Name: 方法评估细胞毒性的可燃烟草产品的准备和免疫抑制 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-10T16:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 25 s
Description: 了解如何使用流式细胞术评估可燃烟草制品对人外周血单个核细胞细胞因子分泌及靶细胞杀伤功能的影响。该方法为研究烟草暴露的免疫抑制效应提供了高通量、非放射性的检测手段。

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本工作由雷诺烟草公司（RJRT）资助，资助项目为雷诺烟草公司与维克森林大学医学院之间的合作研究协议。G.L. Prasad 是 RJRT 的全职员工。

注意：根据良好临床实践要求，在机构审查委员会（IRB）批准的当地临床研究单位获得了开展本研究的书面知情同意。血液处理、外周血单个核细胞（PBMC）的分离及其他细胞培养实验均在无菌条件下进行，使用微生物学上无菌的耗材和试剂。
1. WS-CM 的制备
<ol>
	<li>按先前所述方法制备香烟烟雾条件培养基（WS-CM）12。
	<ol>
		<li>使用以下吸烟程序，将四支3R4F标准香烟产生的烟雾通入不含酚红的RPMI 1640培养基中，以制备WS-CM：每次抽吸体积为35 ml，抽吸间隔为60秒，抽吸持续时间为2秒。每次制备可获得20 ml样品。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在管子上标注日期、完成时间以及香烟名称和编号。吸烟完成后立即于-80 °C保存500 µl分装样品。</li>
	<li>分析冷冻保存的WS-CM分装样品，以测定其中尼古丁、烟草特异性亚硝胺和多环芳烃的含量，方法同前文所述12。</li>
</ol>
2. 外周血单个核细胞的分离
<ol>
	<li>从健康献血者（不使用烟草制品者）采集新鲜血液，并在维克森林浸信会医疗中心机构审查委员会（IRB）的单独批准下，按照以下方法分离外周血单个核细胞（PBMCs）15。
	<ol>
		<li>在血袋送达前，于生物安全二级（BSL-2）细胞培养罩内准备好一个500 ml的瓶子、剪刀、分离缓冲液和室温（RT）的杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）。分离缓冲液必须避光保存。</li>
		<li>将血袋倒置，从夹闭处下方剪断导管，保留至少3 cm的管段。</li>
		<li>取下500 ml瓶子的瓶盖，将导管置于瓶口上方。拿起血袋并倒置，使血液自由流入瓶中直至排空。让血液沿瓶内壁流下，避免直接垂直滴落，以防止产生气泡。</li>
		<li>按1:5的体积比将分离缓冲液加入瓶中（分离缓冲液体积:血液体积）。拧紧瓶盖，轻轻翻转瓶子10次（首尾翻转）。将瓶子置于细胞培养罩内，关闭光源，室温孵育1小时。</li>
		<li>血液上方将形成一层浅黄色、稻草色的液体层。使用25 ml移液管将此层转移至50 ml离心管中。收集量可能因献血者个体差异而介于50–300 ml之间。</li>
		<li>以200 × g离心10分钟，室温操作。</li>
		<li>吸除透明的上清液，保留深色、呈血液颜色的沉淀。沉淀质地疏松但具有黏性。</li>
		<li>向15 ml离心管中加入3 ml分离缓冲液。</li>
		<li>向重悬的沉淀中加入DPBS，每在步骤2.1.5中收集到50 ml稻草色液体，即加入20 ml DPBS。涡旋充分混匀，并将多个离心管中的重悬液合并。此液体中含有悬浮的血细胞。</li>
		<li>使用移液管将5 ml悬浮血细胞缓慢加至步骤2.1.8中含3 ml分离缓冲液的15 ml离心管中。缓慢而轻柔地倾斜含有细胞悬液的15 ml离心管，以形成两个分离的液层。以400 × g离心40分钟，室温操作，使用最低加速度且不启用刹车。</li>
		<li>使用移液管将离心后产生的浑浊中间层（即血沉棕黄层，buffy coat）转移至50 ml离心管中，其中含有PBMCs。注意避免吸取其下方的透明层。每个50 ml离心管中转移量不超过25 ml。</li>
		<li>加入25 ml冷的运行缓冲液（或更多，以填满50 ml离心管中剩余体积）洗涤细胞。以400 × g离心10分钟，4 °C条件下操作。</li>
		<li>用10 ml运行缓冲液重悬沉淀，即得PBMCs。计数细胞，并立即使用或置于冰上以备冷冻保存。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. PBMC 的冻存与复苏
<ol>
	<li>将步骤 2.1.13 中收集的外周血单个核细胞（PBMCs）以 400 × g 离心 10 分钟。</li>
	<li>根据制造商说明，用异丙醇填充冷冻容器。注意：异丙醇易燃且具有急性毒性。</li>
	<li>用含 20% 胎牛血清（FBS）和 10% 二甲基亚砜（DMSO）的 RPMI 1640 培养基（4 °C）重悬细胞沉淀。此即 RPMI 1640 冷冻培养基。加入适量冷冻培养基，使细胞悬液浓度约为 5 × 107 个细胞/ml。可用于冷冻的细胞数量因样本而异。</li>
	<li>将 1 ml 细胞悬液分装至 2 ml 冻存管中，将冻存管放入冷冻容器内。将装有冻存管的冷冻容器置于 -80 °C 冰箱中过夜（O/N）保存，随后取出冻存管并转移至 -150 °C 至 -190 °C 的超低温冰箱中长期保存。</li>
	<li>从超低温保存环境中取出冻存管，在 37 °C 水浴中轻轻振荡快速解冻。</li>
	<li>立即将解冻后的冻存管中的 PBMCs 转移至含 10 ml 完全 RPMI 1640 培养基（4 °C，含 10% FBS、1% 青霉素-链霉素和 1% L-谷氨酰胺）的 15 ml 锥形管中。为获得最大细胞活力，应尽快完成解冻后细胞的转移15。</li>
	<li>以 400 × g 离心 PBMCs 10 分钟。</li>
	<li>用 5 ml 完全 RPMI 1640 培养基重悬细胞沉淀，并进行细胞计数。</li>
	<li>采用台盼蓝排斥法等标准方法测定细胞活力。通常该方法所得细胞活力约为 90 - 95%。此时 PBMCs 已可用于实验。</li>
</ol>
4. 细胞死亡的检测

注意：此处列出的稀释比例仅适用于本研究，可根据实际情况进行相应调整。
<ol>
	<li>在96孔板中使用RPMI完全培养基将WS-CM或尼古丁稀释至每孔总体积100 µl，具体操作如下所示。</li>
	<li>将WS-CM稀释至以下浓度：0.1、0.5、1、1.5、2、2.5、3、4和5 µg/mL的等效尼古丁单位（基于WS-CM中的尼古丁含量）12。</li>
	<li>将尼古丁用RPMI培养基稀释至以下浓度：100、200、500、750、1000、2000和3000 µg/ml。注意：尼古丁具有急性毒性且对环境有害。</li>
	<li>向每孔中加入100 µl以RPMI完全培养基悬浮的PBMCs，细胞浓度为1 × 106 个细胞/孔。细胞与WS-CM或尼古丁的总体积为200 µl/孔。</li>
	<li>为本研究目的，按上述方法准备两组培养板。盖好板后，将其中一块板在37 °C、5% CO2条件下孵育24小时，另一块孵育3小时。可根据需要调整时间点。</li>
	<li>在室温下通过300 × g离心3分钟，吸除上清液，盖好板后涡旋振荡板底，然后用200 µl预冷的运行缓冲液重悬细胞，并重复洗涤一次。</li>
	<li>向每孔加入95 µl运行缓冲液，再加入5 µl 7-氨基放线菌素D（7AAD），使每孔总体积为100 µl。将板在室温避光条件下孵育15分钟。</li>
	<li>向流式管中加入100 µl运行缓冲液。将每孔中的全部细胞悬液转移至流式管中，并在流式细胞仪上获取数据。</li>
	<li>使用流式细胞术分析软件确定7AAD阳性细胞的百分比。</li>
</ol>
5. EC50 测定
<ol>
	<li>通过7AAD阳性染色法测定WS-CM和尼古丁对PBMCs的EC50值。</li>
	<li>EC50值定义为在24小时实验中，50%细胞失去活力时的浓度，数值以每毫升等尼古丁单位微克数（μg equi-nicotine units/ml）表示。</li>
	<li>本研究中，WS-CM和尼古丁的EC50值分别确定为1.56 μg/ml和1,650 µg/ml。</li>
</ol>
6. 分泌的细胞因子
注意：此处列出的稀释比例仅针对本研究。可根据实际情况相应调整。
<ol>
	<li>在96孔板中使用完全RPMI培养基将WS-CM稀释至每孔总体积100 µl，其等效尼古丁单位浓度分别为0.3、1.56、3和5 µg/ml。</li>
	<li>将尼古丁稀释至以下浓度：100、200、500、750、1000、2000和3000 µg/mL。注意：尼古丁具有急性毒性并对环境有害。</li>
	<li>将悬浮于完全RPMI培养基中的PBMCs以每孔100 µl、浓度为1 × 106 个细胞/孔加入各孔中。细胞与WS-CM或尼古丁的总体积为每孔200 µl。</li>
	<li>盖好培养板，在37 °C、5% CO2条件下孵育3小时。</li>
	<li>在室温下通过以300 × g离心3分钟，吸除上清液，盖上板盖后涡旋震荡板底，最后用200 µl冰冻运行缓冲液重悬细胞，并重复洗涤步骤一次。</li>
	<li>加入200 µl完全RPMI培养基，再重复洗涤一次。</li>
	<li>向每孔中加入200 µl含10 µg/ml LPS的培养基。</li>
	<li>盖好培养板，在37 °C、5% CO2条件下孵育4小时、24小时、48小时或72小时。根据需要调整孵育时间。</li>
	<li>以300 × g离心培养板3分钟。</li>
	<li>从每孔中取出175 µl上清液，于-80 °C冰箱中保存，用于后续第7和第8步的检测。</li>
</ol>
7. 流式微球阵列检测
<ol>
	<li>解冻从步骤 6.10制备的细胞上清液，并用于CBA检测。按照制造商说明书进行流式微球阵列（CBA）检测。</li>
</ol>
8. IL-8 ELISA
<ol>
	<li>解冻步骤 6.10中的细胞上清液，并用于IL-8 ELISA检测。按照试剂盒制造商的说明书进行ELISA实验。</li>
</ol>
9. 胞内染色与流式细胞术
注意：此处列出的稀释比例仅适用于本研究，可根据实际情况进行相应调整。
<ol>
	<li>在96孔板中使用完全RPMI培养基将WS-CM稀释至终体积为100 µl/孔，其等尼古丁单位浓度分别为0.3、1.56、3和5 µg/ml。</li>
	<li>在同一块板中，将尼古丁稀释至以下浓度：2、10、50、100、500、2000和4000 µg/ml。注意：尼古丁具有急性毒性且对环境有害。</li>
	<li>向每孔中加入100 µl以完全RPMI培养基悬浮的PBMCs，细胞浓度为1 × 106 个细胞/孔。细胞与WS-CM或尼古丁的总体积为200 µl/孔。</li>
	<li>盖好板，于37 °C、5% CO2条件下孵育3小时。</li>
	<li>在室温下通过以300 × g离心3分钟洗涤细胞，吸除上清液，盖上板盖后涡旋震荡板底，最后用200 µl冰上预冷的运行缓冲液重悬细胞，并重复洗涤步骤一次。</li>
	<li>向板中加入200 µl完全RPMI培养基，再重复洗涤步骤一次。</li>
	<li>使用完全RPMI培养基配制工作浓度为2 µl/ml的GolgiPlug和10 µg/ml的LPS，并向每孔加入200 µl。</li>
	<li>将板于37 °C、5% CO2条件下孵育6小时。</li>
	<li>步骤9.8结束后，用运行缓冲液（4 °C）洗涤细胞，并在4 °C下以300 × g离心3分钟。</li>
	<li>向每孔中加入100 µl固定液（Cytofix），于4 °C孵育20分钟。</li>
	<li>按照步骤9.9所述方法，使用1× Permwash（4 °C）以300 × g、4 °C离心3分钟，重复洗涤细胞3次。</li>
	<li>向每孔中加入45 µL 1× Cytoperm，随后向每孔分别加入以下抗体之一5 µl：TNF-α-Alexa Fluor 488、IFN-γ V500、MIP-1α PE。于4 °C孵育30分钟。</li>
	<li>按照步骤9.9所述方法，使用1× Permwash（4 °C）洗涤细胞两次，再用运行缓冲液（4 °C）洗涤一次，每次均在4 °C下以300 × g离心3分钟。</li>
	<li>用200 µl 2%多聚甲醛（4 °C）重悬细胞。将细胞转移至12 × 75 mm试管中，使用流式细胞仪分析样品。注意：多聚甲醛具有腐蚀性、急性毒性，属于健康危害物。</li>
</ol>
10. K562 杀伤实验
注意：K562 细胞应在 37 °C 和 5% CO2 条件下，使用完全 RPMI 培养基培养，直至细胞融合度达到 80% 后再进行实验。
<ol>
	<li>通过向试剂瓶中加入 18 µl DMSO，配制 5 mM 的羧基荧光素琥珀酰亚胺酯（CFSE）储备液。</li>
	<li>在 96 孔板中使用 RPMI 完全培养基稀释 WS-CM 或尼古丁，每孔总体积为 100 µl，以达到各孔所需的等尼古丁单位或尼古丁浓度。注意：尼古丁具有急性毒性且对环境有害。</li>
	<li>将 100 µl PBMCs 加入 RPMI 完全培养基中，使细胞浓度为 1.5 × 106 个细胞/孔。含 WS-CM 或尼古丁的细胞总体积为 200 µl/孔。</li>
	<li>盖上盖子，在 37 °C、5% CO2 条件下孵育 3 小时。</li>
	<li>通过加入 10 ml DPBS 洗涤 K562 细胞，并在室温下以 400 × g 离心 8 分钟。</li>
	<li>用 10 ml DPBS 重悬细胞，并计数 K562 细胞。</li>
	<li>将 1 µl CFSE 储备液加入 1 ml DPBS 中，配制 CFSE 工作液。</li>
	<li>将 1 ml CFSE 工作液加入含有 1–2 × 107 个细胞的 1 ml K562 细胞悬液中。涡旋混匀，并在室温下精确孵育 2 分钟。</li>
	<li>立即加入 200 μl FBS。涡旋混匀，并在室温下精确孵育 2 分钟。</li>
	<li>加入 10 ml RPMI 完全培养基，并在室温下以 400 × g 离心 8 分钟。</li>
	<li>弃去 RPMI 上清液，吹打沉淀使细胞重悬于 10 ml RPMI 完全培养基中，并计数 CFSE 标记的 K562 细胞。</li>
	<li>在室温下以 300 × g 离心 3 分钟洗涤 PBMCs。通过倾倒去除上清液。盖上盖子后涡旋板底。加入 200 µl RPMI 完全培养基，并重复洗涤步骤一次。</li>
	<li>按 1:15 的比例（100,000 个 K562 细胞 : 1.5 × 106 个 PBMCs）将 CFSE 标记的 K562 细胞加入 PBMC 板的每个样品孔中，并在 37 °C、5% CO2 条件下继续孵育 5 小时。</li>
	<li>在室温下以 300 × g 离心 3 分钟洗涤细胞混合物。通过弃去液体去除上清液。盖上盖子后涡旋板底。</li>
	<li>加入 200 µl 运行缓冲液，并重复步骤 14 的洗涤步骤一次。</li>
	<li>每孔先加入 95 µl 运行缓冲液，再加入 5 µl 7AAD，使每孔总体积为 100 µl。将板在室温避光条件下孵育 15 分钟。</li>
	<li>每孔加入 100 µl 运行缓冲液，将每孔中的全部细胞悬液转移至流式管中，并在流式细胞仪上检测样品。</li>
	<li>使用流式细胞术分析软件确定 7AAD 阳性且 CFSE 阳性细胞的百分比。</li>
</ol>

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</ol>

作者声明不存在利益冲突。

我们及其他研究者此前已证实，用 TPPs 处理 PBMCs 可抑制多种反应，包括细胞因子的表达与分泌，以及靶细胞杀伤等功能学指标14之前研究所描述的实验方法需要较长的孵育时间，且效应幅度有限。14. 鉴于这一有吸引力的特性可能具有的应用前景 离体 用于基础与应用研究的模型，我们探究了这些多步骤生物学检测中的任何检测参数是否可优化。本文介绍了利用TPP处理来测量TLR介导的免疫应答的简化方法 离体 外周血单个核细胞模型
分离活的外周血单个核细胞是这些实验的关键前提 离体实验 鉴于潜在供体之间存在个体差异和生理状态的不同，获得具有反应性的外周血单个核细胞（PBMCs）是理想的选择。为实现本研究目的，我们采用既往发表的方法，从总体健康的成年受试者中分离PBMCs。15此外，本研究为尽量减少供者间的个体差异，排除了存在过敏、感染或正在服用任何处方药及非处方药（如阿司匹林）的供者。同时，建议从新鲜采集的血液中分离PBMCs，以确保细胞在后续实验中具有最佳的活力和功能。</p...

大量研究证据表明，长期吸烟对健康有害，可导致心血管疾病（CVD）、慢性阻塞性肺疾病（COPD）和癌症1,2长期吸烟已被证实可引起炎症和免疫抑制，这些改变据报会增加吸烟者发生微生物感染和癌症的风险3. 在 体外 和 离体 这些技术有助于阐明香烟烟雾对病理生理效应的分子基础4-9 (表1）并被视为指导各类烟草产品新兴监管的重要工具10,11.
例如，我们已证明，可燃性烟草制品制剂（TPPs）如全烟气条件培养基（WS-CM）和总颗粒物（TPM）对细胞的毒性及对DNA的损伤远高于非可燃性TPPs或尼古丁12,13. 与已发表的研究一致，最近有报道称可燃的TPPs或尼古丁12,13与已发表的研究一致，我们近期报道了可燃性 TPPs 会引起显著的免疫抑制。这一点体现在 Toll 样受体（TLR）配体刺激下的细胞因子分泌受到抑制，以及外周血单个核细胞（PBMCs）对靶细胞（K562）杀伤能力的下降。 离体 模型14鉴于炎症在香烟烟雾诱导的疾病过程中的重要性，本报告提出了进一步优化检测条件，以评估香烟烟雾对免疫调节作用的方法。
通常采用ex vivo（离体）实验检测细胞内和分泌型细胞因子，以及细胞毒性T细胞和NK细胞在K562细胞杀伤实验中所表现出的溶细胞性功能14。实验流程包括：先将外周血单个核细胞（PBMCs）与WS-CM和尼古丁共同预孵育，随后在3天内使用TLR激动剂进行刺激；最终通过酶联免疫吸附试验（ELISA）和/或流式细胞术进行检测。我们采用了可结合TLR-4受体并刺激PBMCs产生细胞内细胞因子及分泌细胞因子的细菌脂多糖（LPS）。除了对评估烟草制品（TPPs）免疫调节作用的各项实验步骤进行优化外，本文还介绍了分离PBMCs、细胞死亡检测以及IL-8定量的方法。这些方法可用于回答其他研究问题，并可进一步优化，以适用于烟草制品的监管评估。
表1. 已发表的报告 体外 和 离体 用于研究烟草制品制剂各种病理生理效应的方法 CS，香烟烟雾培养基；CSC，香烟烟雾冷凝物；CSE，香烟烟雾提取物；ELISA，酶联免疫吸附测定；GADPH，3-磷酸甘油醛脱氢酶；qPCR，定量聚合酶链式反应；RT，实时定量聚合酶链式反应；TS，烟草烟雾
<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>作者（研究年份）</td>
			<td>Laan 等 (2004)</td>
			<td>Moodie 等 (2004)</td>
			<td>Oltmanns 等 (2005)</td>
			<td>Vayssier (1998)</td>
			<td>Witherden 等 (2004)</td>
			<td>Birrell 等 (2008)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>使用的细胞</td>
			<td>人支气管内皮细胞（BEAS-2B）、人中性粒细胞</td>
			<td>人肺泡上皮细胞（A549）</td>
			<td>人气道平滑肌细胞（HASMC）</td>
			<td>人前单核细胞U937细胞、人单核细胞</td>
			<td>肺泡II型上皮细胞（ATII）</td>
			<td>人单核细胞系（THP-1）、人肺巨噬细胞</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>使用的烟草烟雾提取物</td>
			<td>CSE</td>
			<td>CSC</td>
			<td>CSE</td>
			<td>TS</td>
			<td>CSE</td>
			<td>CS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>使用的方法</td>
			<td>ELISA、qPCR、迁移实验、电泳迁移率变动分析</td>
			<td>免疫组织化学、电泳、Arrayscan试剂盒、RT-PCR、ELISA</td>
			<td>ELISA、RT-PCR、qPCR、电泳</td>
			<td>凝胶迁移率变动分析</td>
			<td>光学显微镜、电子显微镜、电泳、ELISA</td>
			<td>qPCR、ELISA、E-toxate试剂盒（Sigma）、p65板式检测（TransAM）、电泳、多种免疫检测试剂盒</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>检测指标</td>
			<td>IL-8、GM-CSF、AP-1、NF-κB、迁移能力</td>
			<td>组蛋白乙酰转移酶、组蛋白去乙酰化酶、NF-κB、IL-8、p-IκB-α、GAPDH</td>
			<td>HO-1、GAPDH、RANTES、IL-8、嗜酸性粒细胞趋化因子</td>
			<td>热休克/应激蛋白（HSP/Hsp70）、HF转录因子、NF-κB、TNF-α</td>
			<td>表面活性蛋白（SP-A、SP-C）、IL-8、MCP-1、GRO-α、TNF-α、IL-1β、IFN-γ</td>
			<td>IL-8、IL-1β、IL-6、TNF-α、MIP1-α、GRO-α、MAPK/JNK/ERK磷酸化、cJUN:DNA结合、谷胱甘肽、p65:DNA结合</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>最终结果</td>
			<td>CSE通过抑制AP-1活化下调细胞因子的产生。</td>
			<td>H2O2和CSC增强组蛋白蛋白的乙酰化，降低组蛋白去乙酰化酶活性，并差异性调控促炎性细胞因子的释放。</td>
			<td>香烟烟雾可诱导HASMC释放IL-8，TNF-α可增强该效应；20% CSE条件下IL-8释放减少；香烟烟雾抑制嗜酸性粒细胞趋化因子和RANTES的释放。</td>
			<td>TS激活HF转录因子，该过程与Hsp70过表达相关，并抑制NF-κB结合活性及TNF-α释放。</td>
			<td>ATII细胞来源的趋化因子水平降低，损害肺泡修复，从而促进香烟烟雾诱导的肺泡损伤和肺气肿。</td>
			<td>研究数据为吸烟者更易发生呼吸道感染提供了机制性解释：先天免疫反应受到抑制的同时，IL-8水平升高。</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

<table><tbody><tr><td>12 x 75 mm 离心管</td><td>BD Falcon</td><td>352058</td><td></td></tr><tr><td>15 ml 锥形离心管</td><td>Corning</td><td>430790</td><td></td></tr><tr><td>2 ml 微量离心管</td><td>Axygen</td><td>MCT-150-C-S</td><td></td></tr><tr><td>3R4F 参考香烟</td><td>肯塔基大学农业学院</td><td>3R4F</td><td></td></tr><tr><td>50 ml 锥形离心管</td><td>Corning</td><td>430828</td><td></td></tr><tr><td>500 ml 瓶</td><td>Corning</td><td>430282</td><td></td></tr><tr><td>7AAD</td><td>BD Pharmingen</td><td>559925</td><td></td></tr><tr><td>96 孔平底板</td><td>Thermo Nunc</td><td>439454</td><td></td></tr><tr><td>96 孔圆底板</td><td>BD Falcon</td><td>353077</td><td></td></tr><tr><td>细胞培养超净台</td><td>Thermo Scientific</td><td>1300 Series A2</td><td></td></tr><tr><td>离心机</td><td>Eppendorf</td><td>58110R</td><td></td></tr><tr><td>CFSE</td><td>Molecular Probes Life Technologies</td><td>C34554</td><td></td></tr><tr><td>Cluster 管</td><td>Corning</td><td>4401</td><td>吞咽有害，致癌物</td></tr><tr><td>Cytofix/Cytoperm（Permwash）</td><td>BD Biosciences</td><td>555028</td><td>易燃</td></tr><tr><td>DMSO（二甲基亚砜）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Lonza</td><td>17-512F</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2442</td><td></td></tr><tr><td>FCAP Array</td><td>BD Biosciences</td><td>652099</td><td>软件用于分析 CBA 数据</td></tr><tr><td>滤器单元</td><td>Nalgene</td><td>156-4020</td><td></td></tr><tr><td>流式细胞仪</td><td>BD Biosciences</td><td>FACS Canto II</td><td>8 色，激发波长 405，发射波长 785。</td></tr><tr><td>流式细胞仪</td><td>BD Biosciences</td><td>FACS Calibur</td><td>4 色，激发波长 495，发射波长 785。</td></tr><tr><td>流式细胞术分析软件</td><td>Tree Star</td><td>FlowJo</td><td></td></tr><tr><td>冻存容器</td><td>Nalgene</td><td>5100-0001</td><td>含 DMSO，刺激物</td></tr><tr><td>GolgiPlug</td><td>BD Biosciences</td><td>555029</td><td>致癌物，刺激物，腐蚀性</td></tr><tr><td>H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;SO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>339741</td><td></td></tr><tr><td>人炎症性细胞因子检测试剂盒</td><td>BD Biosciences</td><td>551811</td><td></td></tr><tr><td>IFN-&amp;gamma; V-500 抗体</td><td>BD Horizon</td><td>561980</td><td>皮肤致敏物</td></tr><tr><td>IL-8 ELISA 试剂盒</td><td>R&D Systems</td><td>DY208</td><td></td></tr><tr><td>分离缓冲液</td><td>Isolymph, CTL Scientific Corp.</td><td>1114868</td><td>易燃液体，刺激物</td></tr><tr><td>异丙醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W292907</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>Gibco Life Technologies</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>LPS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2630</td><td></td></tr><tr><td>MIP1-&amp;alpha; PE 抗体</td><td>BD Pharmingen</td><td>554730</td><td>急性毒性，经口</td></tr><tr><td>莫能菌素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5273</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>尼古丁</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N3876</td><td>急性毒性，环境危害</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Bemis</td><td>&amp;ldquo;M&amp;rdquo;</td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td>易燃，皮肤刺激</td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>Gibco Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Gibco Life Technologies</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>运行缓冲液</td><td>MACS Running Buffer, Miltenyi Biotech</td><td>130-091-221</td><td></td></tr><tr><td>Th1/Th2 CBA 试剂盒</td><td>BD Biosciences</td><td>551809</td><td></td></tr><tr><td>TNF-&amp;alpha; Alexa Fluor 488 抗体</td><td>BioLegend</td><td>502915</td><td></td></tr><tr><td>移液管</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-711-20</td><td></td></tr><tr><td>Tris 碱</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr></tbody></table>

评估可燃性烟草产品制剂细胞毒性和免疫抑制作用的方法

Methods to Evaluate Cytotoxicity and Immunosuppression of Combustible Tobacco Product Preparations

除其他病理生理变化外，长期暴露于香烟烟雾可导致炎症和免疫抑制，这与吸烟者对微生物感染和肿瘤发生易感性增加相关。ex vivo 条件下研究经烟雾成分处理的人外周血单个核细胞（PBMCs）中受体介导的免疫反应抑制，是研究其作用机制并评估烟草制品长期暴露可能影响的有效方法。本文中，我们优化了利用细菌脂多糖（一种Toll样受体4配体）刺激PBMCs进行ex vivo 检测的方法。在ex vivo 检测中，我们研究了全烟雾条件培养基（WS-CM）、一种可燃性烟草制品提取物（TPP）以及尼古丁对PBMCs分泌细胞因子及其杀伤靶细胞功能的影响。结果显示，在暴露于WS-CM的PBMCs中，分泌型细胞因子IFN-γ、TNF、IL-10、IL-6和IL-8，以及胞内细胞因子IFN-γ、TNF-α和MIP-1α均受到抑制。通过K562靶细胞杀伤实验测定，效应PBMCs的细胞溶解功能也因WS-CM暴露而降低；相比之下，尼古丁在这些实验中作用甚微。综上所述，我们建立了一系列改进的检测方法，可用于评估烟草制品在ex vivo 条件下的生物学效应，这些方法也可便捷地适用于其他待测产品的研究。

结果以均值 ± 均值标准误表示（四个供体样本）。使用 Excel 软件对处理组与未处理对照组进行学生 t 检验，并对所有处理组与其相应对照组进行 t 检验比较。统计学显著性以以下符号表示：*，P &lt; 0.05；**，P &lt; 0.005；***，P &lt; 0.0005。
为了检测暴露于WS-CM和尼古丁的影响，将PBMCs分别用不同浓度的WS-CM和尼古丁处理3小时或24小时。细胞死亡通过稳定可靠的7AAD染色法进行检测，因为7AAD可插入双链核酸中，并能穿透正在死亡或已死亡细胞的细胞膜16。在处理24小时后，WS-CM引起细胞死亡呈剂量依赖性增加，在相当于4 µg/ml尼古丁单位时，检测到接近80%的细胞死亡（图1A）。只有在3,000 µg/ml尼古丁浓度下才观察到类似程度的细胞死亡（图1B）。由于我们采用3小时的WS-CM和尼古丁暴露以评估其对细胞因子诱导及杀伤靶细胞能力的影响，因此有必要确定WS-CM在3小时处理后是否引起显著的细胞毒性。用相当于5 µg/ml尼古丁单位的...

通过优化的人类外周血单个核细胞（PBMC）ex vivo 检测方法，我们发现可燃性烟草制品的提取物显著抑制了效应PBMCs中受体介导的细胞内分泌细胞因子及其细胞溶解能力。这些快速检测方法可能有助于烟草产品的评估，并帮助理解烟草暴露潜在的长期影响。

除了其他病理生理学改变外，长期暴露于香烟烟雾可导致炎症和免疫抑制，这些已被证实与……相关

本实验的总体目标是评估烟草产品制备物对PBMCs细胞因子分泌及其杀伤靶细胞能力的影响。首先，用全烟雾条件培养基、普通培养基或尼古丁处理培养的PBMCs，随后对处理后的PBMCs进行胞内染色，以检测其细胞因子的产生情况。或者，将CFSE标记的K562细胞与经全烟雾条件培养基处理的PBMC效应细胞共培养，并通过7-AAD染色对K562细胞的存活率进行定量分析。最终，通过流式细胞术检测任一检测方法中可燃烟草制品处理对P BMCs的影响。与现有的铬释放实验或ALI斑点法等方法相比，本方法的主要优势在于通量高、无需使用放射性物质，并且能够检测细胞功能活性。尽管该方法可为烟草制品处理的生物学效应提供深入见解。它还可用于评估其他影响PBMC效应细胞的类Toll样受体介导功能和STIC功能的化合物。在开始染色程序之前，将全烟雾条件培养基和尼古丁用RPMI完全培养基稀释至所列浓度，总体积为每孔100微升，加入96孔板中。然后每孔加入100微升P BMCs，用完全培养基悬浮，细胞浓度为每孔1×10⁶个细胞，最终每孔总体积为200微升。接着盖上培养板，在37°C和5%CO₂条件下孵育。3小时后，洗涤细胞并吸除上清液。然后再次盖上培养板并涡旋震荡，以重悬沉淀。细胞再洗涤两次，第二次洗涤后先用预冷的运行缓冲液洗涤一次，再用完全培养基洗涤一次。随后每孔加入200微升完全培养基，同时添加高尔基体阻断剂（Golgi plug）和脂多糖（LPS），在37摄氏度、5%CO2条件下孵育6小时。然后用预冷的缓冲液洗涤细胞，在20分钟后，每孔加入100微升细胞固定液（cyto fix），于4摄氏度处理；随后用预冷的透化洗涤液（perm wash）洗涤细胞三次。接着每孔加入45微升细胞透化液（cyto perm），再分别加入5微升所列的每种抗体。在4摄氏度孵育30分钟后，洗涤细胞三次，并将细胞重悬于200微升预冷的2%多聚甲醛（para formaldehyde）中固定。然后将细胞转移至12 mm × 75 mm的试管中，并在流式细胞仪上分析样品。在按上述方法制备好经烟草产品处理的PBMC培养板后，洗涤一培养物为K 5 62细胞的培养物，该细胞在10 mL DPBS中以80%汇合度收获。将细胞沉淀重悬于5 mL DPBS中，并计数细胞。然后，将1毫升新配制的CFSE工作液加入含有1×10⁷至2×10⁷个K562细胞的1毫升完全培养基中，并通过涡旋充分混匀细胞染料。室温孵育恰好2分钟后，加入200微升FBS，再次涡旋混匀细胞，并继续孵育2分钟。第二次孵育结束后，用10毫升完全培养基洗涤细胞，然后将细胞沉淀重悬于另10毫升完全培养基中，并进行细胞计数。现在将经烟草处理的pBMCs离心，并倾去上清液。然后盖上盖子，通过涡旋振荡重悬细胞，并用每孔200 µL完全培养基洗涤。为启动杀伤实验，按1:15的比例将CFSE标记的K562细胞加入PBMC中，在37°C及5% CO₂条件下孵育共培养体系。孵育5小时后，离心收集细胞并弃去上清液。通过涡旋振荡重悬沉淀，然后每孔用200 µL运行缓冲液洗涤细胞，随后每孔加入95 µL运行缓冲液，再加入5 µL 7AAD，使每孔总体积为100 µL。最后将细胞在室温避光条件下孵育15分钟。然后向每个孔中加入100 µL运行缓冲液，并将全部体积转移至相应的传真管中，以确定七种a a D和CFSE阳性细胞的百分比。通过流式细胞术分析，在24小时时，全烟雾条件培养基呈现出剂量依赖性的细胞死亡增加，在每毫升等烟碱单位为4 µg时，接近80%的细胞死亡。然而，在24小时时，即使全烟雾条件培养基的等烟碱单位达到每毫升5 µg，仅处理pBMCs 3小时也不会导致显著的细胞毒性。在使用每毫升3000微克尼古丁处理3小时之前，未观察到相当程度的细胞死亡；在每毫升2000微克尼古丁浓度处理之前，尼古丁处理在全烟培养基条件下不会引起可测量的细胞死亡。在全烟培养基、尼古丁处理后，再通过LPS刺激TLR4受体，会导致分泌型细胞因子呈剂量依赖性减少，尽管不同细胞因子的抑制程度存在差异。此外，当细胞仅与LPS和高尔基体阻断剂共处理6小时后，在暴露于全烟培养基条件时，即使在较低的等效尼古丁单位浓度下，与单纯尼古丁暴露相比，也可观察到细胞内细胞因子阳性细胞数量的减少。事实上，该杀伤实验的结果表明，与对照组和较低剂量组相比，效应PBMC群体暴露于每毫升1.56微克的全烟雾条件培养基后，其杀伤能力显著下降。而无论高浓度还是低浓度的尼古丁处理，在尝试这些操作时均未干扰效应PBMC群体的杀伤能力。在进行这些步骤时，必须精确控制CFSE标记、抗体稀释、标记时间以及孵育温度。观看本视频后，您应能够充分理解如何在流式细胞术中利用抗体标记技术，以确定烟草制品制备物或其他处理方式对人外周血单个核细胞的影响。

methods-to-evaluate-cytotoxicity-immunosuppression-combustible

Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

方法评估细胞毒性的可燃烟草产品的准备和免疫抑制

肺上皮细胞可从小鼠呼吸道分离，并在气液界面培养，作为分化型呼吸道上皮的模型。本文描述了一种分离、培养这些细胞并将其暴露于主流香烟烟雾的实验方案，以研究细胞对这种环境毒素的分子响应。...

小鼠呼吸道上皮细胞的分离及在气液界面暴露于实验性香烟烟雾

本视频展示了烟草制品制剂（TPPs）对人外周血单个核细胞细胞因子产生的影响，检测方法为流式细胞术。经TPP处理的细胞在脂多糖刺激后，再进行免疫染色和流式细胞术分析，结果显示其促炎性细胞因子的产生受到抑制。...

通过细胞内染色与流式细胞术分析烟草制品制剂对细胞因子产生的影响

在本视频中，我们研究了全烟雾条件培养基（一种可燃烟草制品的制备物）对效应外周血单个核细胞杀伤 K562...

通过暴露于烟草制品处理的外周血单个核细胞杀伤K562细胞

本视频展示了一种通过WST-1法评估人源性精准切割肺组织切片细胞毒性的技术。将人源性精准切割肺组织切片暴露于梯度浓度的细胞毒性化学物质中，以定量其细胞毒性效应。颜色强度的降低可作为该化学物质对肺细胞产生有害影响的证据。...

一种用于检测化学诱导人肺组织精准切片细胞毒性的实验方法

本实验方案的目的是在气液界面条件下，将人源类器官三维支气管和鼻组织模型暴露于香烟主流烟雾（CS）中。随后通过细胞色素P450活性检测、纤毛搏动测量以及系统生物学方法，评估烟雾对组织的影响。...

反复暴露于全烟雾对支气管和鼻部类器官三维组织培养模型的影响评估

本研究旨在利用基于阻抗的实时细胞分析仪与基于高内涵筛选（HCS）的平台相结合的方法，评估15种香烟烟雾成分的生物学影响 体外本研究提供了有关受试化合物的有效剂量、毒性和作用机制的信息。...

高内涵筛选分析用于评估有害及潜在有害成分（HPHC）的毒理学效应

本方案描述了一种使啮齿类动物暴露于电子烟雾（E-vapor）和香烟烟雾的方法。通过改造麻醉舱并配备自动抽气系统，构建暴露室，该系统可将电子烟雾或香烟烟雾递送至啮齿类动物。该系统可轻松调整，以适应多种实验终点。...

比较电子烟雾与香烟烟雾在一种新型模型中的效应 体内 暴露系统

本文介绍了一种可编程的实验装置，可用于制备传统香烟烟雾和电子烟气溶胶的提取物。该方法为传统香烟与电子烟之间的直接比较提供了有力工具，也是开展电子烟研究的便捷切入点。...

一种由微控制器操作的装置，用于从传统香烟烟雾和电子烟气溶胶中生成液体提取物

鉴于3R原则，作为动物实验替代方案的呼吸系统模型正在不断发展。特别是对于呼吸性物质的风险评估，目前尚缺乏合适的检测方法。本文介绍了利用人源性精准切割肺组织切片评估空气传播物质的方法。...

人源肺组织精准切割切片中物质细胞毒性和免疫调节效应的评估

全球使用电子烟（e-cig）的人数正在增加。然而，关于吸入电子烟气溶胶所引起的健康影响，目前知之甚少。本文介绍一种适用于动物暴露及后续毒理学研究的电子烟气溶胶生成技术。建立可实验重复且标准化的电子烟暴露系统，需要此类实验方案。...

使用第三代电子烟机产生电子烟气溶胶：在毒理学研究中的应用

我们建立了一种标准化的 体外...

体外大麻对气液界面肺上皮细胞的暴露

了解如何使用流式细胞术评估可燃烟草制品对人外周血单个核细胞细胞因子分泌及靶细胞杀伤功能的影响。该方法为研究烟草暴露的免疫抑制效应提供了高通量、非放射性的检测手段。

评估可燃性烟草产品制剂细胞毒性和免疫抑制作用的方法

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