小鼠骨髓来源单核细胞的分离与静脉注射

您好，我叫Helen Kuster，我在MacBook的Auto Vica大学Harold博士的心血管研究团队工作并担任教授。我们的研究兴趣在于分离和鉴定海洋单核细胞，以将其用作促进侧支血管生长的载体。培养骨髓来源单核细胞需要完成以下主要步骤：首先是小鼠麻醉和颈椎脱位，其次是股骨的取出与冲洗。

骨髓的第三次过滤。第四步至第五步用培养基洗涤，第六步将细胞接种于超低吸附培养板中进行培养。第七步流式细胞术分析。

为了从骨髓中提取单核细胞，将使用异氟烷对小鼠进行麻醉，并通过颈椎脱位法实施安乐死。将小鼠固定后，用无菌手术刀分离双侧下肢。取出双侧股骨和胫骨，并用96%乙醇清洗至少90秒。

此后，所有步骤必须严格保持无菌，以避免污染。将从骨骼上去除肌肉或肌腱。股骨和胫骨用温热的 PBS 冲洗数次。

采集骨髓时，需使用精细剪刀剪开每根骨骼的近端和远端。为了冲洗骨骼，我们需要一支28 G的无菌针头、一支1毫升注射器，以及每根骨骼10至15毫升的培养基。随后，用精细镊子夹住骨骼，将骨髓通过一个70微米的滤网进行过滤。

逐一冲洗骨骼，直至其呈现半透明状。为尽量减少细胞应激，需小心地对注射器活塞施加压力。用PBS冲洗筛网。

随后，将细胞在室温下以 250 G 离心 10 分钟，并用培养基重新悬浮。此步骤需再重复一次。

对于从原代骨髓中获取的骨髓来源单核细胞，我们使用 M 199 培养基，添加 1% 青霉素和链霉素以及 10% 胎牛血清。此外，在培养的第一天加入 20 纳克/毫升 INE MCSF。在培养的最后一天，向培养基中加入 8 纳克/毫升干扰素-γ。

若需上调MHC II类分子，可将细胞接种于超低吸附培养板中，该培养板具有较深孔壁，可防止细胞永久性贴壁。我们采用的细胞浓度为每毫升1×10⁶个细胞，每孔最多加入6毫升。培养条件为37°C、5% CO₂，培养周期为5天。

在培养五天后，每天观察细胞，当60%至80%的细胞为单核细胞时即可。我叫Martin Bachner，是中国台湾Auto Fungi大学心脏病学、解剖学与年代学系的一名医学专业学生。进行静脉注射时，重要的是在实际操作前进行大量练习，否则将无法以适当的方式输注单核细胞。

实验表明，单核细胞在全身性给药时对改善人工血管生成最为有效。全身给药的常用方法是尾静脉注射。在本实验中，我们将250万个单核细胞重悬于氯化钠溶液中并进行注射。

小鼠尾部腹侧和背侧各有四根动脉，两侧各有两根静脉。因此，在进行尾动脉注射时，需要将尾部旋转约90度。为了操作更方便，应使用加热垫对小鼠预热约10分钟。

应通过保暖对动物进行观察。这对于识别过热迹象非常重要。此外，我们需要该感染剂以及装在一支一毫升胰岛素注射器上的30基因针头套装。

将动物小心地固定在固定器中，以便更方便地进行尾部注射。在将溶液装入注射器之前，确保小鼠有足够的呼吸空间。涡旋混匀单核细胞溶液，以确保所有单核细胞均可被注入。

对注射部位进行消毒以避免感染，用拇指和食指夹住尾巴。在最远端位置，以平角插入针头。若针头进入静脉，则很容易注入单核细胞溶液。

如果出现水疱，则表明注射操作有误。应立即停止并再次尝试。靠近近端时，务必缓慢注射，且每克组织注射量不得超过五微升（5 µL/g）。

如果注射成功，通过在注射部位施加轻柔压力约一分钟来止血。操作结束后，打开牵开器，将小鼠放回笼中以进行单核细胞表征。我们使用一组抗原组合来检测其效应，即 CD11b、F4/80、CD115 和 GL1。

这些抗原的表达与单核细胞发育阶段相关，可用于分析单核细胞。我们在第0、3、5和7天进行了检测，发现单核细胞纯度在第5天达到90%。要达到该纯度，关键在于有效去除滋养层巨噬细胞。

使用不含EDTA的洗涤缓冲液去除贴壁细胞。为了去除贴壁细胞，我们使用含有EDTA的洗涤缓冲液并进行轻柔吹打。该图显示了单层培养中的主要细胞类型。

图中所示的不同细胞类型包括：一为淋巴细胞，二为单核细胞，三为粒细胞，且在培养第五天后单核细胞纯度提高。注意，在培养过程中细胞组成的动态变化，此时细胞群体包括：一为单核细胞，二为巨噬细胞。

图二，分化过程中CD115表达的时间线。请注意，在分化五天后，超过95%的细胞为CD115阳性，表明绝大多数细胞为单核细胞或巨噬细胞。可通过细胞大小和颗粒度进行分类，但特异性细胞标志物更为可靠。

图三，单核细胞-巨噬细胞成熟度的增加。标志物 F4/80，第5天，注意出现一群具有中等 F4/80 表达水平的细胞群，符合单核细胞表型特征。第7天，注意 F4/80 表达向右偏移，符合巨噬细胞成熟过程。

单核细胞的分离对于许多体外和体内研究至关重要。这些细胞是一个引人关注的研究靶点，例如在与外周动脉疾病或冠心病等缺血相关疾病的研究中。通过用温热培养基冲洗活检小鼠的股骨和胫骨，收集骨髓；将细胞悬液补充M-CSF后，在超低吸附表面培养，以避免单核细胞因黏附而发生分化。在不同时间点，利用CD11b、CD115和FOXP3等标志物检测单核细胞的特性及其分化情况，以进行细胞表型鉴定。

如果需要进行全身性药物递送，静脉注射是一种简单且有效的给药方式。我们描述了一种简单且成本效益高的方法，用于从骨髓中分离大量MI单核细胞。通过这种新方法，我们能够每只小鼠获得约1100万个单核细胞。