Name: 隔离和小鼠骨髓的静脉注射单核细胞衍生 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 21 s
Description: 学习从小鼠骨髓中分离单核细胞的高效方法，用于心血管研究中的侧支血管生长实验。该技术可减少动物牺牲并降低实验成本，为转化医学研究提供可靠支持。

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本工作由德国研究基金会（DFG，Deutsche Forschungsgemeinschaft）SFB 854（Sonderforschungsbereich，合作研究中心）资助。
感谢德国马格德堡奥托·冯·格里克大学视听媒体中心的 Hans-Holger Gärtner 提供的技术支持。

本研究经萨克森州和萨克森-安哈尔特州德累斯顿/哈勒政府主席团批准进行，符合德国动物保护法第8条的规定（批准编号：24D-9168.11-1/2008-24）。
1 细胞分离
1.1 股骨和胫骨的制备
<ol>
	<li>使用封闭容器中汽化的 5% 异氟烷浓度对小鼠进行麻醉。当小鼠停止活动达 3 秒后，实施颈椎脱位。</li>
	<li>用 96% 乙醇对后肢进行消毒。使用无菌手术刀去除皮肤和肌肉，并分离骨骼。
	<ol>
		<li>从腹股沟处开始皮肤切口，沿内踝方向延伸切口，并在小腿下部周围进行环形皮肤解剖。通过从远端向近端剥离，完全去除腿部皮肤。</li>
		<li>用锋利的手术刀将股四头肌从股骨上分离，去除前腓骨肌群和腓肠肌群，并通过定位和解剖韧带，在髋关节处将腿部脱臼分离。</li>
		<li>从前侧开始，小心旋转腿部，环绕关节切断韧带，从而实现关节脱位。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用 96% 乙醇清洗股骨和胫骨，至少持续 90 秒，以确保无菌细胞制备。随后使用无菌 PBS 继续清洗，以去除残留的乙醇。 
	注意：所有后续步骤必须保持无菌，以避免污染。</li>
</ol>
1.2 骨髓的采集
<ol>
	<li>使用一把精细的剪刀剪去每根骨骼的近端和远端，以暴露股骨和胫骨干。操作时需格外小心，因为这些骨骼极易断裂。</li>
	<li>用预热的培养基（M199 + 10% 胎牛血清 (FCS)，+ 1% 青霉素/链霉素）冲洗骨骼。使用无菌的28号针头、1 ml 注射器，每根骨骼冲洗时使用10–15 ml培养基。</li>
	<li>用精细镊子夹住骨骼，逐根冲洗，直至骨骼变为半透明状。轻柔地推动注射器活塞，以尽量减少对细胞的损伤。</li>
	<li>将骨髓悬液通过70 µm尼龙滤网过滤，并收集滤液。为最大程度获取骨髓，需从骨骼的远端和近端反复冲洗。</li>
	<li>用PBS冲洗滤网，并收集滤液。通过轻柔搅拌和移液，小心去除残留碎片和细胞团块。</li>
</ol>
1.3 培养
<ol>
	<li>将细胞悬液在室温下以 250 × g 离心 10 分钟。弃去上清液，并用约 25 ml 培养基重悬细胞。重复一次。</li>
	<li>第二次洗涤后，用 6 ml 培养基重悬细胞。取 50 µl 细胞悬液与 50 µl 台盼蓝混合。在光学显微镜下使用计数板对细胞进行计数。使用以下公式计算溶液中的细胞数量： 
	<img alt="细胞浓度公式，细胞/毫升等于细胞计数除以 4µL 乘以 2 再乘以 10000。" fo:content-width="1.3in" src="/files/ftp_upload/52347/52347eq1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Equation 1"></li>
	<li>将细胞接种至 6 孔超低吸附表面培养板中，以防止细胞永久性贴壁。每毫升接种浓度为 106 个细胞，每孔最多加入 6 ml。</li>
	<li>在悬液中添加 20 ng/ml M-CSF，以促进细胞分化。</li>
	<li>将细胞在 37 °C 和 5% 二氧化碳条件下培养 5 天，并每日观察。</li>
</ol>
1.4 细胞的收获
注意：这些步骤应在冰上进行。根据情况选择执行 1.4.1 或 1.4.2。
<ol>
	<li>此时收获整个培养物，包括已分化并贴壁于培养板上的巨噬细胞，即使使用的是超低吸附表面的培养板。
	<ol>
		<li>通过轻柔吹打，使用 4 °C 的 PBS 缓冲液（含 0.5% 牛血清白蛋白（BSA）和 2 mM EDTA）进行重悬和消化，从而收获全部培养物。重复操作直至培养板上无残留贴壁细胞——若不确定，可在显微镜下确认。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>或者，通过收集含有悬浮细胞的上清液来弃去贴壁的巨噬细胞，此时上清液中主要含有单核细胞。
	<ol>
		<li>使用不含 EDTA 的 PBS 缓冲液（含 0.5% BSA）收集非贴壁细胞。操作时力度不宜过大，以避免将轻度贴壁的巨噬细胞一并脱落。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
1.5 流式细胞分析（可选）
注意：可以使用磁珠分选法（MACS）去除细胞悬液中的CD117+干细胞和祖细胞。请遵循试剂盒制造商提供的操作步骤进行该操作。
<ol>
	<li>根据步骤 1.4.1 或 1.4.2 收集细胞。</li>
	<li>在 4 °C 条件下以 250 × g 离心 10 分钟，收集细胞，并重复此步骤一次。</li>
	<li>每种探针至少将 250,000 个细胞重悬于 300 µl FACS 缓冲液中。</li>
	<li>将细胞悬液转移至 96 孔板（每孔 30 µl）。</li>
	<li>在 4 °C 条件下以 250 × g 将细胞悬液离心 5 分钟。</li>
	<li>弃去上清液，每孔加入 25 µl 抗体（使用厂家推荐的稀释比例）。</li>
	<li>使用抗体对细胞进行染色（在步骤 1.5.1–1.5.6 之后按照厂家说明书进行细胞表型鉴定）。常用于单核细胞/巨噬细胞鉴定的标记物包括 CD11b、F4/80（图 3）、CD115（图 2）和 Gr-1。 
	注意：关于细胞悬液的进一步描述，建议使用如 CD4、CD8a、CD11c、CD25、CD45、CD45R、CD62L、CD80、CD86、CD145、CD117、MHCⅡ、Ly6C、Ly6G 和 CD192 等标记物。细胞特征此前已有描述12。</li>
	<li>在 4 °C 条件下孵育探针 20 分钟。</li>
	<li>在 4 °C 条件下以 250 × g 离心探针 5 分钟，并用 200 µl FACS 缓冲液重悬，重复此步骤两次。</li>
	<li>将探针转移至 FACS 管中，并进行 FACS 分析12。</li>
	<li>在第 0、3 和 5 天进行 FACS 分析12，以分析细胞分化情况。</li>
</ol>
2. 尾静脉注射
2.1 准备
<ol>
	<li>将动物置于37 °C加热板上预热约10分钟。加热过程中观察动物，注意识别过热迹象。</li>
	<li>用150 µl NaCl重悬在步骤1.1–1.4中分离的单核细胞，并将细胞悬液转移至带30G针头的1 ml胰岛素注射器中。注射前轻轻涡旋混匀，以确保所有单核细胞均被注入。操作过程中细胞始终置于冰上，避免因受热导致单核细胞黏附和活化。</li>
</ol>
2.2 固定
<ol>
	<li>在选择小鼠进行静脉注射时，避免干扰笼中的其他小鼠。</li>
	<li>将小鼠放入固定器中。避免施加过大压力，并小心处理后肢。（图4） 
	注意：也可使用全身麻醉，以确保对动物的操作无应激。</li>
	<li>在关闭固定器前，确保小鼠有足够的呼吸空间。</li>
</ol>
2.3 注射
<ol>
	<li>用消毒剂对注射部位进行消毒。将消毒剂喷洒在小鼠尾部，静置至少1分钟。</li>
	<li>通过轻轻压迫注射部位上方尾部侧面，以阻断尾部静脉血流，从而更清晰地显示静脉。</li>
	<li>注射前将尾部旋转90度。（图5）</li>
	<li>以45度角进行注射。注射速度应缓慢，且每克体重不超过5 µl，以避免对动物造成伤害。</li>
	<li>若出现水疱，表明注射失败，应立即停止操作，并在更靠近近端的位置重新注射。</li>
	<li>在注射部位施加轻柔压力约1分钟，以止血。</li>
	<li>操作结束后，打开牵开器，将小鼠放回笼中。</li>
	<li>观察小鼠20分钟，确保其未因注射受到伤害且保持胸骨卧姿。根据需要延长观察时间，直至小鼠恢复足够的意识。只有在小鼠完全恢复后，方可将其与其他动物放在一起。</li>
</ol>

<ol><li>Herold, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+monocytes%3A+a+novel+strategy+for+in+vivo+augmentation+of+collateral+vessel+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Transplantation of monocytes: a novel strategy for in vivo augmentation of collateral vessel growth.</a> Hum Gene Ther. 15 (1), 1-12 (2004).</li>
<li>Herold, J., Tillmanns, H., Xing, Z., Strasser, R. H., Braun-Dullaeus, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+transduction+of+monocytes%3A+promising+vehicles+for+therapeutic+arteriogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Langenbecks+Arch+Surg%22%5BJournal%5D)">Isolation and transduction of monocytes: promising vehicles for therapeutic arteriogenesis.</a> Langenbecks Arch Surg. 391 (2), 72-82 (2006).</li>
<li>Francke, A., Weinert, S., Strasser, R. H., Braun-Dullaeus, R. C., Herold, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+bone+marrow+derived+monocytes%3A+a+novel+approach+for+augmentation+of+arteriogenesis+in+a+murine+model+of+femoral+artery+ligation%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+Of+Translational+Research%22%5BJournal%5D)">Transplantation of bone marrow derived monocytes: a novel approach for augmentation of arteriogenesis in a murine model of femoral artery ligation.</a> American Journal Of Translational Research. 5 (2), 155-169 (2013).</li>
<li>Leon, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cell+differentiation+potential+of+mouse+monocytes%3A+monocytes+represent+immediate+precursors+of+CD8-+and+CD8%2B+splenic+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Dendritic cell differentiation potential of mouse monocytes: monocytes represent immediate precursors of CD8- and CD8+ splenic dendritic cells.</a> Blood. 103 (7), 2668-2676 (2004).</li>
<li>Timmerman, J. M., Levy, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cell+vaccines+for+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Med%22%5BJournal%5D)">Dendritic cell vaccines for cancer immunotherapy.</a> Annu Rev Med. 50, 507-529 (1999).</li>
<li>Salem, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+dendritic+cells+for+Peptide-based+vaccination+in+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">The use of dendritic cells for Peptide-based vaccination in cancer immunotherapy.</a> Methods Mol Biol. 1139, 479-503 (2014).</li>
<li>Timmerman, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Idiotype-pulsed+dendritic+cell+vaccination+for+B-cell+lymphoma%3A+clinical+and+immune+responses+in+35+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Idiotype-pulsed dendritic cell vaccination for B-cell lymphoma: clinical and immune responses in 35 patients.</a> Blood. 99 (5), 1517-1526 (2002).</li>
<li>Berthold, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+human+monocytes+by+Ficoll+density+gradient+centrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22Blut%22%5BJournal%5D)">Isolation of human monocytes by Ficoll density gradient centrifugation.</a> Blut. 43 (6), 367-371 (1981).</li>
<li>Houthuys, E., Movahedi, K., De Baetselier, P., Van Ginderachter, J. A., Brouckaert, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+the+isolation+and+purification+of+mouse+peripheral+blood+monocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">A method for the isolation and purification of mouse peripheral blood monocytes.</a> Journal Of Immunological Methods. 359 (1-2), 1-10 (2010).</li>
<li>Seeger, F. H., Tonn, T., Krzossok, N., Zeiher, A. M., Dimmeler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+isolation+procedures+matter%3A+a+comparison+of+different+isolation+protocols+of+bone+marrow+mononuclear+cells+used+for+cell+therapy+in+patients+with+acute+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22European+Heart+Journal%22%5BJournal%5D)">Cell isolation procedures matter: a comparison of different isolation protocols of bone marrow mononuclear cells used for cell therapy in patients with acute myocardial infarction.</a> European Heart Journal. 28 (6), 766-772 (2007).</li>
<li>Auffray, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CX3CR1%2B+CD115%2B+CD135%2B+common+macrophage%2FDC+precursors+and+the+role+of+CX3CR1+in+their+response+to+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+Of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">CX3CR1+ CD115+ CD135+ common macrophage/DC precursors and the role of CX3CR1 in their response to inflammation.</a> The Journal Of Experimental Medicine. 206 (3), 595-606 (2009).</li>
<li>Francke, A., Herold, J., Weinert, S., Strasser, R. H., Braun-Dullaeus, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+mature+murine+monocytes+from+heterogeneous+bone+marrow+and+description+of+their+properties%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Generation of mature murine monocytes from heterogeneous bone marrow and description of their properties.</a> J. Histochem. Cytochem. 59 (9), 813-825 (2011).</li>
<li>Sneider, E. B., Nowicki, P. T., Messina, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regenerative+medicine+in+the+treatment+of+peripheral+arterial+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Of+Cellular+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Regenerative medicine in the treatment of peripheral arterial disease.</a> Journal Of Cellular Biochemistry. 108 (4), 753-761 (2009).</li>
<li>Van Royen, N., Piek, J. J., Schaper, W., Fulton, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+critical+review+of+clinical+arteriogenesis+research%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Coll+Cardiol%22%5BJournal%5D)">A critical review of clinical arteriogenesis research.</a> J Am Coll Cardiol. 55 (1), 17-25 (2009).</li>
<li>Lawall, H., Bramlage, P., Amann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+of+peripheral+arterial+disease+using+stem+and+progenitor+cell+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vasc+Surg%22%5BJournal%5D)">Treatment of peripheral arterial disease using stem and progenitor cell therapy.</a> J Vasc Surg. 53 (2), 445-453 (2011).</li>
<li>Herold, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tetanus+toxoid-pulsed+monocyte+vaccination+for+augmentation+of+collateral+vessel+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Heart+Association%22%5BJournal%5D)">Tetanus toxoid-pulsed monocyte vaccination for augmentation of collateral vessel growth.</a> Journal of the American Heart Association. 3 (2), e000611(2014).</li>
</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

我们介绍一种简单且经济高效的方法，可从骨髓中分离出大量小鼠单核细胞。与其他使用外周血的方法相比，该方法获得的单核细胞产量更高：传统方法的单核细胞产量5为1.4 × 106，而本方法可从单只供体小鼠获得11 × 106 ± 3 × 106个单核细胞。
在考虑该方法的挑战时，必须指出在非无菌条件下操作可能带来的污染风险。如果冲洗及后续洗涤步骤未正确执行，很可能导致细菌和真菌污染。此外，骨髓包含由粒细胞、淋巴细胞和红系细胞组成的异质性细胞悬液。通常情况下，由于缺乏生长因子，这些细胞在培养的第2至第3天会逐渐消失。在生长因子诱导分化后，巨噬细胞成为主要的污染来源。为了降低巨噬细胞的数量并尽量减少单核细胞向巨噬细胞的分化，使用超低吸附培养板以及上述的洗涤步骤至关重要。
很难找到一种仅特异性表达于单核细胞的标志物。由于不同标志物之间存在干扰，因此需要同时使用多种标志物，且在分析细胞悬液时，细胞的粒度和大小存在变异性。图1-3</stro...

单核细胞的分离对于许多研究至关重要 体外 和 体内 研究。这些细胞是外周动脉疾病、冠心病或其他缺血性疾病的靶细胞，因为侧支血管的生长主要由局部炎症驱动。炎症反应包括内皮细胞活化以及白细胞（主要是单核细胞）的局部募集，单核细胞随后成熟为巨噬细胞，并通过分泌多种生长因子，诱导小动脉重塑为功能性的侧支动脉，从而形成高度促动脉生成的微环境。1-3单核细胞还可分化为树突状细胞，后者常用于免疫学研究4,5 以及癌症研究6,7.
从外周血中分离单核细胞的方法存在一个难题8：大多数分析需要足够数量的单核细胞，因此需要大量供体动物。以往的实验方案描述了密度梯度离心和通过MACS9进行细胞耗竭等单核细胞分离方法；然而，这些技术可能改变单核细胞的特性和功能，从而导致结果解释困难10,11。此外，这些方法操作复杂，并可能降低实验的可重复性。
本实验方案旨在提供一种简单且经济高效的方法，以大量获取骨髓来源的单核细胞。由于该方法可获得高达 11 × 106 ± 3 × 106 个细胞的产量，因此在分离骨髓来源单核细胞过程中，可显著减少所需实验小鼠的数量。该操作流程耗时短，且无需使用上述昂贵或复杂的实验技术。在此，我们从小鼠供体的原代骨髓悬液中提取单核细胞，将悬液接种于超低吸附培养板中，并在培养液中添加 20 ng/ml 的 M-CSF。培养至第 5 天时，收集细胞并进行表征分析，以确认其功能特性与表型特征。
在动脉生成研究领域，将这些骨髓来源的单核细胞静脉移植到小鼠体内是一种有效的全身药物递送方法，可与股动脉结扎结合，用于常见的外周动脉疾病模型。

<table><tbody><tr><td>6孔超低吸附培养板</td><td>康宁公司，纽约，美国</td><td></td><td>6孔超低吸附培养板，带盖，无菌</td></tr><tr><td>8至12周龄雄性BALB/c小鼠&amp;nbsp;</td><td>Charles River，德国苏尔茨菲尔德</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96孔板</td><td>Greiner bio one有限公司，德国弗里肯豪森</td><td></td><td></td></tr><tr><td>蓝色死细胞染料</td><td>德国达姆施塔特 Life technologies GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>GE Healthcare，德国弗赖堡</td><td></td><td>V组分，pH 7.0</td></tr><tr><td>导管</td><td>B. Braun，美尔松根股份公司，德国美尔松根</td><td></td><td>28G，30G</td></tr><tr><td>CD115</td><td>eBioscience，美国加利福尼亚州圣地亚哥</td><td>12-1152</td><td></td></tr><tr><td>CD11b</td><td>eBioscience，美国加利福尼亚州圣地亚哥</td><td>53-0112</td><td></td></tr><tr><td>细胞培养皿</td><td>Greiner Bio-One GmbH，德国弗里肯豪森</td><td></td><td>盖上盖子，灭菌</td></tr><tr><td>离心</td><td>贝克曼库尔特有限公司，克雷费尔德，德国</td><td></td><td>阿莱格拉&amp;reg; X-15R 离心机</td></tr><tr><td>脱毛膏</td><td>维特，曼海姆，德国</td><td></td><td></td></tr><tr><td>消毒剂</td><td>Sch&amp;uuml;lke&amp;amp;Mayr GmbH，德国诺德施泰特</td><td></td><td>Kodan Tinktur forte</td></tr><tr><td>一次性手术刀10号&amp;nbsp;</td><td>Feather安全剃刀有限公司，大阪，日本&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma Aldrich，德国汉堡</td><td></td><td></td></tr><tr><td>乙醇 96%&amp;nbsp;</td><td>Otto Fischar GmbH und Co KG，萨尔布吕肯&amp;uuml;肯岑，德国</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipetus 提取装置</td><td>Hirschmann Laborger&amp;auml;te GmbH &amp;amp; Co.KG，埃伯施塔特，德国</td><td></td><td></td></tr><tr><td>F4/80</td><td>AbD Serotec, D&amp;uuml;德国杜塞尔多夫</td><td>MCA497APC</td><td></td></tr><tr><td>FACS 缓冲液&amp;nbsp;</td><td>由本课题组利用单一组分制备而成</td><td></td><td>PBS，0.5% BSA，0.1% NaN&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>FACS 仪器</td><td>美国新泽西州富兰克林莱克，贝克顿·迪金森公司</td><td></td><td>BD FACS Canto II</td></tr><tr><td>FACS 管&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Becton, Dickinson and Company，美国新泽西州弗兰克林湖</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Falcon&amp;reg; 移液器</td><td>美国纽约贝克顿·迪金森实验器材公司</td><td></td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Sigma Aldrich，德国汉堡</td><td></td><td></td></tr><tr><td>精细镊子</td><td>鲁比斯，斯塔比奥，瑞士</td><td></td><td></td></tr><tr><td>手套</td><td>R&amp;ouml;sner-Matby Meditrade GmbH，德国基弗斯费尔登</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gr1</td><td>eBioscience，美国加利福尼亚州圣地亚哥</td><td>53-5931</td><td></td></tr><tr><td>加热板&amp;nbsp;</td><td>Labotect GmbH, G&amp;ouml;德国哥廷根&amp;nbsp;</td><td></td><td>加热板 062</td></tr><tr><td>培养箱</td><td>Ewald Innovationstechnik GmbH，德国巴特嫩多夫</td><td></td><td>Incu safe</td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>Baxter Deutschland GmbH，Unterschleißheim&amp;szlig;德国海姆</td><td></td><td></td></tr><tr><td>光学显微镜</td><td>卡尔·蔡司 SMT 有限公司，奥伯科亨，德国</td><td></td><td>Axiovert 40 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>巨噬细胞集落刺激因子</td><td>Sigma Aldrich，德国汉堡</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/srp3110?lang=de&amp;amp;region=DE">SRP3110&amp;nbsp;&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>机械振荡器</td><td>IKA，德国施陶芬</td><td></td><td>ms2 微型振荡器</td></tr><tr><td>Medium 199</td><td>PAA实验室有限公司，奥地利帕兴</td><td></td><td>37℃预热 &amp;deg;使用前将水浴锅预热至 C</td></tr><tr><td>微量离心管</td><td>Eppendorf AG，德国汉堡</td><td></td><td></td></tr><tr><td>微生物操作台</td><td>Thermo Electron，LED GmbH，德国兰根塞尔博德</td><td></td><td>Hera 安全</td></tr><tr><td>单核细胞洗涤缓冲液&amp;nbsp;</td><td>由本课题组利用单一组分制备而成</td><td></td><td>PBS、0.5% BSA、2 mM EDTA</td></tr><tr><td>小鼠固定器</td><td>各种</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Berlin Chemie AG，德国柏林</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaN&lt;sub&gt;3 &lt;/sub&gt;（乙酸钠）</td><td>Sigma Aldrich，德国汉堡</td><td></td><td></td></tr><tr><td>血细胞计数板</td><td>Paul Marienfeld GmbH und Co.KG, Lauda-K&amp;ouml;尼格斯霍芬，德国</td><td></td><td></td></tr><tr><td>尼龙细胞筛</td><td>美国新泽西州富兰克林莱克斯，贝克顿·迪金森公司</td><td></td><td>细胞滤网，70 &amp;micro;m 网孔尺寸</td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>Sigma Aldrich，德国汉堡</td><td></td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液</td><td>德国达姆施塔特 Life technologies GmbH</td><td></td><td>pH 7.4，无菌</td></tr><tr><td>移液器</td><td>Eppendorf AG，德国汉堡</td><td></td><td>10&amp;micro;升/100&amp;micro;l/200&amp;micro;l/1,000&amp;micro;l</td></tr><tr><td>移液头</td><td>Eppendorf AG，德国汉堡</td><td></td><td></td></tr><tr><td>血清移液管</td><td>Greiner Bio-One GmbH，德国弗里肯豪森</td><td></td><td>Cellstar 5 ml，10 ml</td></tr><tr><td>负压吸引装置</td><td>Integra bioscience，Fernwald，德国</td><td></td><td>Vacusafe comfort</td></tr><tr><td>手术剪</td><td>Word Precision Instruments, Inc.，美国萨拉索塔</td><td></td><td></td></tr><tr><td>注射器</td><td>B. Braun，美尔松根股份公司，德国美尔松根</td><td></td><td>1 ml Omnifix&lt;sup&gt;&amp;reg; &lt;/sup&gt;- 1 mL 胰岛素注射器</td></tr><tr><td>带盖试管</td><td>德国弗里肯豪森，Greiner bio one 公司</td><td></td><td>15 ml/50 ml Cellstar 管</td></tr><tr><td>温水浴</td><td>Julabo Labortechnik GmbH，Seelbach，德国</td><td></td><td>Julabo SW22</td></tr></tbody></table>

小鼠骨髓来源单核细胞的分离与静脉注射

Isolation and Intravenous Injection of Murine Bone Marrow Derived Monocytes

作为白细胞的一个亚型以及巨噬细胞的前体细胞，单核细胞参与了机体的多种重要生理过程，常成为生物医学科学多个领域的研究对象。下述方法是一种从异质性骨髓中分离小鼠单核细胞的简单有效手段。
通过用磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗Balb/c小鼠的股骨和胫骨获取骨髓。细胞悬液中添加巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF），并在超低吸附表面培养，以避免单核细胞因黏附而发生分化。在不同时间点对单核细胞的特性和分化情况进行表征。采用荧光激活细胞分选（FACS）技术，结合CD11b、CD115和F4/80等标记物进行表型分析。培养结束时，悬液中单核细胞比例为45%±12%。通过去除黏附的巨噬细胞，纯度可提高至86%±6%。分离后，单核细胞可用于多种实验，其中最有效且常用的方法之一是 体内 给药方式为尾静脉注射。 
这种分离与应用技术对于小鼠模型研究具有重要意义，特别是在炎症或免疫学领域。单核细胞也可用于小鼠疾病模型的治疗研究。

从小鼠骨髓中提取的细胞悬液包含多种细胞类型。主要的细胞类型包括淋巴细胞、粒细胞和单核细胞。细胞类型的鉴定可通过细胞大小和颗粒度进行估计，图1展示了原始悬液以及分化培养5天后收获的细胞的相应结果。请注意培养过程中细胞组成的动态变化。然而，对细胞群体进行准确分类必须依赖于特异性细胞标志物的表达特征。
用于鉴定单核吞噬细胞系统（MPS）细胞的最重要标志物是 CD115，它作为 M-CSF 受体发挥作用，并特异性地表达于单核前体细胞、单核细胞和巨噬细胞上。因此，该标志物可能不适用于区分 MPS 的不同亚群，但可用于可靠地评估向单核细胞/巨噬细胞谱系分化的细胞绝对数量。有关 CD115 在分化过程中表达的时间进程，请参见图 2。
成熟标志物 F4/80 可用于区分幼稚单核细胞、成熟单核细胞和巨噬细胞。与不表达该标志物的幼稚单核细胞前体相比，巨噬细胞表现出强烈的 F4/80 表达。成熟单核细胞则呈现中等水平的 F4/80 表达。因此，联合使用 CD115 和 F4/80 ...

本文介绍一种从小鼠异质性骨髓中大量生成单核细胞的实验方案，适用于转化医学研究。与其他方法相比，该新方法通过避免使用高梯度磁性细胞分选（MACS）等昂贵技术，减少了实验动物的使用数量并降低了成本。

作为白细胞的一个亚型以及巨噬细胞的前体细胞，单核细胞参与机体多种重要生理过程，常是……的研究对象

大家好，我叫Helen Kuster，我在MacBook的Auto Vica大学担任Harold博士心血管研究团队的研究员及教授。我们的研究致力于分离和鉴定海洋单核细胞，并将其用作促进侧支血管生长的载体。培养骨髓来源单核细胞需经过以下几个主要步骤：首先是小鼠麻醉和颈椎脱位，其次是股骨的取出与冲洗。骨髓的第三次过滤。第四步至第五步用培养基洗涤，第六步将细胞接种于超低吸附培养板中进行培养。第七步流式细胞术分析。为了从骨髓中提取单核细胞，将使用异氟烷对小鼠进行麻醉，并通过颈椎脱位法实施安乐死。将小鼠固定后，用无菌手术刀分离双侧下肢。取出双侧股骨和胫骨，并用96%乙醇清洗至少90秒。此后，所有步骤必须严格保持无菌，以避免污染。需将肌肉或肌腱从骨骼上剥离。股骨和胫骨用温热的 PBS 冲洗数次。采集骨髓时，使用一把精细剪刀剪开每根骨骼的近端和远端。为了冲洗骨骼，我们需要一根28 G的类固醇注射针头、一个1毫升的注射器，以及每根骨骼10至15毫升的培养基。随后，用精细镊子夹住骨骼，将骨髓通过一个70微米的滤器进行过滤。逐一冲洗骨骼，直至其呈现半透明状。为尽量减少细胞应激，需小心地对注射器的推柄施加压力。用PBS冲洗筛网。随后，细胞在室温下以 250 G 离心 10 分钟，并用培养基重新悬浮。完成此步骤后，重复操作一次。对于从原代骨髓中分离的骨髓来源单核细胞，我们使用含1%青霉素和链霉素以及10%胎牛血清的M199培养基。此外，在培养的第一天，向培养基中添加20纳克/毫升的INE MCSF。在培养的最后一天，向培养基中添加8纳克/毫升的干扰素γ。若需上调MHC II类分子，可将细胞接种至超低吸附培养板中，该培养板具有较深孔壁，可防止细胞永久性黏附于底部。我们采用每毫升含1×10⁶个细胞的浓度，每孔最多加入6毫升。培养条件为37°C、5% CO₂，培养周期为5天。在培养五天后，每天观察细胞，当单核细胞比例达到60%至80%时即可。我叫Martin Bachner，是Auto Fungi大学心内科、肛肠科和时序学系的一名医学博士生。进行静脉注射时，务必在实际操作前进行大量练习，否则将无法以适当的方式输注单核细胞。实验表明，单核细胞在全身性给药时对改善人工血管生成最为有效。全身给药的常用方法是尾静脉注射。在本实验中，我们将250万个单核细胞重悬于氯化钠溶液中并进行注射。小鼠尾部腹侧和背侧各有四条动脉，两侧各有两条静脉。因此，在进行尾动脉注射时，需要将尾部旋转约90度。为了操作更方便，应使用加热垫对小鼠预热约10分钟。应通过保暖对动物进行观察。这对于识别过热迹象非常重要。此外，我们需要这种感染性病原体以及装在一支一毫升胰岛素注射器上的30号针头。将动物小心地固定在固定器中，以便更方便地进行尾部注射。在将溶液装入注射器之前，确保小鼠有足够的空间呼吸。涡旋混匀单核细胞溶液，以确保所有单核细胞均可被注入。消毒注射部位以避免感染，用拇指和食指夹住小鼠尾巴。在最远端位置，以平角插入针头。若针头置于静脉内，则很容易注入单核细胞溶液。如果出现水疱，则表明注射操作有误。应立即停止并重新尝试。靠近身体近端时，务必缓慢注射，且每克组织注射量不得超过五微升（5 µL/g）。如果注射成功，通过轻压注射部位约一分钟以止血。操作结束后，打开牵开器，将小鼠放回笼中以表征单核细胞。我们使用一组抗原组合来检测其效应，即 CD11b、F4/80、CD115 和 GL1。这些抗原的表达与单核细胞发育阶段相关，可用于分析单核细胞。我们在第0、3、5和7天进行了检测，发现单核细胞纯度在第5天时可提高至90%。要达到该纯度，关键在于有效耗竭滋养层巨噬细胞。使用不含EDTA的洗涤缓冲液去除非滋养层细胞。为了去除滋养层细胞，我们采用含有EDTA的洗涤缓冲液并进行轻柔吹打。该图显示了单层培养中的主要细胞类型。图中所示的不同细胞类型包括：一、淋巴细胞，二、单核细胞，三、粒细胞，在培养第五天后单核细胞纯度提高。注意：在培养过程中细胞组成的动态变化，细胞群体包括：一、单核细胞和二、巨噬细胞。图二，分化过程中CD115表达的时间线。请注意，在分化五天后，超过95%的细胞为CD115阳性，表明绝大多数细胞为单核细胞或巨噬细胞。可通过细胞大小和颗粒度进行分类，但特异性细胞标志物更为可靠。图三，单核细胞-巨噬细胞成熟度的增加。F4/80标记物，第5天，注意出现一群F4/80中等表达的细胞群，符合单核细胞表型特征。第7天，注意F4/80表达向右偏移，符合巨噬细胞成熟特征。单核细胞的分离对于许多体外和体内研究至关重要。这些细胞是一个重要的研究对象，例如在与外周动脉疾病或冠心病等缺血相关疾病的研究中。通过用温热培养基冲洗活检小鼠的股骨和胫骨，收集骨髓细胞悬液，并添加M-CSF，在超低吸附表面进行培养，以避免单核细胞因黏附而发生分化。在不同时间点通过CD11b、CD115和FOXP3等标志物检测单核细胞的特性及其分化情况，以对细胞进行表型鉴定。如果需要进行全身性药物递送，静脉注射是一种简便且有效的给药方式。我们描述了一种简单且成本效益高的方法，用于从骨髓中分离大量MI单核细胞。通过这一新方法，我们能够每只小鼠获得约1100万个单核细胞。

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科研

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Immunology and Infection

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