神经微电路急性脑片电生理和形态特征采用配对膜片钳记录
2015年1月10日
急性脑切片中突触耦合神经元的膜片钳记录和同时细胞内生物胞素填充允许对其结构和功能特性进行相关分析。该协议的目的是描述神经元微电路电生理记录的基本技术步骤及其随后的形态学分析。
以下实验的总体目标是展示形态学鉴定的神经元之间的突触连接如何在功能和结构上表征。这是通过获得急性脑切片来实现的，这些脑切片针对研究特定的突触连接进行了优化。然后使用膜片钳来测试突触耦合的神经元。
为此，修补一个单独的预期突触后神经元，然后使用第二个移液器刺激周围的神经元，以建立突触连接的存在。如果未看到响应，则移动刺激电极。一旦找到连接，突触前神经元就会以批发模式重新匹配。
在来自这些神经元的电生理记录和同时填充生物素之后，切片被固定，处理为生物素，并进行神经元的计算机辅助 3D 重建。最终，我们的方法旨在对神经元微电路进行相关的定量结构和功能分析。来自突触耦合神经元的配对记录的主要优点是我们可以对神经元微回路中的突触前和突触后神经元进行相关的结构和功能分析。
甚至最近，引入的技术（例如神经元的光学刺激）到目前为止还无法以如此详细的方式实现这一目标。该方法能够研究形态学鉴定的神经元类型的激发和抑制的相互作用以及活动是如何调节的。演示宠物录音程序的是 Guan。
他是我实验室的博士后。准备好目标区域的切片后，让它们在此期间孵育，拉动贴片移液器，该移液器应具有细长的柄。在实验室中用铂竖琴固定脑切片后，用内部溶液填充记录移液器。
将移液器放入前置放大器中，并使用 8 至 10 兆欧姆电阻的搜索贴片移液器在全细胞模式下修补假定的突触后神经元，其中填充有内部溶液，其中钾盐被钠盐取代。对搜索移液管轻轻吸力，以修补松散细胞中潜在的突触前神经元。附加的配置。
在电流钳模式下，将松散密封下的膜电位保持在负 30 和负 60 毫伏之间。然后将 0.2 的大电流脉冲施加到两个 nano 安培上，以在潜在的突触前细胞中引发动作电位。将此动作电位观察为电压响应上的一个小尖峰。
将刺激频率设置为 0.1 赫兹，以防止突触后反应的衰减。如果突触后神经元对测试的潜在突触前神经元贴片的刺激没有反应，则新的潜在突触前神经元处于松散密封模式。以这种方式测试多达 30 个潜在的突触前神经元。
只要可以建立电阻大于 30 兆欧姆的密封，就可以继续使用相同的搜索贴片电极。如果在松散密封模式下刺激导致突触后神经元中 EPSP 或 IPSP 的延迟小于 5 毫秒，则使用填充生物素的记录贴片电极从突触前神经元中取出搜索移液器，该电极含有含有电阻为 4 至 8 兆欧姆的常规内部溶液的生物素。修补突触前神经元并以全细胞电流钳模式记录。
通过在突触前神经元中电流注射来引发动作电位并记录突触后反应。将数据存储在计算机上以供以后离线分析。在整个记录过程中，生物素扩散到神经元中以获得足够的染色。
让生物素扩散至少 15 到 30 分钟，具体取决于神经元的大小。对于具有高连接比的神经元微电路，不使用搜索电极。相反，首先在全细胞模式下直接修补突触前神经元。
然后使用充满常规内部溶液的贴片电极，补片潜在的突触后神经元也处于全细胞模式，两个细胞都应在电流钳控制下。在突触前细胞中引发动作电位，并监测预期的突触后神经元的突触后电位。如果神经元对突触前刺激没有反应，请使用新电极在全细胞模式下再次修补新神经元。
找到连接后，如前所述继续记录，无需更换补片移液器。按照文本协议中的说明固定和安装切片后，在光学显微镜下检查生物素标记的神经元。确保轴突棒和树突棘清晰可见。
使用商业神经元示踪系统，手动追踪神经元或突触耦合的神经元对。确保包括即使是小的轴突或树突侧支。使用痕迹获得 3D 神经元重建，在跟踪程序的相应部分中校正神经元重建在所有三个空间维度上的收缩。
嵌入介质的收缩校正因子在 x 和 y 方向上约为 1.1，在 Z 方向上约为 2.1。一对互相耦合的细胞，由一个多刺的星状和一个快速刺入神经元组成。在皮质层中，第 4 层充满了生物素。
在记录过程中，绿点表示突触前棘神经元和突触后神经元之间推定的兴奋性突触接触。蓝点表示推定的相互抑制突触接触。此处显示了突触接触的高功率图像。
绿色空心圆圈表示兴奋性接触，蓝色空心圆圈表示抑制性接触。这里显示了这个相互连接的细胞对的神经清醒重建。神经元间轴突以蓝色显示，其胞体和树突以红色显示。
棘状神经元轴突显示为绿色，其胞体和 dite 显示为白色。插图显示了突触前和突触后神经元的体树突状隔室。与推定的突触接触一起，在由急性脑切片制成的低功率明场显微照片中鉴定出桶状轮廓。
此处显示了具有极低连接率的代表性突触连接。第六层旁金属细胞中的突触前动作电位在第四层旁金属神经元中诱发单体突触兴奋性突触后电位。此处显示的此跨层流连接的延迟超过 3 毫秒，比在本地层内连接中观察到的大约 1 毫秒的延迟要长得多。
在第 6 层贴金属细胞中引发的两个 10 赫兹动作电位触发了此处所示的第 4 层贴金属神经元中的突触后电位。注意短期便利。重要的是要记住，需要针对给定的突触连接优化斜线条件，并且在录制过程中，设置需要绝对稳定，然后才能保证最佳的录制理解。
看完这个视频，你应该对如何使用电生理测量和形态学重建来全面了解新皮层中神经元微回路的结构和功能特性有了很好的了解。
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概述
本协议展示了通过电生理和结构分析来表征形态学已确定的神经元之间的突触连接。使用急性脑切片，研究人员可以对单个神经元进行膜片钳夹，并刺激周围的神经元以建立突触连接。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 电生理学
- 神经元形态学
背景
- 理解突触连接对神经科学研究至关重要。
- 膜片钳技术允许对神经元进行详细的功能分析。
- 同步的形态学分析提供了对神经元结构的洞察。
- 急性脑切片是研究突触相互作用的最佳方法。
研究目的
- 描述电生理记录的技术步骤。
- 关联神经元的功能和结构特性。
- 增强对神经元微电路的理解。
使用的方法
- 制备急性脑切片以优化突触研究。
- 使用膜片钳记录来识别突触耦合的神经元。
- 生物素充填用于神经元的形态学分析。
- 刺激周围神经元以建立突触连接。
主要结果
- 成功识别神经元之间的突触连接。
- 展示了结构和功能特性之间的相关性。
- 对神经元微电路的动态提供了洞察。
- 建立了一个可靠的协议以供未来研究。
结论
- 本协议提供了一种全面的方法来研究突触连接。
- 它强调了结合电生理和形态学技术的重要性。
- 研究结果有助于更深入地理解神经元的相互作用。
常见问题
Executive Industry Relevance
Paired patch-clamp recordings in acute brain slices enable direct, quantitative analysis of synaptic connectivity and functional microcircuit properties, supporting mechanistic de-risking in early neuroscience drug discovery. This approach provides high-resolution correlation between neuronal structure and function, informing target validation and predictive confidence for CNS portfolio decisions. Integrating electrophysiological and morphological data strengthens translational continuity from discovery biology to preclinical model selection.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of synaptic connectivity and microcircuit function in disease-relevant brain regions.
- Supports mechanistic de-risking by correlating electrophysiological responses with neuronal morphology.
- Improves predictive confidence for target engagement and pathway modulation in CNS programs.
Screening & Assay Development
- Facilitates preparation of validated neuronal systems for downstream compound screening.
- Provides quantitative, reproducible electrophysiological and morphological outputs for assay standardization.
- Enables reliable evaluation of compound effects on synaptic transmission and connectivity.
Translational & Preclinical Research
- Aligns functional and structural biomarkers for translational continuity in CNS research.
- Supports risk-adjusted advancement by clarifying microcircuit mechanisms underlying disease phenotypes.
- Informs preclinical model selection based on validated synaptic and circuit-level endpoints.
Pipeline & Workflow Integration
This method bridges early discovery and preclinical research by providing quantitative, mechanistic insights into neuronal microcircuits, supporting lead identification and translational biomarker development in CNS pipelines.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing of synaptic connectivity and pathway function in native tissue context.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative readouts of synaptic responses for compound evaluation.
- Analytics: Provides high-resolution measurements of latency, amplitude, and connectivity for comparative analysis.
- Translational Research: Aligns structural and functional endpoints for biomarker validation and model selection.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for characterizing diverse neuronal circuits across CNS programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in CNS target validation.
- Operational Value: Standardizes electrophysiological and morphological workflows for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient portfolio triage in neuroscience R&D.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of CNS assets based on validated circuit mechanisms.
Implementation Considerations
- Requires specialized electrophysiology expertise and training in patch-clamp techniques.
- Demands access to advanced microscopy and neuron tracing infrastructure for 3D reconstruction.
- Necessitates rigorous cross-team standardization of recording and analysis protocols.
- Adaptation may be needed for different brain regions or neuronal subtypes based on connectivity ratios.
- Connectivity estimates can be affected by tissue preparation artifacts such as dendritic or axonal truncation.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
2:22
Paired Patch-Clamping: Neuronal Connections with a Low Connectivity
5:11
Paired Patch-Clamping: Neuronal Connections with a High Connectivity
6:16
Neuronal Reconstruction and Synaptic Contact Localization
7:17
Results: Morphology and Electrophysiology of Synaptic Connections in Cortical Neuronal Microcircuits
9:35
Conclusion
