物。使用多通道移液器，先将第1列的10 µl依次移液至第2列，然后在96孔板上连续操作，直至完成六次稀释（即, 100 至 10-5).</li>
	<li>使用多通道移液器将2-5 µl稀释后的酵母菌液按网格形式点样于含有化学物质及溶剂对照的YEPD固体培养基上。将平板置于适宜温度下孵育24-48小时。</li>
	<li>检查平板，比较所选突变株对化学物质的敏感性（相对于BY4741对照）。按照步骤3.2的方法，在24小时和48小时拍摄平板图像。 
	注意：尽管鉴定出多个具有相关基因本体或功能的超敏菌株可增强筛选结果的可信度，但必须通过含有该基因野生型拷贝的质粒转化超敏缺失菌株，以正式确认所关注的基因缺失（而非隐藏的第二位点突变）是导致药物敏感性的原因。</li>
</ol>

<ol><li>Giaever, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+profiling+of+the+Saccharomyces+cerevisiae+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Functional profiling of the Saccharomyces cerevisiae genome.</a> Nature. 418, 387-391 (2002).</li>
<li>Winzeler, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+characterization+of+the+S.+cerevisiae+genome+by+gene+deletion+and+parallel+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Functional characterization of the S. cerevisiae genome by gene deletion and parallel analysis.</a> Science. 285, 901-906 (1999).</li>
<li>Breslow, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive+strategy+enabling+high-resolution+functional+analysis+of+the+yeast+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">A comprehensive strategy enabling high-resolution functional analysis of the yeast genome.</a> Nat Methods. 5, 711-718 (2008).</li>
<li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+exploration+of+essential+yeast+gene+function+with+temperature-sensitive+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Systematic exploration of essential yeast gene function with temperature-sensitive mutants.</a> Nat Biotechnol. 29, 361-367 (2011).</li>
<li>Costanzo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetic+landscape+of+a+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The genetic landscape of a cell.</a> Science. 327, 425-431 (2010).</li>
<li>Parsons, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+chemical-genetic+and+genetic+interaction+data+links+bioactive+compounds+to+cellular+target+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Integration of chemical-genetic and genetic interaction data links bioactive compounds to cellular target pathways.</a> Nat Biotechnol. 22, 62-69 (2004).</li>
<li>Parsons, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+the+mode-of-action+of+bioactive+compounds+by+chemical-genetic+profiling+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Exploring the mode-of-action of bioactive compounds by chemical-genetic profiling in yeast.</a> Cell. 126, 611-625 (2006).</li>
<li>Hillenmeyer, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chemical+genomic+portrait+of+yeast%3A+uncovering+a+phenotype+for+all+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The chemical genomic portrait of yeast: uncovering a phenotype for all genes.</a> Science. 320, 362-365 (2008).</li>
<li>Hillenmeyer, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+analysis+of+genome-wide+fitness+data+in+yeast+reveals+novel+gene+function+and+drug+action%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Systematic analysis of genome-wide fitness data in yeast reveals novel gene function and drug action.</a> Genome Biol. 11, R30(2010).</li>
<li>Smith, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Competitive+genomic+screens+of+barcoded+yeast+libraries%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Competitive genomic screens of barcoded yeast libraries.</a> J Vis Exp. (54), (2011).</li>
<li>Bowie, D., Parvizi, P., Duncan, D., Nelson, C. J., Fyles, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical-genetic+identification+of+the+biochemical+targets+of+polyalkyl+guanidinium+biocides%5BTitle%5D)+AND+%22Organic+%26+Biomolecular+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Chemical-genetic identification of the biochemical targets of polyalkyl guanidinium biocides.</a> Organic & Biomolecular Chemistry. 11, 4359-4366 (2013).</li>
<li>Alamgir, M., Erukova, V., Jessulat, M., Azizi, A., Golshani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical-genetic+profile+analysis+of+five+inhibitory+compounds+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Chemical-genetic profile analysis of five inhibitory compounds in yeast.</a> BMC Chem Biol. 10 (6), (2010).</li>
<li>Amberg, D. C., Burke, D., Strathern, J. N. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAmberg%2C+DC+%22Cold+Spring+Harbor+Laboratory.+Methods+In+Yeast+Genetics%3A+A+Cold+Spring+Harbor+Laboratory+Course+Manual%22">Cold Spring Harbor Laboratory. Methods In Yeast Genetics: A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring, NY. (2005).</li>
<li>Baryshnikova, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+genetic+array+%28SGA%29+analysis+in+Saccharomyces+cerevisiae+and+Schizosaccharomyces+pombe%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Synthetic genetic array (SGA) analysis in Saccharomyces cerevisiae and Schizosaccharomyces pombe.</a> Methods Enzymol. 470, 145-179 (2010).</li>
<li>Young, B. P., Loewen, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Balony%3A+a+software+package+for+analysis+of+data+generated+by+synthetic+genetic+array+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Balony: a software package for analysis of data generated by synthetic genetic array experiments.</a> BMC Bioinformatics. 14, 354(2013).</li>
<li>Wagih, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SGAtools%3A+one-stop+analysis+and+visualization+of+array-based+genetic+interaction+screens%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">SGAtools: one-stop analysis and visualization of array-based genetic interaction screens.</a> Nucleic Acids Res. 41, W591-W596 (2013).</li>
<li>Dittmar, J. C., Reid, R. J., Rothstein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ScreenMill%3A+a+freely+available+software+suite+for+growth+measurement%2C+analysis+and+visualization+of+high-throughput+screen+data%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">ScreenMill: a freely available software suite for growth measurement, analysis and visualization of high-throughput screen data.</a> BMC Bioinformatics. 11, 353(2010).</li>
<li>Longley, D. B., Harkin, D. P., Johnston, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-fluorouracil%3A+mechanisms+of+action+and+clinical+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">5-fluorouracil: mechanisms of action and clinical strategies.</a> Nat Rev Cancer. 3, 330-338 (2003).</li>
<li>Lum, P. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovering+modes+of+action+for+therapeutic+compounds+using+a+genome-wide+screen+of+yeast+heterozygotes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Discovering modes of action for therapeutic compounds using a genome-wide screen of yeast heterozygotes.</a> Cell. 116, 121-137 (2004).</li>
<li>Toussaint, M., Conconi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+and+sensitive+assay+to+measure+yeast+cell+growth%3A+a+bench+protocol+for+testing+genotoxic+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">High-throughput and sensitive assay to measure yeast cell growth: a bench protocol for testing genotoxic agents.</a> Nat Protoc. 1, 1922-1928 (2006).</li>
<li>Robinson, M. D., Grigull, J., Mohammad, N., Hughes, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FunSpec%3A+a+web-based+cluster+interpreter+for+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">FunSpec: a web-based cluster interpreter for yeast.</a> BMC Bioinformatics. 3, 35(2002).</li>
<li>Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+and+integrative+analysis+of+large+gene+lists+using+DAVID+bioinformatics+resources%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID bioinformatics resources.</a> Nat Protoc. 4, 44-57 (2009).</li>
<li>Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioinformatics+enrichment+tools%3A+paths+toward+the+comprehensive+functional+analysis+of+large+gene+lists%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Bioinformatics enrichment tools: paths toward the comprehensive functional analysis of large gene lists.</a> Nucleic Acids Res. 37, 1-13 (2009).</li>
<li>Hong, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+Ontology+annotations+at+SGD%3A+new+data+sources+and+annotation+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Gene Ontology annotations at SGD: new data sources and annotation methods.</a> Nucleic Acids Res. 36, D577-D581 (2008).</li>
<li>Fang, F., Hoskins, J., Butler, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-fluorouracil+enhances+exosome-dependent+accumulation+of+polyadenylated+rRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">5-fluorouracil enhances exosome-dependent accumulation of polyadenylated rRNAs.</a> Mol Cell Biol. 24, 10766-10776 (2004).</li>
<li>Baba, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+Escherichia+coli+K-12+in-frame%2C+single-gene+knockout+mutants%3A+the+Keio+collection%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Syst+Biol%22%5BJournal%5D)">Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: the Keio collection.</a> Mol Syst Biol. 2, 0008(2006).</li>
<li>Nichols, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+landscape+of+a+bacterial+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Phenotypic landscape of a bacterial cell.</a> Cell. 144, 143-156 (2011).</li>
<li>Dai, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+nucleosome+function%3A+a+highly+versatile+library+of+synthetic+histone+H3+and+H4+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Probing nucleosome function: a highly versatile library of synthetic histone H3 and H4 mutants.</a> Cell. 134, 1066-1078 (2008).</li>
</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

本文概述了一种生成化学-遗传相互作用谱的方法。该方法十分简便：通过比较全基因组基因敲除文库中每个菌株在有无化学物质存在条件下的菌落大小，即可鉴定出所有应对化学损伤所必需的基因。随后，对获得的敏感菌株列表进行注释富集分析，可进一步揭示该化学物质的作用机制。尽管本实验方案已针对酿酒酵母进行了优化，但也可适用于其他阵列式微生物基因敲除文库，例如大肠杆菌（E. coli）Keio文库，后者已成功用于研究数百种细胞扰动26,27。
在酵母及其他生物中进行化学遗传学分析已有成熟方法。大多数此类研究依赖于竞争性测定，通过微阵列分析或对独特的遗传条形码进行高通量测序来量化混合的缺失突变体。该方法已被证明在生成大规模化合物库的稳健化学遗传学谱方面非常成功。本文所述的方法为少量待测化合物的化学遗传学分析提供了一种有用的替代方案。该检测方法提供了一种简单的读出方式，成本低于高通量测序或微阵列分析，且不受序列偏好性的影响。尽管本方案中描述的实验流程需要使用机器人仪器进行菌落操作，但此类系统正变得越来越经济实惠；此外，也可对方案进行调整，改用手动打点工具，相关示例已包...

模式生物Saccharomyces cerevisiae中可用的遗传工具和资源，使得大规模的功能基因组学研究成为可能，这些研究共同揭示了基因如何以网络形式协同作用，以满足生物系统的需求。这些工具的核心是合作构建了酵母中所有开放阅读框的非必需基因缺失株的完整集合1,2。一个显著的发现是，在标准实验室条件下以单倍体形式培养时，仅有约20%的酵母基因对生存是必需的。这凸显了细胞通过利用替代的生物学通路来缓冲基因组扰动的能力。&#160;单独存在时可存活、但组合时致死的遗传突变体，提示了相互关联或汇聚的平行生物学通路，从而形成描述生物学功能的遗传相互作用网络。随着对必需基因的条件性&#160;温度敏感型和功能减弱等位基因的开发，该技术已不再局限于非必需基因的研究3,4。这一概念已被应用于全基因组尺度，生成了一张无偏倚的遗传相互作用图谱，直观展示了参与相似细胞过程的基因如何聚集在一起5。
化学扰动遗传网络可模拟基因缺失（图1）6。通过将抑制生长的化合物作用于高密度的缺失突变株阵列，筛选对化合物表现出超敏性的菌株，可获得化学-遗传相互作用谱，即识别出维持化合物耐受性所必需的一系列基因。与遗传相互作用类似，大规模化合物库筛选表明，具有相似作用机制的化合物会聚类在一起7。因此，通过建立某个化合物的化学-遗传相互作用谱，并将其与大规模合成遗传相互作用和化学遗传相互作用数据集进行比较，即可推断该化合物的作用机制8,9。
大规模化学遗传学筛选已通过条形码竞争测定法实现，该方法可同时检测数十种化合物。在此方法中，将汇集的敲除菌株群体进行培养 大规模 在含有化学物质的小体积培养基中连续培养数代。由于每个缺失突变株均携带独特的遗传条形码，因此可通过微阵列或高通量测序追踪缺失突变株文库中各个突变株的存活/生长情况10.
通过监测在含有生物活性化合物的固体琼脂平板上生长的物理排列突变株的菌落大小来推断其适合度，也是识别化学-遗传相互作用的有效方法11,12。该方法为基于竞争的筛选提供了成本效益高的替代方案，尤其适用于小规模化合物文库的检测。本文概述了一种在S. cerevisiae中生成化学-遗传相互作用列表的简单方法，该方法无需依赖分子生物学操作或相关基础设施。仅需酵母基因敲除文库、机器人或手动点样装置，以及可免费获取的图像分析软件即可完成。

<table><tbody><tr><td>酵母提取物</td><td>BioBasic</td><td>G0961</td><td>用于YEPD液体/固体培养基，加入至终浓度1%（w/v）</td></tr><tr><td>胰蛋白胨粉末</td><td>BD Biosciences</td><td>211820</td><td>用于YEPD液体/固体培养基，加入至终浓度2%（w/v）</td></tr><tr><td>右旋糖</td><td>Anachemia</td><td>31096-380</td><td>用于YEPD液体/固体培养基，加入至终浓度2%（w/v）&amp;#8212; 不可高压灭菌。配制20%的储存液，过滤除菌，待培养基高压灭菌后加入。</td></tr><tr><td>琼脂A</td><td>Bio Basic</td><td>FB0010</td><td>用于YEPD固体培养基，加入至终浓度2%（w/v）</td></tr><tr><td>G418</td><td>A.G. Scientific Inc.</td><td>G-1033</td><td>配制1,000倍储存液，浓度为200&amp;nbsp;mg/ml，溶于dH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O，过滤除菌。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>12孔板</td><td>Greiner Bio One</td><td>655180</td><td></td></tr><tr><td>5 ml 培养管</td><td>Evergreen Scientific</td><td>222-2376-080</td><td></td></tr><tr><td>10 cm 培养皿</td><td>VWR</td><td>25384-302</td><td></td></tr><tr><td>ROTOR HDA</td><td>Singer Instruments&amp;nbsp;</td><td>ROT-001</td><td>高通量微生物阵列点样机器人</td></tr><tr><td>PLUSPLATE&amp;copy; 培养皿</td><td>Singer Instruments&amp;nbsp;</td><td>PLU-001</td><td>每盒200个培养皿</td></tr><tr><td>384针短针RePad</td><td>Singer Instruments&amp;nbsp;</td><td>RP-MP-384</td><td>每盒1,000个垫片</td></tr><tr><td>1536针短针RePad</td><td>Singer Instruments&amp;nbsp;</td><td>RP-MP-1536</td><td>每盒1,000个垫片</td></tr><tr><td colspan="4">替代点样工具：</td></tr><tr><td>全自动机器人系统</td><td>S&amp;amp;P robotics</td><td>http://www.sprobotics.com</td><td>提供多种自动化菌落处理机器人及成像系统。</td></tr><tr><td>手动点样工具</td><td>V&amp;amp;P Scientific</td><td>http://www.vp-scientific.com</td><td>手持式复制工具及配件。&amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

快速鉴定化学遗传相互作用 酿酒酵母（saccharomyces cerevisiae）

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

确定生物活性化学物质的作用机制是广大学术界、制药界和工业界科学家关注的课题。 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae） 或称芽殖酵母，是一种模式真核生物，其约6,000个基因的完整基因敲除突变体库以及功能降低的必需基因突变体库均已商业化提供。这些突变体库可用于系统性地检测化学物质与基因之间的相互作用， 即 耐受某种化学物质所必需的基因。这些信息反过来揭示了该化合物可能的作用机制。本文描述了一种在出芽酵母中快速鉴定化学-遗传相互作用的实验方案。我们以化疗药物5-氟尿嘧啶（5-FU）为例演示该方法，其作用机制已有明确定义。我们的结果表明，在5-FU存在条件下，细胞增殖依赖于细胞核内的TRAMP RNA外切体复合物以及DNA修复酶，这与此前基于微阵列条形码技术的化学遗传学研究结果一致，也符合已知的5-FU对RNA和DNA代谢均产生不利影响的特性。本文还介绍了此类高通量筛选所需的验证实验流程。

为验证该方法，我们按照上述方案对化疗药物5-氟尿嘧啶（5-FU）进行了代表性化学遗传相互作用筛选。已知5-FU可干扰胸苷酸合成酶以及DNA和RNA的代谢18。5-FU的化学遗传相互作用已被广泛研究，并利用酵母条形码微阵列技术，结合杂合子和纯合子缺失菌株文库进行了系统分析8,19。本文结果表明，通过比较定量突变菌落大小也可获得类似结果。
需要注意的是，本实验所采用的筛选方法利用了非必需单倍体基因敲除文库。此类筛选也可使用二倍体菌株、温度敏感型突变体或功能减弱等位基因进行，从而能够包含必需基因突变体。使用单倍体敲除文库的一个优势在于，由于基因产物完全缺失，使得靶向通路对药物更为敏感。然而，其两个显著缺点是无法研究必需基因的超敏感性，且单倍体文库在多次传代过程中容易产生自发的抑制性突变，这些突变会被逐步筛选出来，从而导致文库质量下降。因此，在阵列的完整性与广度和药物效应敏感性之间存在固有的权衡。在选择最合适的突变体文库时，必须充分考虑这一因素，并根据具体应用需求做出决策。
首先，通过在逐渐...

本文介绍了一种在芽殖酵母中定义化学-遗传相互作用的经济高效方法。该方法基于酵母分子生物学的基本技术，非常适合对小到中等规模的化合物库及其他培养环境进行机制性研究。

快速鉴定化学遗传相互作用 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）

确定生物活性化学物质的作用机制是广大学术界、制药界和工业界科学家关注的重要课题。

本实验的总体目标是利用酵母细胞来确定某种目标化学物质所作用的生物学过程。首先需要测定该化学物质对酵母的剂量反应曲线。第二步是在亚致死浓度的化学物质条件下以及对照平板上，培养一套完整的酵母基因敲除菌株集合。接下来鉴定对这种化学物质高度敏感的酵母突变株。通过生物信息学分析该列表，以揭示所有耐受该化学物质所必需的基因。最后一步是在低通量条件下重复进行生物学重复实验。这可以验证所发现的化学物与基因之间的相互作用。最终，这种高通量化学遗传筛选方法可用于揭示细胞耐受目标化学物所依赖的基因产物及生物学通路。与现有的方法（如在液体培养基中对带条形码的突变体进行竞争性生长实验）相比，该技术的主要优势在于无需使用分子生物学技术。该方法有助于回答化学生物学领域的一些关键问题，例如一种新型小分子如何抑制真核细胞的生长。首先，通过在A-Y-E-P-D平板上划线接种BY 4 7 4 1细胞来制备过夜酵母培养物，并在30摄氏度下培养48小时，直至出现可见菌落。当菌落准备就绪时。通过挑取单菌落并接种于无菌容器中的5毫升YEPD液体培养基中，制备过夜液体培养物。然后在30摄氏度下持续旋转或振荡培养过夜。接着，制备含有不同浓度待测化学物质的固体琼脂培养基。为此，首先用合适的溶剂配制若干份目标化学物质的储备液，浓度为最终浓度的100倍。然后，针对每个待测浓度，将3毫升熔化的YEPD琼脂分装至若干无菌培养管中。将含有琼脂的试管置于55摄氏度的水浴中，以防止琼脂凝固。现在，针对每种待测试的化合物浓度，在13个浓度下，将100倍浓缩的化合物溶液加入到一份熔融琼脂培养基中，涡旋混匀2至3秒，然后从每支试管中吸取1毫升，分别加入12孔板中的两个重复孔内，于室温下静置过夜，使琼脂凝固。次日，取10毫升YEPD液体培养基，接种2微升过夜饱和培养的酵母菌液。然后取25微升该培养物，用移液器滴加到12孔鲸板各孔中含化学物质的琼脂上，使用无菌玻璃珠或无菌涂布棒均匀涂布。将平板置于火焰下晾干，随后在30°C条件下培养48小时。培养结束后，评估各孔中菌落的总数和大小。确定一种亚致死浓度的化合物，该浓度对生长的抑制不超过10%至15%，用于筛选实验。通过在含有每毫升200微克G418的16块YEPD琼脂平板上复制，保持每个平板384个菌落的密度。每三个月使用微生物阵列机器人系统或手动针印工具进行一次操作。将平板置于 4 摄氏度保存备用。然后配制 250 毫升 YEPD 琼脂培养基，其 G418 浓度与五块琼脂平板相同，并将平板置于平坦均匀的表面上，室温下静置过夜冷却。从 4 摄氏度的储存环境中取出含有基因敲除突变体文库的平板，使其恢复至室温。使用精细任务擦拭纸清除每个培养皿盖上形成的冷凝水，以防止水滴落在阵列上导致阵列突变体之间的交叉污染。使用微生物阵列点样机器人将缺失突变体阵列从每块培养皿384个菌落的密度，压缩至每块

rapid-identification-chemical-genetic-interactions-saccharomyces

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

化学遗传相互作用的快速鉴定<em&gt;酿酒酵母</em

我们已开发出全面且无偏倚的全基因组筛选方法，以研究基因-药物和基因-环境之间的相互作用。本文介绍了对这些突变体文库进行筛选的方法。...

条形码酵母文库的竞争性基因组筛选

系统性、大规模的合成遗传学（基因-基因或上位性）相互作用筛选可用于研究遗传冗余和通路间的串扰。本文中，我们介绍了一种高通量定量合成遗传阵列筛选技术，称为 eSGA，该技术由我们开发，用于阐明大肠杆菌（Escherichia...

绘制细菌功能网络与通路 大肠杆菌 使用合成遗传阵列

在本视频中，我们展示了改良的酵母单杂交实验方法，该方法可用于检测多种蛋白质与靶DNA的相互作用。转化后的酵母细胞在报告基因上游含有靶DNA序列，同时表达转录因子蛋白。当这些蛋白形成复合物并结合到靶DNA上时，报告基因将被表达，并可通过酶学方法进行检测。...

改良的酵母单杂交法检测异源蛋白复合物-DNA相互作用

我们描述了染色质内源性切割联合高通量测序技术（ChEC-seq），这是一种与染色质免疫沉淀（ChIP）正交的方法，利用微球菌核酸酶（MNase）融合蛋白在全基因组范围内定位蛋白质结合位点。...

全基因组范围内利用 ChEC-seq 技术在 Saccharomyces cerevisiae 中绘制蛋白质-DNA 相互作用图谱

我们介绍一种在裂殖酵母中进行的简单抑制子筛选方案。该方法高效且无需诱变，  选择性  用于  突变  经常  发生于   a  单个  基因组的  位点...

一种利用深度测序辅助的裂殖酵母Schizosaccharomyces pombe自发抑制子筛选方法

通过测序实现的相互半合子化（RH-seq）是一种强大的新方法，可用于定位物种间性状差异的遗传基础。该方法利用转座子诱变生成半合子池，并通过高通量测序结合竞争性生长来追踪其适合度。对所得数据的分析可精确定位控制该性状的基因。...

Saccharomyces 酵母物种间热耐受性差异的全基因组范围相互半合子分析遗传定位

细菌病原体将蛋白质分泌到宿主中，以靶向关键的生物学过程。确定细菌效应蛋白所靶向的宿主通路，是阐明分子致病机制的关键。本文介绍了一种利用改良的酵母抑制和毒性筛选方法，以揭示有毒细菌效应蛋白所靶向的宿主通路。...

利用酵母毒性及抑制子筛选鉴定细菌效应蛋白靶向的宿主通路

为了研究分子伴侣与分子伴侣之间以及分子伴侣与底物之间的相互作用，我们在秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis...

利用 Caenorhabditis elegans 筛选组织特异性分子伴侣相互作用

本文介绍了Grafix（梯度固定）技术的应用，该技术是在交联剂存在下进行甘油梯度离心，用于鉴定剪接体复合物上短暂结合的剪接因子之间的相互作用。...

利用Grafix技术检测瞬时相互作用蛋白 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae） 剪接体亚复合物

本研究描述了一种在裂殖酵母（Schizosaccharomyces...

遗传筛选鉴定裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）中的多拷贝抑制子

D-环捕获（DLC）和D-环延伸（DLE）实验利用邻近连接原理结合定量PCR，用于定量检测酿酒酵母（Saccharomyces...

同源重组中间体的检测 通过 邻近连接与定量 PCR 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）

学习利用酿酒酵母进行化学遗传相互作用的高通量筛选方法，通过鉴定化学敏感突变体揭示基因耐受机制。该方法无需分子生物学技术，适用于中小规模化合物库的功能研究。

快速鉴定化学遗传相互作用酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）

探索更多视频

快速鉴定化学遗传相互作用 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）

探索更多视频

快速鉴定化学遗传相互作用酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）