评估可燃性烟草产品制剂细胞毒性和免疫抑制作用的方法

本实验的总体目标是评估烟草制品制备物对PBMCs细胞因子分泌及其杀伤靶细胞能力的影响。首先，用全烟雾条件培养基、普通培养基或尼古丁处理培养的PBMCs，随后对处理后的PBMCs进行胞内染色，以检测其细胞因子的产生情况。或者，将CFSE标记的K562细胞与经全烟雾条件培养基处理的PBMC效应细胞共培养，并通过7-AAD染色对K562细胞的存活率进行定量分析。

最终，通过流式细胞术检测任一检测方法中可燃烟草制品处理对P BMCs的影响。与现有的铬释放实验或ALI斑点法等方法相比，本方法的主要优势在于通量高、无需使用放射性物质，并且能够检测细胞功能。尽管该方法可为烟草制品处理的生物学效应提供深入见解。

它还可用于评估其他影响PBMC效应细胞的类Toll样受体介导功能和STIC功能的化合物。在开始染色程序之前，将全烟气条件培养基和尼古丁用RPMI完全培养基稀释至所列浓度，总体积为每孔100微升，加入96孔板中。

然后每孔加入100 µL悬浮于完全培养基中的P BMCs，细胞浓度为每孔1 × 10⁶个细胞，最终每孔总体积为200 µL。接着盖好培养板，于37°C及5% CO₂条件下孵育。3小时后，洗涤细胞并吸除上清液。

然后再次盖上培养板并涡旋震荡，以充分分散沉淀。细胞再清洗两次，第二次清洗时先用冰上预冷的运行缓冲液，再用完全培养基。随后每孔加入200微升补充了高尔基体阻断剂（Golgi plug）和LPS的完全培养基，在37°C、5%CO₂条件下处理6小时。

然后用预冷的缓冲液洗涤细胞，在20分钟后，每孔加入100微升细胞固定液（cyto fix），于4摄氏度处理；随后用预冷的透化洗涤液（perm wash）洗涤细胞三次。接着每孔加入45微升细胞透化液（cyto perm），再分别加入5微升所列的每种抗体。在4摄氏度孵育30分钟后，洗涤细胞三次，并将细胞固定于200微升预冷的2%多聚甲醛（para formaldehyde）中。

然后将细胞转移至12 mm × 75 mm的试管中，并在流式细胞仪上分析样品。在按上述方法制备好经烟草产品处理的PBMC培养板后，洗涤一培养物为K 5 62细胞的培养物，该细胞在10 mL DPBS中收获，汇合度为80%。将细胞沉淀重悬于5 mL DPBS中，并进行细胞计数。

然后将1毫升新配制的CFSE工作液加入含有1×10⁷至2×10⁷个K562细胞的1毫升完全培养基中，并通过涡旋振荡充分混匀细胞染料。室温孵育恰好2分钟后，加入200微升FBS，再次涡旋振荡混匀细胞，并继续孵育2分钟。第二次孵育结束后，用10毫升完全培养基洗涤细胞，然后将细胞沉淀重悬于另10毫升完全培养基中，并进行细胞计数。

现在将经烟草处理的PBMCs离心，并倾去上清液。然后盖上盖子，通过涡旋振荡重悬细胞，并用每孔200 µL完全培养基洗涤。为启动杀伤实验，按1:15的比例将CFSE标记的K562细胞加入PBMCs中，在37°C及5% CO2条件下孵育共培养体系。

孵育5小时后，离心收集细胞并弃去上清液。通过涡旋振荡重悬沉淀，然后每孔用200 µL运行缓冲液洗涤细胞，随后每孔加入95 µL运行缓冲液，再加入5 µL 7AAD，使每孔总体积为100 µL。最后将细胞在室温避光条件下孵育15分钟。

然后向每个孔中加入 100 µL 跑胶缓冲液，并将全部体积转移至相应的 Fax 管中，以确定七AAD 和 CFSE 阳性细胞的百分比。通过流式细胞术分析发现，在 24 小时时，全烟雾条件培养基处理组呈现出剂量依赖性的细胞死亡增加，在每毫升等效尼古丁单位为 4 µg/mL 时，接近 80% 的细胞死亡。然而，在 24 小时时间点，使用每毫升等效尼古丁单位为 5 µg/mL 的全烟雾条件培养基处理 pBMCs 仅 3 小时，并未引起显著的细胞毒性。

在3小时暴露于3000微克/毫升尼古丁处理前，未观察到相当程度的细胞死亡；在全烟条件培养基中，尼古丁处理在浓度达到2000微克/毫升之前不会引起可测量的细胞死亡。在全烟条件培养基中分别加入尼古丁，随后通过LPS刺激TLR4受体，导致分泌型细胞因子呈剂量依赖性减少，尽管不同细胞因子的抑制程度存在差异。此外，当细胞与LPS和高尔基体阻断剂共处理仅6小时后，与单纯尼古丁暴露相比，在较低的等效尼古丁单位浓度下暴露于全烟条件培养基，即可观察到细胞内细胞因子阳性细胞数量减少。

事实上，该杀伤实验的结果表明，与对照组及较低剂量组相比，效应PBMC群体暴露于每毫升1.56微克的全烟雾条件培养基后，其杀伤能力显著下降。而无论高浓度还是低浓度的尼古丁处理，在进行这些实验操作时均未影响效应PBMC群体的杀伤能力。在进行CFSE标记以及抗体稀释、标记时间和孵育温度等步骤时，必须做到精确。

观看本视频后，您应该能够充分理解如何在流式细胞术中利用抗体标记技术，以确定烟草制品制备物或其他处理方式对外周血单个核细胞的影响。