利用干细胞来源的中枢神经系统神经元网络培养物对生物性神经毒素进行功能评估

本实验的目的是精确测量梭菌神经毒素对源自小鼠胚胎干细胞的神经元网络化培养物中突触传递的影响。首先将胚胎干细胞适应于无饲养层细胞的悬浮培养体系，并维持其多能状态；第二步是采用四阶段分化技术的改良方法，将已适应悬浮培养的干细胞分化为神经元，即 ESNs。

接下来，将ESNs用一系列培养基处理，以促进其成熟为具有突触活性的神经网络。最后一步是用梭菌神经毒素或其他神经毒素处理ESNs，并采用全细胞膜片钳电生理技术检测其对单突触活性的影响。最终，通过电生理记录数据量化单突触活性的自发产生变化，数据经与同龄、同批次匹配的对照神经元归一化处理后，在不同条件（如剂量、时间或药物处理）之间进行比较。

该技术的主要优势在于，ESN 是首个能够复制肉毒中毒和破伤风临床表现相关功能病理的基于细胞的模型。我们最初产生这一方法的想法，是源于发现 ESN 对所有基于 SNARE 蛋白切割的梭菌神经毒素高度敏感，同时在新生网络行为中表现出自发性突触活动。本次实验操作将由本实验室技术员 Megan Lyman 女士进行演示。首先，转移已适应的无饲养细胞悬浮培养物。

将ESC集落转移至15毫升锥形管中，让集落沉降形成紧密的细胞沉淀。待集落完全沉降后，小心吸除上清液，注意不要扰动细胞沉淀。随后加入5毫升PBS洗涤细胞，并在100 × g下离心2.5分钟。

小心吸除 PBS，然后加入 500 µL 胰蛋白酶，轻轻翻转离心管数次，以轻柔地分散细胞沉淀。随后将离心管放入 37 °C 水浴中，孵育 3 分钟。孵育结束后，将离心管放回细胞培养操作台，加入 500 µL ESC 培养基以稀释胰蛋白酶。

然后用 P-1000 移液器将细胞悬液反复吹打 5 到 10 次，以获得单细胞悬液。使用血细胞计数板对细胞进行计数，并将剩余的细胞悬液在 200 × g 条件下离心 3 分钟。吸除上清液后，用 ESC 培养基将细胞重悬至最终浓度为 1 × 10⁷ 个细胞/毫升。

接下来，将150 µL悬浮液转移至10 cm细菌培养皿中的10 mL ESC培养基中，在37°C、5% CO₂条件下培养。ESC通常采用此方案进行传代。每48小时进行一次常规细胞传代时，ESC开始向神经元分化。

按照之前的方法消化 ESCs，但额外准备一个用于神经分化的培养板。将 350 微升细胞悬液转移至含有 25 毫升分化培养基的 10 厘米低吸附培养皿中。将培养皿置于组织培养孵箱内，37 摄氏度、5% 二氧化碳条件下，放置在转速设定为 30 至 45 转/分钟的摇床上，培养 48 小时。

48小时后，使用25毫升移液管将正在分化的细胞团块转移至50毫升锥形管中。立即向培养皿中加入25毫升新鲜分化培养基。

让聚集体静置两到五分钟，形成可见的沉淀，沉淀深度为一到两毫米。小心吸除上清液，忽略仍处于悬浮状态的单个细胞或小聚集体，使用 P 1000 移液器将细胞团重新转移回培养皿中。将培养皿放回培养箱中的旋转摇床继续培养。

再经过 48 小时后，重复培养基更换操作。此次加入 30 毫升分化培养基，并补充 6 微摩尔的全反式维甲酸。细胞经培养后形成的细胞团块深度将达到 2 至 4 毫米。

与之前相同，最后一次重复添加视黄酸的换液操作。次日此时，细胞沉淀物深度将达到四到八毫米。在铺板当天下午，按照方案书面部分所述准备铺板表面，或分别准备五毫升预温的涂有MPC的胰蛋白酶培养基和0.1%大豆胰蛋白酶抑制剂，均置于37摄氏度环境中。

然后使用25毫升移液管将分化聚集体从培养板转移至50毫升锥形管中。让聚集体静置3至5分钟，然后小心吸除上清液，避免扰动沉淀。接着，在聚集体沉降后，用5至10毫升PBS洗涤沉淀。

吸去PBS，重复洗涤一次。第二次PBS洗涤后，向沉淀中加入5毫升MPC化培养基，于37摄氏度孵育5分钟。

孵育期间轻轻弹动离心管两到三次。接着，向细胞中加入5毫升0.1%大豆胰蛋白酶抑制剂，并通过倒置迅速混匀。然后用10毫升移液管轻柔吹打细胞10至15次，直至形成相对均一的细胞悬液。

将细胞悬液缓慢通过置于50毫升锥形管上方的40或70微米细胞筛网进行过滤。待全部悬液过滤后，向滤器中加入1毫升N2培养基，以冲洗残留的细胞通过筛网。将细胞悬液转移至15毫升锥形管中，在200 × g条件下离心6分钟。吸除上清液后，用2毫升N2培养基重悬细胞沉淀，然后加入N2培养基至总体积为10毫升。

在200 × g条件下离心5分钟。吸除上清液，再次重复沉淀洗涤步骤。用10毫升N2培养基重悬沉淀。

取出部分细胞，用血细胞计数板计数，然后再次进行离心。用N2培养基重悬细胞，使其最终浓度为每毫升1×10⁷个细胞，并以每平方厘米150,000至200,000个细胞的密度接种。在DIV−1时制备指示剂，并置于37°C的组织培养孵育箱中。

根据书面方案中的说明维护ESNs。首先，用ESN培养基将A型肉毒神经毒素稀释至所需终浓度的100倍，并将溶液预热至37摄氏度。然后，向培养21天后的ESN培养物中加入适量的毒素。

使培养皿中的细胞膨胀，并在预定时间后放回培养箱。用移液器吸除ESN培养基，并用细胞外记录缓冲液（ERB）洗涤两次。然后加入4毫升ERB，其中添加5微摩尔河豚毒素以阻断动作电位，以及10微摩尔双环林以拮抗GABAA受体活性。

接下来，将培养皿转移至电生理记录装置。在测量突触传递抑制或雾化实验时，无需灌流或温度控制。使用微电极拉制仪将硼硅酸盐玻璃毛细管拉制成电阻为5至10兆欧的电极，然后用细胞内记录缓冲液从后端填充一支电极。

然后轻轻地将移液管浸入硅试剂中。将记录电极固定在电极夹持器上，并将一个充满空气的注射器连接到通向电极夹持器的管路上。在将记录电极缓慢放入ERB的同时，通过注射器持续施加正压。

将记录电极轻轻放置在待记录神经元的表面后，通过推动注射器产生正压以打破密封。重新连接注射器，并通过轻柔抽吸施加持续负压，以形成吉欧姆密封。

形成吉欧姆封接后，将钳制电压降至负70毫伏。然后使用注射器小心施加短暂的负压脉冲，以进入全细胞记录模式。监测电容尖峰持续30秒，以确认膜片记录的稳定性。

在HEA软件中消除电容尖峰，并切换到电流钳模式，以监测和记录静息膜电位，无需校正液接电位。静息膜电位可能在负67至负82毫伏之间。将增益调节至每皮安2毫伏。

切换至电压钳制模式，并在负70毫伏条件下持续记录3至5分钟，以检测微小兴奋性突触后电流。使用MiniAnalysis软件中AMPA受体EPC的默认设置，分析3至5分钟的记录数据，检测mEPSC事件，并收集和保存所检测事件的相关信息。在每种处理条件下，分别收集8至12个对照样本和8至12个肉毒神经毒素处理样本的mEPSC频率数据。

将频率分析结果与年龄和批次匹配的对照组进行比较，然后使用适当的统计学方法分析第7天至第49天突触活性抑制百分比的统计学显著性。ESN表达神经营养性区室并形成突触样结构。树突-轴突界面。当暴露于肉毒杆菌神经毒素A型、TG型及破伤风毒素时，ESN突触活性受到抑制。

这些来自ESNs的代表性轨迹是在将不同血清型的肉毒杆菌神经毒素、A型TG破伤风神经毒素或对照溶剂加入浴液后20小时采集的。与对照组相比，每种神经毒素均使其突触活性降低超过95%。以下四幅图像显示了使用微滴检测法测定经A型肉毒杆菌神经毒素处理的ESNs中单突触活性的灵敏度。

第一张图像显示了在向浴液中加入A型肉毒杆菌神经毒素20小时后，突触活动测量失败的代表性轨迹。电压钳记录片段显示，暴露于A型肉毒杆菌神经毒素后，微型兴奋性突触电流（M-E-P-S-C）频率降低。该图像展示了M-E-P-S-C频率的定量分析结果，证实M-E-P-S-C频率呈剂量依赖性下降。半数抑制浓度通过非线性回归的四参数可变斜率模型进行最小二乘法拟合确定。需要注意的是，SNS中采用mist技术的检测下限至少为0.005 pM（皮摩尔）。

该柱状图显示了通过蛋白质印迹法测定的 SNAP25 裂解的流式细胞术定量结果。请注意，SNARE 蛋白裂解作为中毒读数的敏感性降低。与 mist 相比，单个星号表示 P 值小于 0.05。

三个星号表示 P 值小于 0.001。这些结果表明，由干细胞衍生神经元构成的网络化群体为梭菌性神经毒素中毒提供了一种生理学相关的、基于细胞的模型。使用 SNS 预计将显著减少动物痛苦和死亡，可作为小鼠致死试验的合适替代方法，且具有更快的速度、更高的特异性和敏感性。

该技术为神经毒理学领域的研究人员提供了途径，使其能够采用基于神经元网络活性的中等通量筛选技术，以促进针对梭菌类神经毒素的治疗药物筛选和毒素检测。