Name: 生物神经毒素在茎的网络文化功能评估细胞衍生的中枢神经系统神经元 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 5 s
Description: 了解如何利用小鼠胚胎干细胞分化成功能性神经元网络，并通过全细胞膜片钳电生理技术精确测量梭菌神经毒素对突触传递的抑制作用。该模型为研究肉毒中毒和破伤风的病理机制提供了重要的细胞学平台。

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本工作由美国国立卫生研究院过敏与传染病研究所（IAA 编号 AOD12058-0001-0000）和国防威胁降低局—联合科学技术办公室医学部资助&amp;#38;T 分部（资助编号 CBM.THRTOX.01.10.RC.023 和 CBM.THRTOX.01.RC.014）。本研究开展期间，P.B. 持有国防威胁降低局-国家研究委员会研究协会奖，K.H. 持有国家研究委员会研究协会奖。我们感谢 Angela Adkins 和 Kaylie Tuznik（USAMRICD）提供的技术协助，以及 Cindy Kronman（USAMRICD）提供的编辑协助。本文所表达的观点属于作者，不代表美国陆军部、国防部或美国政府的官方政策。

1. 将胚胎干细胞适应于无饲养层细胞的悬浮培养
<ol>
	<li>将 ESCs 在 37 °C 下解冻，直至仅剩少量冰晶。</li>
	<li>使用 P1000 移液器，轻柔地将 1 - 2.5 × 106 个解离的 ESCs 转移至含有 10 ml 预热 ESC 培养基的非组织培养处理培养皿中。在 37 °C、5% CO2 的湿化组织培养孵箱中孵育 20 小时。</li>
	<li>孵育 20 小时后，用 10 ml 血清移液管将悬浮培养物轻柔转移至 15 ml 圆锥形离心管中进行洗涤。在 200 × g 条件下离心 3 分钟以收集 ESCs。离心期间，向低黏附培养皿中重新加入 10 ml 新鲜 ESC 培养基。</li>
	<li>吸除上清液，注意避免扰动细胞沉淀，向细胞沉淀中加入 1 ml 新鲜 ESC 培养基。使用 P1000 移液器将细胞转移至细菌培养皿中，并放回孵箱继续培养。</li>
	<li>每日观察细胞，直至肉眼可见细胞聚集体（通常为 4 - 8 天；聚集体直径约为 0.2 - 0.5 mm）。若培养 4 天后仍未见明显聚集体，重复步骤 1.3。一旦观察到聚集体，按第 2 节所述方法对 ESCs 进行解离和维持培养。</li>
</ol>
2. 胚胎干细胞传代与维持
<ol>
	<li>使用无菌的10 ml移液管将ESC聚集体转移至15 ml锥形管中，静置使其沉淀形成紧密的细胞团（通常为3 - 5分钟）。小心吸除上清液，避免扰动细胞沉淀，并用5 ml PBS洗涤聚集体。虽然推荐使用重力沉降法，但为节省时间，也可选择在200 x g下离心2.5分钟以形成细胞沉淀。</li>
	<li>吸除PBS，加入500 µl胰蛋白酶。将聚集体置于37 °C水浴中消化3分钟。加入500 µl ESC培养基以中和胰蛋白酶，并使用P1000移液器轻柔吹打10次以分散聚集体。使用血细胞计数板对细胞进行计数。</li>
	<li>在200 x g下离心3分钟，沉淀解离后的细胞，然后将细胞重悬于ESC培养基中，调整终浓度为1.0 x 107 个细胞/ml。取150 µl（含1.5 x 106 个细胞）接种至10 ml新鲜ESC培养基中，置于10 cm细菌培养皿内，放回组织培养孵箱培养48小时。多余的ESC可用于诱导分化，或以1 - 5 x 106 个细胞/ml的密度悬浮于含10% DMSO的90% ESC培养基中进行冻存，或弃去。</li>
	<li>每48小时传代一次聚集体。适合传代的聚集体应清晰可见，直径超过0.5 mm。 
	注意：冻存的悬浮适应性细胞的复苏与培养请参照步骤1.2 - 1.4进行。聚集体通常在复苏后48 - 72小时内即可达到传代状态。</li>
</ol>
3. 神经元分化
注意：步骤 3.1 - 3.5 需在中午前完成，步骤 3.7 需在中午后进行。分化流程的概览见图 1A。
<ol>
	<li>按照步骤 2.1 - 2.5 消化 ESCs。转移 350 µl（3.5 x 106将解离的 ESCs 接种至含有 25 ml 分化培养基的 10 cm 低吸附培养皿中。置于组织培养孵箱内，37 °C、5% CO₂ 条件下，以 30 - 45 rpm 的转速在旋转摇床上培养2这是分化的第一天，称为第1天 体外 （DIV）-8 
	注意：使用超低吸附培养皿会增加方法成本，但与细菌培养皿相比可获得略高的产量，因为细胞聚集体有时会黏附于培养皿表面。若偏好使用不同规格的培养皿，可相应调整培养基体积和细胞数量。</li>
	<li>48 小时后（DIV -6），使用 25 ml 移液管将正在分化的细胞聚集体转移至 50 ml 锥形管中。立即向培养皿中加入 25 ml 新鲜分化培养基。</li>
	<li>静置2-5分钟，使细胞聚集体沉淀，形成肉眼可见、深度为1-2 mm的沉淀物。悬浮液中残留的单个细胞或小聚集体可忽略。小心吸除上清液，用P1000将细胞沉淀转移回培养皿中。置于组织培养孵育箱内的旋转摇床上。</li>
	<li>在DIV -4重复步骤3.2。沉淀物深度为2–4 mm。向培养皿中加入30 ml含6 µM全反式维甲酸（RA）的分化培养基。将培养皿放回组织培养孵育箱中的旋转摇床上，继续孵育48小时。</li>
	<li>在DIV -2时重复步骤3.3。此时沉淀物深度为4–8 mm。</li>
	<li>在 DIV -1，按照第 4 节的方法准备铺板表面。</li>
	<li>在 DIV 0 时，将 5 ml 预先分装并冷冻的 NPC 胰蛋白酶消化液于 37 °C 解冻 5–10 分钟，并置于组织培养超净台中。使用 25 ml 移液管将正在分化的细胞聚集体转移至 50 ml 锥形管中。静置使聚集体沉降，小心吸除上清液。用 10 ml PBS 洗涤沉淀物两次，每次洗涤之间均静置使聚集体沉降。</li>
	<li>第二次 PBS 洗涤后，向沉淀中加入 5 ml NPC 消化培养基，在 37 °C 下孵育 5 分钟。孵育 2.5 分钟后，轻轻弹击离心管。</li>
	<li>加入5 ml 0.1% 大豆胰蛋白酶抑制剂（STI）以灭活胰蛋白酶，通过倒置混匀。用10 ml血清移液管轻柔吹打10–15次，直至形成相对均一的细胞悬液。</li>
	<li>将细胞悬液缓慢转移至置于50 ml锥形管顶部的40 µm或70 µm细胞筛中。待全部悬液过滤后，加入1 ml N2培养基冲洗滤膜上残留的细胞，随后在200 × g离心6分钟，收集解离的细胞悬液。</li>
	<li>吸弃上清液，注意不要扰动细胞沉淀。用10 ml N2培养基洗涤细胞两次，每次以200 × g离心5分钟，两次洗涤之间用P1000移液器重悬细胞。第二次洗涤前，使用血细胞计数板对细胞进行计数。</li>
	<li>在 N2 培养基中重悬细胞，密度为 1 × 107 每毫升细胞数，并以每平方厘米150,000 - 200,000个细胞的密度接种ESNs2.</li>
	<li>将新接种的ESNs转移至37 °C、5% CO₂的湿化组织培养孵箱中2 并按照第5节中的要求进行维护。</li>
</ol>
4. 在 DIV 0 时准备用于接种神经前体细胞的培养表面
<ol>
	<li>至少在铺板前1天准备组织培养处理的培养皿。加入足量的聚乙烯亚胺（PEI；25 µg/ml，溶于无菌H₂O）2O) 或聚-D-赖氨酸（PDL；100 µg/ml，溶于无菌 H2O）覆盖经组织培养处理的塑料培养皿，于 37 °C 培养过夜。</li>
	<li>铺板当天早晨，用双蒸水将培养皿清洗两次2O 和 PBS 各一次。最后一次洗涤后，加入足量 N2 培养基以覆盖培养皿（例如， 12孔板每孔1 ml，或6 cm培养皿每皿4 ml。</li>
	<li>至少在神经元接种前一天准备18 mm玻璃盖玻片。使用等离子清洗仪清洗盖玻片4分钟。</li>
	<li>立即将清洗后的盖玻片转移至大号无菌培养皿底部预先用乙醇清洗过的Parafilm膜上，加入400 µl按步骤4.1配制的PEI或PDL溶液。于37 °C细胞培养箱中孵育过夜。</li>
	<li>在早晨，用蒸馏水洗涤盖玻片三次，然后加入含5 µg/ml 层粘连蛋白的PBS溶液，于37 °C孵育1 - 3小时。在分离神经元之前，吸除层粘连蛋白溶液，立即将盖玻片转移至含1 ml NPC培养基的12孔板中的一个孔内，注意保持处理面朝上。</li>
	<li>将培养皿和盖玻片保存在 37 °C 环境中，直至神经前体细胞准备铺板。</li>
</ol>
5. 神经元的维持
<ol>
	<li>在 DIV 1 时，吸除培养基，并更换为 N2 培养基。</li>
	<li>在 DIV 2 和 DIV 4 时，吸除培养基，并更换为 B27 培养基。</li>
	<li>在 DIV 8 时，吸除培养基，并更换为含有有丝分裂抑制剂的 B27 培养基，以清除污染的非神经元细胞。</li>
	<li>在 DIV 12 时，更换为 B27 培养基。</li>
	<li>在准备使用前，不要将 DIV 12+ ESNs 从 5% CO2 环境中移出。</li>
</ol>
用于定量微小兴奋性突触后电流的突触传递抑制测量（MIST）检测法
注意：梭菌神经毒素是已知最剧烈的毒物，其对人类的半数致死剂量（LD50）估计低至 0.1 - 1 ng/kg。使用此类毒素前必须获得必要的审批，并采取适当的防护措施。
<ol>
	<li>将BoNT/A用ESN培养基小心稀释至目标终浓度的100倍，并预热至37 ºC。向DIV 21+的ESN培养物中加入适量体积的毒素，轻轻摇晃培养皿后放回培养箱。</li>
	<li>若细胞在染毒后超过4小时才进行分析，应在5% CO2环境中直接添加毒素并轻轻摇晃，例如在培养箱内或恒定CO2环境中操作，避免取出培养皿。</li>
	<li>在适当时间点，吸除ESN培养基，并用细胞外记录缓冲液（ERB）洗涤两次。加入4 ml ERB，其中添加5.0 µM河豚毒素（tetrodotoxin）和10 µM荷包牡丹碱（bicuculline），分别用于阻断动作电位和拮抗GABAA受体活性。</li>
	<li>将培养皿转移至电生理记录装置。MIST检测无需灌流或温度控制。</li>
	<li>使用微电极拉制仪将硼硅酸盐玻璃毛细管拉制成记录电极，使其电阻为5–10 mΩ，并用细胞内记录缓冲液填充。记录前将填充好的电极轻轻浸入硅化试剂中处理。</li>
	<li>使用充满空气的注射器，在将记录电极下降至ERB溶液过程中施加正压。当电极轻柔地接触待记录神经元的胞体后，撤除正压并形成吉欧封接（gigaseal）。将钳制电压调至-70 mV，随后小心施加负压以进入全细胞记录模式。</li>
	<li>切换至电流钳模式，监测并记录静息膜电位。若未校正液接电位，静息膜电位通常在-67至-82 mV之间。</li>
	<li>在-70 mV电压钳模式下连续记录4–5分钟，以检测微小兴奋性突触后电流（mEPSCs）。</li>
	<li>使用峰检测软件分析4分钟的记录数据以识别mEPSC事件，设置如下：阈值，5；搜索局部最大值的时间窗口，10,000 µsec；峰前用于基线确定的时间，5,000 µsec；搜索衰减时间的窗口，20,000 µsec；用于确定衰减时间的峰幅比例，0.37；基线平均时间，1,000 µsec；面积阈值，20；用于平均峰点的采样点数，1；峰的方向，负向。</li>
	<li>收集并保存检测到的事件信息。将4分钟内检测到的事件总数除以240，计算出mEPSC频率（单位：Hz）。</li>
	<li>针对每种处理条件，收集8–12个对照组和8–12个BoNT处理组的mEPSC频率数据。将处理组与同龄、同批次的对照组进行比较。采用单因素方差分析（one-way ANOVA）及Dunnett’s post-hoc检验，评估突触活动抑制率的统计学显著性。</li>
</ol>

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</ol>

美国政府已提交了两项国际专利申请，其中包含了本文所述的方法：PCT/US2014/22042，标题为“利用突触活性检测神经毒素的方法”；以及PCT/US13/40641，标题为“使用干细胞衍生神经元进行毒素检测”。

目前，检测肉毒神经毒素（CNT）、确定其血清型及定量的金标准方法是小鼠致死试验法（MLA）。MLA可检测中毒发生所必需的全部宿主与毒素之间的相互作用。 体内 (例如， 毒素与细胞表面受体结合、毒素-受体复合物的内化、轻链（LC）转位至细胞质、轻链介导的底物切割以及突触神经递质传递的抑制18然而，尽管小鼠致死试验（MLA）提供了一种生理学上相关的中毒模型，但该方法资源消耗大，易受污染物干扰，且需要使用大量小鼠，以死亡作为实验终点。相比之下，基于细胞的肉毒神经毒素（BoNT）检测与定量方法目前仅限于原代神经元培养（同样需要使用动物）或神经母细胞瘤细胞系（此类细胞无法形成突触，通常对神经毒素的敏感性较差）8迄今为止，大多数基于细胞平台的中毒检测都依赖于对 SNAP-25、VAMP1/2 或 syntaxin-1 蛋白水解切割的检测 11。这一问题在于，SNARE 蛋白的切割已被证明与突触抑制呈非线性关联 体内 因此可能无法准确反映中毒或从中毒中恢复的状态19,20.
一种理想的基于细胞的CNT检测模型系统应具备以下特点：（i）以神经元为基础；（ii）具有突触连接并呈现神经元典型的电生理反应；（iii）对所有CNT血清型或亚型均具有高敏感性；（iv）具备可扩展性、高通量和检测周期等于或优于小鼠生物检定法（MLA）的性能，同时成本更低，且无需使用动物。为满足这些要求，我们开发了一种方法，利用市售的小鼠胚胎干细胞（ESC）系大量制备高度富集、形成神经网络的谷氨酸能和GABA能神经元培养物。随后，我们建立了MIST检测法，用于量化破伤风毒素（TeNT）以及肉毒毒素A型、G型（BoNT/A-/G）中毒后突触抑制的变化。MIST检测法可应用于任何具有突触活性的神经元群体例如， 原代神经元或脑切片），目前ESNs是唯一 体外 可重复地产生网络行为的衍生神经元模型，因此适用于MIST检测。
为碳纳米管研究生产足量特定谱系的神经元，需要在胚胎干细胞（ESC）培养与分化方面进行多项创新。首先，通过筛选并培养能够耐受悬浮适应的胚胎干细胞，我们消除了饲养层细胞污染的可能性，并避免了在分化起始阶段需将饲养层细胞从胚胎干细胞中纯化的步骤。尽管悬浮适应的分子机制尚不明确，但经过悬浮适应的胚胎干细胞仍保持有丝分裂活性，维持 Oct3/4 表达，并持续具有神经源性。采用该方法，每次传代通常可回收约 1.5 × 107 个胚胎干细胞。其次，通过在分化过程中引入机械搅拌以防止细胞聚集，使神经前体细胞（NPCs）的产量提高了约 300%，这可能提高了营养物质向类胚体内部的扩散效率。在此过程中，我们发现用于胚胎干细胞培养和神经分化的血清是维持其神经源性的最关键成分。为获得最佳效果，我们建议将胚胎干细胞针对每一批次的血清进行悬浮适应，并将血清在 -20 °C 下储备保存，以支持胚胎干细胞培养和神经分化直至血清有效期结束。
与大多数具有突触活性的培养物一样，DIV 14+ ESN 对 pH 的急剧变化高度敏感，即使短暂暴露于大气中的 CO2 浓度，也可能在 24 小时内导致神经毒性。对于需要对培养物进行处理并随后进行过夜或更长时间孵育的实验，应直接在培养箱内对神经元进行处理，或在实验前将其转移至维持恒定 CO2 浓度的培养室中。
多种技术证实了神经发生及神经元成熟，包括免疫细胞化学（ICC）、转录谱分析以及全细胞膜片钳电生理记录。基因表达和神经元形态的时序性变化表明神经发生发育阶段的快速进展；到体外培养第16天（DIV 16）时，兴奋性神经元网络（ESNs）表现出兴奋性和抑制性微小突触后电流，并呈现出初步的网络活动特征16。突触活动的证据提示，ESNs可能重现了导致肉毒中毒和破伤风临床表现的病理生理过程。通过MIST技术进一步证实，用BoNT/A-G或TeNT处理后，与载体处理或未处理的神经元相比，微小兴奋性突触后电流（mEPSC）频率下降超过&#62;95%。
MIST 对 A 型肉毒神经毒素（BoNT/A）的敏感性检测结果显示，其中位抑制浓度（IC50）为 0.013 pM（相当于 0.5 小鼠致死单位/ml），在浴式添加后 20 小时测得的检测下限低于 0.005 pM。根据这些数据，MIST 的灵敏度约为小鼠致死试验（MLA）的两倍，速度比 MLA 快 2 至 4 倍，且灵敏度比基于免疫印迹法检测裂解型 SNAP-25 的方法高约 30 倍。
综合这些数据表明，干细胞来源的神经元网络化群体为中毒研究提供了一种具有生理相关性的、基于细胞的模型。结合改进的从悬浮适应性胚胎干细胞（ESCs）衍生出网络化ESN培养物的方法，使用MIST技术有望减少对动物实验的需求，从而降低微流体阵列（MLA）相关的缺点、成本及伦理问题，同时提供更快速、更敏感且更特异的中毒检测手段。尽管全细胞膜片钳电生理技术在检测活性神经毒素存在方面通量较低，但其分辨率和检测速度是分子方法无法企及的。这些发现还表明，应用依赖于神经活动的方法来评估突触活动和网络行为，可能实现对神经毒素的快速且特异性检测。这类高通量方法将使得针对多种神经调节剂（包括CNTs）的机制研究、治疗药物筛选或诊断检测成为可能。

该方法的总体目标是功能性评估暴露于梭菌神经毒素的干细胞来源神经元网络化培养物中的突触活性。这是首次展示一种 体外 衍生模型，可功能性地复制导致肉毒中毒临床表现的病理生理过程，并验证了ESNs作为检测CNTs、药物筛选及机制研究的适宜模型。
肉毒神经毒素（BoNTs）是由梭菌属（Clostridium）细菌产生的高毒性细菌性神经毒素。包括最近提出的 BoNT/H 在内，目前已报道八种抗原性不同的 BoNT 血清型（/A–/H）1,2。所有血清型最初均表达为 150 kDa 的单链多肽，随后在翻译后被切割，形成由通过二硫键连接的 100 kDa 重链（HC）和 50 kDa 轻链（LC）组成的双链结构3。重链介导毒素与突触前膜受体的结合，并通过突触内吞作用进入神经元。在内体加工过程中，重链发生结构重排，在囊泡膜上形成孔道，促进轻链跨膜转位至突触前胞浆。随后，轻链特异性地靶向并切割突触前区室中的可溶性 N-乙基马来酰亚胺敏感融合蛋白受体（SNARE）蛋白：SNAP-25（BoNT/A、/C、/E）、VAMP2（BoNT/B、/D、/F、/G）或 syntaxin（BoNT/C）1。这些 SNARE 蛋白中任意一种的断裂均会阻碍突触外排机制的组装，从而阻断神经递质的释放。BoNTs 高效的神经元靶向能力和突触前定位特性使其成为目前已知最强烈的毒素，其对人类的致死剂量估计低至 0.1–1 ng/kg1。
生化检测可用于高灵敏度地检测CNT LC的存在或活性。然而，这些方法无法探究毒素与神经元结合、进入、激活及发挥功能的能力，因此仅能间接且可能具有误导性地反映活性毒素的存在。相比之下，以小鼠致死实验（MLA）为代表的中毒功能检测方法，能够全面评估CNT成功完成摄取和激活全过程的能力，从而更相关且特异地评估毒素的活性。尽管MLA是BoNT检测的金标准，但它是一种以死亡为终点指标的in vivo方法，因此作为研究平台的应用受到限制。尽管已有尝试开发适用于机制研究和治疗药物筛选的基于细胞的CNT中毒模型，但这些模型也存在显著局限性。虽然原代神经元培养具有较高的生理相关性，但其应用受到多种因素的制约，包括资源成本高、产量相对较低、存在多种神经元亚型，以及动物使用所涉及的严格监管和行政管理要求。作为原代神经元的替代方案，一些可通过化学刺激诱导获得类神经元特性的成神经细胞系（如神经母细胞瘤细胞）和肾上腺嗜铬细胞，已被用作in vitro中毒模型。由于这些细胞可在诱导前持续培养，具有高度可扩展性，因此非常适合中等通量的研究。然而，其生理相关性存疑，因为诱导后的表型通常具有异质性，对CNT的敏感性较差，并且缺乏关键的神经元行为特征，例如无法形成能够组装为功能性突触的突触前和突触后结构4。在缺乏生理上完整的突触前结构的情况下，毒素与神经元之间完整的相互作用过程无法被复制，因此无法进行中毒功能的检测5。毫不奇怪，利用诱导型成神经细胞系开展BoNT的机制研究或药物筛选所获得的结果，往往与in vivo实验及原代神经元研究的结果不一致6。
有研究提出，源自干细胞的中枢神经系统（CNS）神经元可能为肉毒神经毒素（BoNT）研究提供新一代的基于细胞的平台，该平台兼具原代神经元的相关性与培养细胞系的灵活性。7-10特别是，小鼠干细胞来源的神经元（ESNs）被发现对生理剂量的BoNT/A-G具有高度敏感性，并能重现许多 体内 对中毒的反应，包括不同的持续时间、活动增强型中毒以及血清型特异性效力5,8,11这些行为表明 体内 BoNT 摄取、加工、转运和活性的机制在 ESNs 中是保守的。然而，突触活性的抑制是肉毒中毒的典型表现，因此在得出 ESNs 是合适模型的结论之前，必须首先证明 CNTs 中毒后突触活性的丧失 体外 用于碳纳米管研究的衍生细胞模型。
为测量碳纳米管（CNTs）暴露对突触活性的影响，采用全细胞膜片钳电生理技术对经溶剂对照处理或碳纳米管处理的第21天体外培养神经元（DIV 21）中的单突触电流进行定量分析+ ESNs。我们发现，ESNs 被 BoNT/A-G 或 TeNT 中毒后会导致 &#62;所有情况下，20小时内突触活性损失达95%。在BoNT/A中毒后20小时进行的进一步表征显示，突触活性呈剂量依赖性变化，检测下限低于0.005 pM，IC50 0.013 pM。这些结果表明，与基于免疫印迹法检测SNAP-25切割的方法相比，电生理学检测中毒的灵敏度和时间分辨率均显著提高。 体内 小鼠致死性实验表明，在具有突触活性的神经元培养物中对中毒进行功能性检测，可能有助于建立更敏感、特异且快速的方法，以表征细胞对肉毒神经毒素（BoNT）的反应。

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;表1. ESC 和 ESN&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Knockout DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>10829-018</td><td>培养基：ESC 培养基&lt;br/&gt; 配方与备注：500 mL</td></tr><tr><td>100x MEM NEAA</td><td>Life Technologies</td><td>11140-050</td><td>培养基：4 &amp;deg;C 保存，最长1个月&lt;br/&gt; 配方与备注：6 mL</td></tr><tr><td>200 mM L-丙氨酰-L-谷氨酰胺</td><td>ATCC</td><td>30-2115</td><td>6 mL</td></tr><tr><td>ES级FBS</td><td>Applied Stem Cell</td><td>ASM-5007</td><td>90 mL</td></tr><tr><td>100x 抗生素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5955</td><td>3 mL</td></tr><tr><td>55 mM 2-巯基乙醇</td><td>Life Technologies</td><td>21985-023</td><td>1.1 mL</td></tr><tr><td>10&lt;sup&gt;7&lt;/sup&gt; Units/mL LIF</td><td>Millipore</td><td>ESG1107</td><td>60 &amp;mu;L</td></tr><tr><td>Knockout DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>10829-018</td><td>培养基：ESC 分化培养基&lt;br/&gt; 配方与备注：436.6 mL</td></tr><tr><td>100x MEM NEAA</td><td>Life Technologies</td><td>11140-050</td><td>培养基：4 &amp;deg;C 保存，最长1个月&lt;br/&gt; 配方与备注：5 mL</td></tr><tr><td>200 mM L-丙氨酰-L-谷氨酰胺</td><td>ATCC</td><td>30-2115</td><td>5 mL</td></tr><tr><td>ESC级血清</td><td>Applied Stem Cell</td><td>ASM-5007</td><td>50 mL</td></tr><tr><td>100x 抗生素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5955</td><td>2.5 mL</td></tr><tr><td>55 mM 2-巯基乙醇</td><td>Life Technologies</td><td>21985-023</td><td>0.9 mL</td></tr><tr><td>Dulbecco's PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td>培养基：NPC 消化培养基&lt;br/&gt; 配方与备注：100 mL</td></tr><tr><td>0.5 M EDTA (18.3%)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3690</td><td>培养基：分装成5 mL后冻存&lt;br/&gt; 配方与备注：0.266 mL</td></tr><tr><td>胰蛋白酶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8802</td><td>50 mg</td></tr><tr><td>聚乙烯亚胺（PEI）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3143</td><td>培养基：包被溶液&lt;br/&gt; 配方与备注：H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;0 中 2.5 &amp;micro;g/mL</td></tr><tr><td>聚-D-赖氨酸（PDL）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7280</td><td>培养基：1周内使用&lt;br/&gt; 配方与备注：H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;0 中 100 &amp;micro;g/mL</td></tr><tr><td>层粘连蛋白</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2020</td><td>H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;0 中 5 &amp;micro;g/mL</td></tr><tr><td>DMEM/F12 + GlutaMAX</td><td>Life Technologies</td><td>10565-018</td><td>培养基：NPC 培养基&lt;br/&gt; 配方与备注：492.5 mL</td></tr><tr><td>100x N2 维生素</td><td>Life Technologies</td><td>17502-048</td><td>培养基：4 &amp;deg;C 保存，最长1个月&lt;br/&gt; 配方与备注：5 mL</td></tr><tr><td>100x 抗生素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5955</td><td>2.5 mL</td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>Neurobasal A</td><td>Life Technologies</td><td>10888-022</td><td>培养基：ESN 培养基&lt;br/&gt; 配方与备注：482.5 mL</td></tr><tr><td>50x B27 维生素</td><td>Life Technologies</td><td>17504-044</td><td>培养基：4 &amp;deg;C 保存，最长1个月&lt;br/&gt; 配方与备注：10 mL</td></tr><tr><td>200 mM L-丙氨酰-L-谷氨酰胺</td><td>ATCC</td><td>30-2115</td><td>5 mL</td></tr><tr><td>100x 抗生素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5955</td><td>2.5 mL</td></tr><tr><td>5-氟-2'-脱氧尿苷（5FDU）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0503</td><td>培养基：2000倍有丝分裂抑制剂，分装后-20 &amp;deg;C 保存&lt;br/&gt; 配方与备注：将150 mg 5FDU 和 350 mg 尿苷溶于10 mL Neurobasal A中。无菌过滤，分装并冻存。在ESN培养基中使用2000倍稀释液。</td></tr><tr><td>尿苷</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U3003</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express 胰蛋白酶</td><td>Life Technologies</td><td>12605-010</td><td>培养基：其他&lt;br/&gt; 配方与备注：室温保存</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td>室温保存</td></tr><tr><td>大豆胰蛋白酶抑制剂（STI）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6414</td><td>-20 &amp;deg;C 保存</td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td>室温保存</td></tr><tr><td>抗坏血酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4403</td><td>通过将100 mg抗坏血酸溶于5.7 mL 50:50 DMSO/乙醇混合液中，配制100 mM 储存液。</td></tr><tr><td>视黄酸（RA）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R2625</td><td>将15 mg RA 溶于9 mL 50:50 DMSO/乙醇中。加入1 mL 100 mM 抗坏血酸储存液。分装后-80 &amp;deg;C 保存。可稳定6个月。</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;表2. MIST&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71386</td><td>培养基：细胞外记录缓冲液&lt;br/&gt; 终浓度（mM）：58.44&lt;br/&gt; 分子量：140</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60135</td><td>培养基：（ERB；pH = 7.3，315 mO）&lt;br/&gt; 终浓度（mM）：74.56&lt;br/&gt; 分子量：3.5</td></tr><tr><td>NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3139</td><td>培养基：4 &amp;deg;C 保存，至少6个月稳定&lt;br/&gt; 终浓度（mM）：119.98&lt;br/&gt; 分子量：1.25</td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>21115</td><td>终浓度（mM）：110.98&lt;br/&gt; 分子量：2</td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>63069</td><td>终浓度（mM）：95.21&lt;br/&gt; 分子量：1</td></tr><tr><td>D-葡萄糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8644</td><td>终浓度（mM）：180.16&lt;br/&gt; 分子量：10</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H0887</td><td>终浓度（mM）：238.3&lt;br/&gt; 分子量：10</td></tr><tr><td>K-葡萄糖酸盐</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1847</td><td>培养基：细胞内记录缓冲液&lt;br/&gt; 终浓度（mM）：234.5&lt;br/&gt; 分子量：140</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71386</td><td>培养基：（IRB；pH = 7.3，320 mO）&lt;br/&gt; 终浓度（mM）：58.44&lt;br/&gt; 分子量：5</td></tr><tr><td>Mg-ATP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9187</td><td>培养基：4 &amp;deg;C 保存，至少6个月稳定&lt;br/&gt; 终浓度（mM）：507.18&lt;br/&gt; 分子量：2</td></tr><tr><td>Li-GTP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5884</td><td>终浓度（mM）：523.18&lt;br/&gt; 分子量：0.5</td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>21115</td><td>培养基：4 &amp;deg;C 保存，至少6个月稳定&lt;br/&gt; 终浓度（mM）：110.98&lt;br/&gt; 分子量：0.1</td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>63069</td><td>培养基：4 &amp;deg;C 保存，至少6个月稳定&lt;br/&gt; 终浓度（mM）：95.21&lt;br/&gt; 分子量：1</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E3889</td><td>380.35</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H0887</td><td>培养基：4 &amp;deg;C 保存，至少6个月稳定&lt;br/&gt; 终浓度（mM）：238.3&lt;br/&gt; 分子量：10</td></tr><tr><td>荷包牡丹碱</td><td>Tocris</td><td>131</td><td>培养基：其他&lt;br/&gt; 终浓度（mM）：0.01&lt;br/&gt; 分子量：417.85</td></tr><tr><td>CNQX</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C239</td><td>终浓度（mM）：0.01&lt;br/&gt; 分子量：276.12</td></tr><tr><td>河豚毒素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8001</td><td>终浓度（mM）：0.005&lt;br/&gt; 分子量：645.74</td></tr><tr><td>BoNT/A-/G</td><td>Metabiologics</td><td>N/A</td><td>培养基：&lt;br/&gt; 终浓度（mM）：待定&lt;br/&gt; 分子量：150,000</td></tr><tr><td>破伤风毒素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3194</td><td>终浓度（mM）：待定&lt;br/&gt; 分子量：150,000</td></tr><tr><td>Sigmacote</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SL-2</td><td>终浓度（mM）：N/A&lt;br/&gt; 分子量：N/A</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;表3. 仪器与软件&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>MiniAnalysis（版本6.0.7）</td><td>Synaptosoft, Inc.</td><td>N/A</td><td>事件检测软件</td></tr><tr><td>Igor Pro（版本6.22A）</td><td>WaveMetrics</td><td>N/A</td><td>记录数据可视化软件</td></tr><tr><td>Patchmaster</td><td>Heka</td><td>N/A</td><td>数据采集软件</td></tr><tr><td>Olympus IX51 倒置显微镜</td><td>Olympus</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>显微操作器</td><td>Sutter Instrument</td><td>MPC-365</td><td></td></tr><tr><td>膜片钳放大器</td><td>Heka</td><td>ECB10USB</td><td></td></tr><tr><td>微电极拉制仪</td><td>Sutter Instrument</td><td>P-1000</td><td></td></tr><tr><td>硼硅酸盐毛细管</td><td>Sutter Instrument</td><td>B150-86-10</td><td>Corning 7740</td></tr><tr><td>18 mm 玻璃盖玻片</td><td>Fisher</td><td>12-545-84</td><td></td></tr><tr><td>等离子清洗仪</td><td>Harrick Plasma</td><td>PDC-32G</td><td></td></tr><tr><td>细胞筛（40 &amp;micro;m）</td><td>Fisher</td><td>08-771-1</td><td></td></tr><tr><td>Stovall Belly Dancer 摇床</td><td>Fisher</td><td>15-453-211</td><td></td></tr><tr><td>低吸附培养皿</td><td>Fisher</td><td>05-539-101</td><td>Corning 3262</td></tr><tr><td>细菌培养皿</td><td>VWR</td><td>25384-302</td><td>100 x 15 mm</td></tr></tbody></table>

利用干细胞来源的中枢神经系统神经元网络培养物对生物性神经毒素进行功能评估

Functional Evaluation of Biological Neurotoxins in Networked Cultures of Stem Cell-derived Central Nervous System Neurons

治疗性及作用机制研究受限于缺乏可扩展的、基于细胞的模型，该模型需能够形成有功能的突触并产生对中毒的生理反应。本文介绍一种简单且稳健的方法，可高效地将小鼠胚胎干细胞（ESCs）分化为具有突触活性并形成神经网络的特定谱系神经元。经过8天的分化程序后，小鼠胚胎干细胞来源的神经元（ESNs）迅速表达并区室化典型的神经蛋白，形成神经元形态，并发展出内在电生理反应。在分化后第18天（DIV 18），ESNs表现出活跃的谷氨酸能和γ-氨基丁酸（GABA）能突触，以及由兴奋性与抑制性平衡所特征的神经网络活动。为确定CNTs中毒是否在功能上拮抗突触神经传递，从而模拟临床毒性表型， 体内 负责肉毒中毒或破伤风临床表现的病理生理学机制，采用全细胞膜片钳电生理技术，定量分析暴露于破伤风神经毒素（TeNT）或A至G型肉毒神经毒素（BoNT）的人胚胎脊髓神经元（ESNs）中的自发性微小兴奋性突触后电流（mEPSCs）。在所有情况下，ESNs在20小时内表现出近乎完全的突触活动丧失。中毒神经元仍保持活性，表现为静息膜电位和固有电反应未发生改变。为进一步表征该方法的敏感性，在加入BoNT/A后20小时检测了中毒对突触活动的剂量依赖性效应。0.005 pM BoNT/A中毒即导致mEPSC显著减少，半数抑制浓度（IC500.013 pM。中位剂量比较表明，突触抑制功能检测比SNARE蛋白裂解实验或小鼠致死实验更快、更特异且更敏感。这些数据验证了利用突触连接的干细胞来源神经元进行高度特异且敏感的CNT检测的可行性。

我们开发了一种分化方案，可经济高效地从鼠胚胎干细胞（ESC）中大量制备高纯度的干细胞来源神经元（详见图1A）8,11。多年来，该方法已被用于稳定地将自行构建或商业获取的ESC系分化为特定谱系的神经元12-14。本方案的关键要素包括：（1）将ESC适应于无饲养细胞的悬浮培养；（2）正确维持悬浮培养状态；以及（3）在旋转条件下进行分化。转为悬浮培养可显著降低ESC维持所需的时间和成本，并避免在分化前去除饲养细胞的步骤。在适应悬浮培养后，Oct3/4的表达至少在连续传代30次后仍保持稳定，表明悬浮适应并未改变多能性标志物的表达水平（图1B-D）。当每次传代的细胞产量稳定超过1 × 107个细胞时，ESC即适用于神经元分化。这一状态通常在悬浮适应后约10次传代内达到，或在先前已适应悬浮的ESC解冻后5次传代内实现。研究还发现，对正在分化的细胞聚集体施加机械旋转对提高神经元产量至关重要。使用旋转摇床可消除过大聚集体的形成，提高聚集体的存活率，并使分化第0天（DIV 0）时神经前体细胞（NPCs）的产量提升约300%（图1E）。
典型的分化过程从 DIV -8 时的 3.5 × 106 个 ESC 开始，在 DIV 0 时可产生 115 × 106 个 NPC，其中约 60% 能够存活并分化为神经元。剩余的 40% 为非神经元细胞，主要通过 DIV 0 至 1 期间的血清剥夺被清除。残留的少量胶质细胞可通过在 DIV 2 至 4 或 DIV 8 至 12 添加有丝分裂抑制剂予以去除。DIV 0 时的铺板密度至关重要；若神经元铺板过稀，将无法存活超过 2 周。铺板后数天内，分化所得的神经元即呈现出典型的神经元形态，并对神经元特异性蛋白进行区室化分布，例如胞体-树突标志物 MAP2 和轴突标志物 Tau（图 2A）。到 DIV 14 时，可在轴-树突接触部位观察到 synapsin-1+ 突触样点状结构，提示突触形成。这与在 DIV 7 之前即出现突触标志蛋白表达的结果一致8,11。神经元形态持续成熟至 DIV 21，此时培养物呈现出复杂的轴-树突分支结构以及较大的突触样点状结构（图 2A）。若培养条件适宜，ESN 在铺板后至少可维持存活和功能活性达 4 周之久。
利用RNA测序进行的纵向表达谱分析证实了神经元特化与成熟的形态学和蛋白质组学证据11,15。代表发育进程的典型标志物表现出阶段特异性的表达模式，包括Oct3/4、Nestin、DCX、NeuN和KCC2（图2B）。在分化后第0天（DIV 0），ESN表达大量神经元特异性结构蛋白，如MAP2和Tau。与先前研究结果一致，仅观察到两种神经元亚型的标志物：表达vGluT2的中脑/后脑谷氨酸能神经元和GABA能中间神经元8。相应地，在DIV 0至DIV 7期间，多种谷氨酸能和GABA能标志物的表达显著上升，包括介导神经递质释放所需的突触前SNARE蛋白、介导突触后反应所需的神经递质受体，以及将这些受体锚定于突触后膜所需的支架蛋白。神经元在分化后第14天（DIV 14）表现出成熟的固有电生理特性，并在分化后第16天（DIV 16）出现自发性微小兴奋性突触后电流16。
测量突触传递抑制（MIST）实验用于评估中毒对突触活性的影响。通过比较中毒组与溶剂处理组在体外培养24天（DIV 24）时的微小兴奋性突触后电流（mEPSC）频率+ ESNs，MIST 能够基于突触活动的功能性抑制，对中毒程度提供定量且特异性的测量（图3A）。采用MIST检测在每种毒素浴式添加20小时后，BoNT/A-/G或TeNT对ESNs突触活性的影响。毒素添加浓度相当于10倍EC50 如先前通过SNARE蛋白切割的免疫印迹分析所确定的值11所有毒素均使其mEPSC频率降低至对照组（溶剂处理）的5%以下。突触频率的降低并非由细胞死亡或固有反应改变所致，因为中毒的ESNs仍可进行膜片钳记录，在电流刺激下可产生重复的动作电位，且静息膜电位未见显著改变。图3B,C).
为了比较MIST与现有方法检测CNTs的灵敏度，在向ESNs加入BoNT/A后20小时测定检测限和半数抑制浓度（IC50）。仅0.005 pM的BoNT/A即可导致mEPSC频率出现具有统计学意义的显著降低，IC50值为0.013 pM，当BoNT/A浓度高于0.5 pM时，突触活动完全被抑制（图4A）。该IC50值相当于约0.5小鼠致死单位/ml，表明MIST检测BoNT/A的灵敏度是MLA的两倍，且检测速度比MLA快2至4倍。通过免疫印迹法检测SNAP-25的切割情况，得到的EC50值为0.38 pM，最低可检测剂量为0.05 pM，表明MIST检测切割后的SNARE蛋白的灵敏度比基于免疫印迹的检测方法高约30倍（图4B）。
<img alt="ESC differentiation process; diagrams and charts of cell culture stages, cell viability, maturation." src="/files/ftp_upload/52361/52361fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 1"> 
图1. 悬浮培养适应的ESN细胞保持有丝分裂稳定性并表达多能性标志物。 (A) ESC 维持与分化的示意图。维甲酸（RA）或白血病抑制因子（LIF）的存在或缺失以 + 或 – 标记。不同天数之间的比较 体外 （DIV）和原代神经元培养的典型发育阶段（DS）17. (BR1、D3和C57BL/6J胚胎干细胞系在转为悬浮培养后，经过五次传代，增殖速率趋于稳定。C流式细胞术数据显示，在悬浮培养中连续传代25代的R1、D3和C57BL/6J胚胎干细胞系中，Oct3/4表达水平未发生显著变化（每组n = 6）。D) 悬浮适应性R1 ESC细胞系在传代5至30次期间常规传代的实际细胞产量（黑线）。同时展示了传代过程中无细胞丢弃情况下的理论累积产量（红线）。E) 静态（左）与旋转条件（右）下生成的DIV 0聚集体的明场图像。旋转条件生成无团聚的球形聚集体，并使神经前体细胞产量提高3倍（p &lt; 0.001，通过学生t检验确定）11. * 表示一个 P &lt; 0.05。此图已根据Hubbard修改 等11 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52361/52361fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="通过免疫荧光、基因表达数据、体外培养天数阶段及显微镜结果观察神经元发育。" src="/files/ftp_upload/52361/52361fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 
图 2. 神经元特化与成熟的形态学、蛋白质组学及转录组学证据。 （A）从体外培养第7天（DIV 7）至第49天（DIV 49）的免疫细胞化学结果显示神经元树突发育以及在轴突-树突连接处出现突触斑点。轴突用Tau蛋白标记（绿色），树突用MAP2标记（红色），突触前区室用突触素（synapsin）标记（白色），细胞核用DAPI染色（蓝色）。（B）代表性基因的纵向表达谱，显示发育阶段特异性表达及神经元亚型的特化情况。所有基因转录本的表达量均表示为每细胞中转录本的大致数量。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52361/52361fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="肉毒杆菌神经毒素电生理实验；膜电位分析图，动作电位记录。" src="/files/ftp_upload/52361/52361fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 3"> 
图 3. 当暴露于 BoNT/A-G 和 TeNT 时，ESN 发生突触活动抑制。 （A）在向浴液中添加约 10 × EC50 浓度的 BoNT/A - /G、TeNT 或载体后 20 小时采集的 ESN 的代表性记录。与对照组相比，每种神经毒素均使突触活动减少超过 95%。 （B）中毒神经元仍能在去极化电流注入时产生重复的动作电位（以 BoNT/A 为例，但在所有中毒培养物中均观察到此现象），且（C）其静息膜电位的负值未发生改变（C；每种处理组 n &gt; 18）。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52361/52361fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="BoNT/A inhibition effects, mEPSC frequency chart, protein cleavage Western blot, SNAP-25, syntaxin analysis." src="/files/ftp_upload/52361/52361fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 4"> 
图4. 确定MIST在BoNT/A处理的ESNs中的敏感性。 (A) 添加肉毒杆菌毒素A（BoNT/A）后20小时对突触活动进行MIST检测。电压钳记录的代表性片段显示，暴露于BoNT/A后微小兴奋性突触电流（mEPSC）频率降低（左侧）。对mEPSC频率的定量分析（右侧柱状图，对照组n = 20；各剂量组n = 11 - 22）证实mEPSC频率呈剂量依赖性下降。通过非线性回归的最小二乘法拟合四参数可变斜率模型，确定半数抑制浓度（R2 &gt; 0.91）。请注意，MIST 在 ESNs 中的检测下限至少为 0.005 pM。B) A型肉毒神经毒素（BoNT/A）对ESNs的中毒作用导致SNAP-25的裂解，可通过凝胶迁移率变化进行观察（左侧为代表性Western印迹图，右侧为SNAP-25裂解定量结果的柱状图；n = 4）。请注意，以SNARE蛋白（SNAP-25）裂解作为终点指标时敏感性降低（EC50 0.36 pM 与 MIST（IC50 0.013 pM）。* 表示一个 P &lt; 0.05；*** 表示一个 P &lt; 0.001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52361/52361fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>

本文描述了一种定制方案，用于将小鼠胚胎干细胞分化为特定的高纯度神经元群体，这些神经元具有功能性的突触并表现出网络活动特征。电生理学分析表明，在暴露于A至G型肉毒神经毒素及破伤风神经毒素后，突触传递功能丧失。

突触前靶向的梭菌神经毒素（CNTs）的治疗及机制研究一直受限于缺乏可扩展的……

本实验的目的是精确测量梭菌神经毒素对源自小鼠胚胎干细胞的神经元网络化培养物中突触传递的影响。首先将胚胎干细胞适应于无饲养层细胞的悬浮培养体系，并维持其多能状态；第二步是采用四阶段分化技术的改良方法，将已适应悬浮培养的干细胞分化为神经元，即 ESNs。接下来，将ESNs用一系列培养基处理，以促进其成熟为具有突触活性的神经网络。最后一步是用梭菌神经毒素或其他神经毒素处理ESNs，并采用全细胞膜片钳电生理技术检测其对单突触活性的影响。最终，通过电生理记录数据量化单突触活性的自发产生变化，数据经与同龄、同批次匹配的对照神经元归一化处理后，在不同条件（如剂量、时间或药物处理）之间进行比较。该技术的主要优势在于，ESN 是首个能够复制肉毒中毒和破伤风临床表现相关功能病理的基于细胞的模型。我们最初产生这一方法的想法，是源于发现 ESN 对所有基于 SNARE 蛋白切割的梭菌神经毒素高度敏感，同时在新生网络行为中表现出自发性突触活动。本次实验操作将由本实验室技术员 Megan Lyman 女士进行演示。首先，转移已适应的无饲养细胞悬浮培养物。将ESC集落转移至15毫升锥形管中，让集落沉降形成紧密的细胞沉淀。待集落完全沉降后，小心吸除上清液，注意不要扰动细胞沉淀。随后加入5毫升PBS洗涤细胞，并在100 × g下离心2.5分钟。小心吸除 PBS，然后加入 500 µL 胰蛋白酶，轻轻翻转离心管数次，以轻柔地分散细胞沉淀。随后将离心管放入 37 °C 水浴中，孵育 3 分钟。孵育结束后，将离心管放回细胞培养操作台，加入 500 µL ESC 培养基以稀释胰蛋白酶。然后用 P-1000 移液器将细胞悬液反复吹打 5 到 10 次，以获得单细胞悬液。使用血细胞计数板对细胞进行计数，并将剩余的细胞悬液在 200 × g 条件下离心 3 分钟。吸除上清液后，用 ESC 培养基将细胞重悬至最终浓度为 1 × 10⁷ 个细胞/毫升。接下来，将150 µL悬浮液转移至10 cm细菌培养皿中的10 mL ESC培养基中，在37°C、5% CO₂条件下培养。ESC通常采用此方案进行传代。每48小时进行一次常规细胞传代时，ESC开始向神经元分化。按照之前的方法消化 ESCs，但额外准备一个用于神经分化的培养板。将 350 微升细胞悬液转移至含有 25 毫升分化培养基的 10 厘米低吸附培养皿中。将培养皿置于组织培养孵箱内，37 摄氏度、5% 二氧化碳条件下，放置在转速设定为 30 至 45 转/分钟的摇床上，培养 48 小时。48小时后，使用25毫升移液管将正在分化的细胞团块转移至50毫升锥形管中。立即向培养皿中加入25毫升新鲜分化培养基。让聚集体静置两到五分钟，形成可见的沉淀，沉淀深度为一到两毫米。小心吸除上清液，忽略仍处于悬浮状态的单个细胞或小聚集体，使用 P 1000 移液器将细胞团重新转移回培养皿中。将培养皿放回培养箱中的旋转摇床继续培养。再经过 48 小时后，重复培养基更换操作。此次加入 30 毫升分化培养基，并补充 6 微摩尔的全反式维甲酸。细胞经培养后形成的细胞团块深度将达到 2 至 4 毫米。与之前相同，最后一次重复添加视黄酸的换液操作。次日此时，细胞沉淀物深度将达到四到八毫米。在铺板当天下午，按照方案书面部分所述准备铺板表面，或分别准备五毫升预温的涂有MPC的胰蛋白酶培养基和0.1%大豆胰蛋白酶抑制剂，均置于37摄氏度环境中。然后使用25毫升移液管将分化聚集体从培养板转移至50毫升锥形管中。让聚集体静置3至5分钟，然后小心吸除上清液，避免扰动沉淀。接着，在聚集体沉降后，用5至10毫升PBS洗涤沉淀。吸去PBS，重复洗涤一次。第二次PBS洗涤后，向沉淀中加入5毫升MPC化培养基，于37摄氏度孵育5分钟。孵育期间轻轻弹动离心管两到三次。接着，向细胞中加入5毫升0.1%大豆胰蛋白酶抑制剂，并通过倒置迅速混匀。然后用10毫升移液管轻柔吹打细胞10至15次，直至形成相对均一的细胞悬液。将细胞悬液缓慢通过置于50毫升锥形管上方的40或70微米细胞筛网进行过滤。待全部悬液过滤后，向滤器中加入1毫升N2培养基，以冲洗残留的细胞通过筛网。将细胞悬液转移至15毫升锥形管中，在200 × g条件下离心6分钟。吸除上清液后，用2毫升N2培养基重悬细胞沉淀，然后加入N2培养基至总体积为10毫升。在200 × g条件下离心5分钟。吸除上清液，再次重复沉淀洗涤步骤。用10毫升N2培养基重悬沉淀。取出部分细胞，用血细胞计数板计数，然后再次进行离心。用N2培养基重悬细胞，使其最终浓度为每毫升1×10⁷个细胞，并以每平方厘米150,000至200,000个细胞的密度接种。在DIV−1时制备指示剂，并置于37°C的组织培养孵育箱中。根据书面方案中的说明维护ESNs。首先，用ESN培养基将A型肉毒神经毒素稀释至所需终浓度的100倍，并将溶液预热至37摄氏度。然后，向培养21天后的ESN培养物中加入适量的毒素。使培养皿中的细胞膨胀，并在预定时间后放回培养箱。用移液器吸除ESN培养基，并用细胞外记录缓冲液（ERB）洗涤两次。然后加入4毫升ERB，其中添加5微摩尔河豚毒素以阻断动作电位，以及10微摩尔双环林以拮抗GABAA受体活性。接下来，将培养皿转移至电生理记录装置。在测量突触传递抑制或雾化实验时，无需灌流或温度控制。使用微电极拉制仪将硼硅酸盐玻璃毛细管拉制成电阻为5至10兆欧的电极，然后用细胞内记录缓冲液从后端填充一支电极。然后轻轻地将移液管浸入硅试剂中。将记录电极固定在电极夹持器上，并将一个充满空气的注射器连接到通向电极夹持器的管路上。在将记录电极缓慢放入ERB的同时，通过注射器持续施加正压。将记录电极轻轻放置在待记录神经元的表面后，通过推动注射器产生正压以打破密封。重新连接注射器，并通过轻柔抽吸施加持续负压，以形成吉欧姆密封。形成吉欧姆封接后，将钳制电压降至负70毫伏。然后使用注射器小心施加短暂的负压脉冲，以进入全细胞记录模式。监测电容尖峰持续30秒，以确认膜片记录的稳定性。在HEA软件中消除电容尖峰，并切换到电流钳模式，以监测和记录静息膜电位，无需校正液接电位。静息膜电位可能在负67至负82毫伏之间。将增益调节至每皮安2毫伏。切换至电压钳制模式，并在负70毫伏条件下持续记录3至5分钟，以检测微小兴奋性突触后电流。使用MiniAnalysis软件中AMPA受体EPC的默认设置，分析3至5分钟的记录数据，检测mEPSC事件，并收集和保存所检测事件的相关信息。在每种处理条件下，分别收集8至12个对照样本和8至12个肉毒神经毒素处理样本的mEPSC频率数据。将频率分析结果与年龄和批次匹配的对照组进行比较，然后使用适当的统计学方法分析第7天至第49天突触活性抑制百分比的统计学显著性。ESN表达神经营养性区室并形成突触样结构。树突-轴突界面。当暴露于肉毒杆菌神经毒素A型、TG型及破伤风毒素时，ESN突触活性受到抑制。这些来自ESNs的代表性轨迹是在将不同血清型的肉毒杆菌神经毒素、A型TG破伤风神经毒素或对照溶剂加入浴液后20小时采集的。与对照组相比，每种神经毒素均使其突触活性降低超过95%。以下四幅图像显示了使用微滴检测法测定经A型肉毒杆菌神经毒素处理的ESNs中单突触活性的灵敏度。第一张图像显示了在向浴液中加入A型肉毒杆菌神经毒素20小时后，突触活动测量失败的代表性轨迹。电压钳记录片段显示，暴露于A型肉毒杆菌神经毒素后，微型兴奋性突触电流（M-E-P-S-C）频率降低。该图像展示了M-E-P-S-C频率的定量分析结果，证实M-E-P-S-C频率呈剂量依赖性下降。半数抑制浓度通过非线性回归的四参数可变斜率模型进行最小二乘法拟合确定。需要注意的是，SNS中采用mist技术的检测下限至少为0.005 pM（皮摩尔）。该柱状图显示了通过蛋白质印迹法测定的 SNAP25 裂解的流式细胞术定量结果。请注意，SNARE 蛋白裂解作为中毒读数的敏感性降低。与 mist 相比，单个星号表示 P 值小于 0.05。三个星号表示 P 值小于 0.001。这些结果表明，由干细胞衍生神经元构成的网络化群体为梭菌性神经毒素中毒提供了一种生理学相关的、基于细胞的模型。使用 SNS 预计将显著减少动物痛苦和死亡，可作为小鼠致死试验的合适替代方法，且具有更快的速度、更高的特异性和敏感性。该技术为神经毒理学领域的研究人员提供了途径，使其能够采用基于神经元网络活性的中等通量筛选技术，以促进针对梭菌类神经毒素的治疗药物筛选和毒素检测。

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Research

科研

JoVE Journal

Neuroscience

神经科学

生物神经毒素在茎的网络文化功能评估细胞衍生的中枢神经系统神经元

本文介绍了一种新颖的实验方案和试剂组合，旨在利用高内涵分析技术，对化合物和处理因素在神经元与星形胶质细胞共培养体系中的神经毒性效应进行高灵敏度检测。结果表明，高内涵分析技术是评估神经毒性的全新且富有前景的技术手段。...

一种用于神经毒性高内涵分析的神经元与星形胶质细胞共培养实验方法

该视频展示了胚胎干细胞来源的神经元在暴露于神经毒素后的电生理学分析。用肉毒神经毒素处理这些神经元可降低自发性微小兴奋性突触后电流的频率，证实了突触传递受到抑制。...

一种评估毒素暴露对微型兴奋性突触后电流（mEPSCs）抑制作用的技术

本视频展示了一种将胚胎干细胞分化为具有功能性突触的神经元网络群体的技术。该方法概述了胚胎干细胞向神经元分化的步骤、神经元网络形成的诱导过程，以及培养物中网络化神经元的富集方法。...

将小鼠胚胎干细胞分化为神经元网络群体

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通过双染色法评估小脑神经元培养物中的神经元活力

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基于人多能干细胞的发育毒性检测方法用于化学品安全性筛选及系统生物学数据生成

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人诱导多能干细胞（hiPSCs）被认为是药物和化学物质筛选以及新药开发的有力工具 体外...

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人神经前体细胞来源神经元的神经突生长检测与神经毒性评估

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小鼠中枢神经系统干细胞移植的多模态成像

了解如何利用小鼠胚胎干细胞分化成功能性神经元网络，并通过全细胞膜片钳电生理技术精确测量梭菌神经毒素对突触传递的抑制作用。该模型为研究肉毒中毒和破伤风的病理机制提供了重要的细胞学平台。

利用干细胞来源的中枢神经系统神经元网络培养物对生物性神经毒素进行功能评估

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