生物神经毒素在茎的网络文化功能评估细胞衍生的中枢神经系统神经元

该程序的目标是精确测量梭菌神经毒素对源自小鼠胚胎干细胞的神经元网络培养物中突触传递的影响。这是通过首先将胚胎干细胞适应无饲养层细胞的悬浮培养物并将适应的细胞维持在多能状态来实现的。第二步是使用四种四分化技术的变体，将悬浮适应的干细胞分化为神经元或 ESN。

接下来，用一系列培养基处理 ESN 以促进成熟为突触活跃的网络神经元。最后一步是用梭菌、神经毒素或其他神经毒素处理 ESN，并使用全细胞膜片钳电生理学测量对单核细胞突触活性的影响。最终，从归一化为年龄和批次匹配的对照神经元的电生理记录中量化单核突触活动自发产生的变化，并在不同条件（如剂量、时间或药物治疗）之间进行比较。

该技术的主要优点是 ESN 是第一个基于细胞的模型，可以复制导致肉毒杆菌中毒和破伤风临床表现的功能病理。当我们发现 ESN 对所有基于圈套蛋白切割的梭菌神经毒素高度敏感时，我们首先有了这种方法的想法，并且在紧急网络行为中也证明了自发的突触活动。演示该程序的是我实验室的技术人员 Megan Lyman 女士首先转移适应的饲养层无细胞悬浮培养物。

ESC 聚集体聚集到 15 毫升锥形管中，让聚集体沉淀成紧凑的颗粒。聚集体沉淀后，吸出 SUP natant，同时注意不要破坏细胞沉淀。然后加入 5 ml PBS 洗涤细胞，并以 100 倍 G 离心 2.5 分钟。

小心吸出 PBS，然后加入 500 μL 胰蛋白酶，并将试管倒置数次，以轻轻破坏细胞沉淀。然后将试管放入 37 摄氏度的水浴中并孵育 3 分钟。孵育时间过后，将试管放回组织培养罩中，加入 500 微升 ESC 培养基以稀释胰蛋白酶。

然后用 P 1000 移液器将 CEL 悬液滴定 5 到 10 次，以获得单细胞悬液。使用血液、细胞仪对细胞进行计数，并以 200 倍 G 离心剩余的细胞悬液 3 分钟。吸出旋后，我们用 ESC 培养基将细胞悬浮至终浓度的 1 倍 cent，即每毫升 7 个细胞。

接下来，将 150 微升悬浮液转移到 10 厘米细菌培养皿中的 10 毫升 ESC 培养基中，并在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下孵育。E ESC 通常使用该方案传代。在常规细胞传代期间，ESC 每 48 小时分化为神经元一次。

像以前一样解离 ESC，但包括一个用于神经元分化的附加板。将 350 μL 细胞悬液转移到含有 25 mL 分化物的 10 cm 低附着皿中。中等。将培养皿放在设置为 30 至 45 RPM 的轨道摇床上，置于 37 摄氏度和 5% 二氧化碳的组织培养箱中，孵育 48 小时。

48 小时后，使用 25 mL 移液器将分化细胞聚集体转移到 50 mL 锥形管中。之后立即加入 25 毫升新鲜分化物。培养基到培养皿中。

让聚集体沉淀 2 到 5 分钟，产生 1 到 2 毫米深的可见颗粒。小心吸出培养基，忽略任何仍在悬浮中的单个细胞或小聚集体，并使用 P 1000 移液器将细胞调色板转移回培养皿中。将培养皿放回培养箱中的旋转摇床中。

再过 48 小时后，重复介质更换作步骤。这次在 30 毫升分化培养基中补充有 6 微摩尔全反式维甲酸。孵育细胞后，形成的沉淀现在将有 2 到 4 毫米深。

和以前一样，最后一次补充视黄酸重复培养基更换程序。第二天的此时，颗粒将深 4 到 8 毫米。在电镀当天下午按照方案的书面部分所述准备电镀表面，或在 37 摄氏度下准备预包被的 MPC 胰蛋白酶培养基和 0.1% 大豆试用蛋白酶抑制剂各 5 毫升。

然后使用 25 毫升移液器将区分聚集体从培养板转移到 50 毫升锥形管中。让聚集体静置 3 到 5 分钟，然后小心吸出培养基，不要干扰沉淀。接下来，用 5 到 10 毫升 PBS 洗涤沉淀，并在聚集体沉淀后洗涤沉淀。

吸出 PBS 并重复洗涤。第二次 PBS 洗涤后。向沉淀中加入 5 毫升 MPC 化培养基，并在 37 摄氏度下孵育 5 分钟。

在孵育过程中轻轻弹动试管 2 到 3 次。接下来，向细胞中加入 5 毫升 0.1% 大豆 tripsin 抑制剂，并通过倒置快速混合。然后用 10 毫升移液管轻轻研磨细胞 10 至 15 次，直到产生相对均匀的细胞悬液。

通过放置在 50 毫升锥形管顶部的 40 或 70 微米细胞过滤器缓慢过滤细胞悬液。然后，一旦所有悬浮液都以 1 毫升 N 2 过滤，将培养基放入过滤器中，通过过滤器洗涤剩余的细胞。将细胞悬液转移至 15 mL 锥形管中，以 200 次 G 离心 6 分钟，吸出培养基而不干扰沉淀物，在 2 mL N 2 培养基中研磨，然后加入 N 2 培养基至总体积为 10 mL。

以 200 次离心 5 分钟。G.吸出培养基并再次重复沉淀洗涤过程。复苏，将沉淀悬浮在 10 毫升 N 2 培养基中。

取出等分试样的细胞，用血细胞计数器计数，然后重复离心 Reese。将细胞悬浮在 N 2 培养基中，至终浓度为 1 乘以 10 至每毫升 7 个细胞，并以每平方厘米 150， 000 至 200， 000 个细胞的密度接种。印度狄香在 DIV 负 1 处制备，并置于 37 摄氏度的组织培养箱中。

根据书面协议中的说明维护 ESN。首先，将肉毒杆菌神经毒素血清型 A 稀释至所需最终浓度的 100 倍，在 ESN 培养物中，中等温度并加热至 37 摄氏度。然后向 DIV 21 和 ESN 培养物中加入适量的毒素。

使培养皿膨胀，并在所需时间放回培养箱中。点吸出 ESN 培养基，并用细胞外记录缓冲液或 ERB 洗涤两次。然后加入 4 毫升 ERB，补充有 5 微摩尔河豚毒素以阻断动作电位和 10 微摩尔双胆碱以拮抗 gabaa 受体活性。

接下来，将培养皿转移到电生理装置上。测量突触传递抑制或雾测定不需要灌注或温度控制。使用微量移液器拉拔器以 5 至 10 兆欧姆的电阻拉动硅酸盐移液管后，用细胞内记录缓冲液回填移液器。

然后将移液器轻轻浸入硅试剂中。将记录移液器固定到电极支架上，并将充气注射器连接到端口到电极支架中的管道上。通过注射器提供稳定的正压，同时将记录移液器放入 ERB 中。

将记录移液管轻轻降落在要记录的神经元的 SOR 上后。通过打破注射器上的密封来查看正压。重新连接注射器，通过轻柔的吸气施加持续的负压，以形成千兆欧姆密封。

形成千兆密封后，将保持电压降低到负 70 毫伏。然后小心地使用注射器施加短脉冲负压，以闯入整个细胞配置。监测电容尖峰 30 秒，以确认贴片稳定。

在 HEA 软件中消除电容尖峰并切换到电流钳模式，以监测和记录静息膜电位，而无需调整液接电位。静息膜电位可能在零下 67 到零下 82 毫伏之间。将增益调整为每皮安培 2 毫伏。

切换到电压钳模式并执行 3 到 5 分钟的连续负 70 毫伏记录，以检测微型兴奋性突触后电流。在小型分析中使用 AMPA 受体 EPC 的默认设置分析 3 到 5 分钟的记录数据以检测 PSC，收集并保存有关检测到的事件的信息。在收集 8 至 12 个对照和 8 至 12 个肉毒杆菌神经毒素处理的样品的 M-E-P-S-C 频率后，针对每种暴露条件

根据年龄和批次匹配的对照分析频率，然后使用从 div 7 到 div 49 的适当统计测试确定突触活动抑制百分比的统计显着性，ESN 表达嗜神经区室并形成突触穿刺。Taxo 树突界面.当暴露于肉毒杆菌神经毒素血清型 a TG 和破伤风毒素时，ESN 会受到突触活性的抑制。

这些来自 ESN 的代表性痕迹是在浴后 20 小时收集肉毒杆菌神经毒素血清型、A TG 破伤风、神经毒素或载体。与对照组相比，每种神经毒素的突触活性降低了 95% 以上。以下四张图片显示了使用雾气测量肉毒杆菌神经毒素血清型 A 处理的 ESN 中单体突触活性的灵敏度。

第一张图片显示了沐浴版肉毒杆菌神经毒素血清型 A 后错过突触活动测量的代表性痕迹 A.电压钳痕迹段在暴露于肉毒杆菌神经毒素血清型 A 后显示 M-E-P-S-C 频率降低.该图像显示了 M-E-P-S-C 频率的定量，并确认了 M-E-P-S-C 频率的剂量依赖性降低。使用四参数可变斜率的非线性回归的最小二乘拟合确定中位抑制浓度。请注意，SNS 中雾的检测限至少为 0.005 皮摩尔。

该条形图显示了通过 western blot 测量的 SNAP 25 切割的细胞术定量结果。请注意，作为中毒读数的圈套蛋白切割的敏感性降低。与 mist 相比，单个星号表示 P 值小于 0.05。

三个星号表示 P 值小于 0.001。这些发现表明，干细胞衍生神经元的网络群体提供了一种生理相关的基于细胞的梭菌神经毒素中毒模型。使用 SNS 作为小鼠致死性测定的合适替代品，有望显着减少动物的痛苦和死亡，并具有提高速度特异性和灵敏度的额外好处。

该技术为神经毒理学领域的研究人员采用基于神经元网络活动的中等通量筛选技术铺平了道路，以促进梭菌神经毒素的治疗筛选和毒素检测。