一个简单的临界尺寸股骨缺损模型小鼠
March 15th, 2015
动物模型在生物医学研究中经常被用来模拟严重的骨损伤。由于它们的体积小，在小鼠中建立稳定的骨病变超出了大多数研究小组的能力。在此，我们描述了一种建立和分析小鼠实验性股骨缺损的简单方法。
该程序的总体目标是在小鼠股骨中产生一个简单的、实验性的、临界大小的缺陷。这是通过首先用手术钢管制作髓钉来实现的。在第二步中，在麻醉小鼠的股骨中产生临界大小的缺陷。
然后植入针以稳定骨骼。最终，X 线照相和组织学可用于评估骨愈合程度。在尝试此程序时，重要的是要记住仅使用当前的镊子固定骨骼，并确保项圈与切割骨的边缘齐平。
首先将 10 微升氰基丙烯酸酯粘合剂放在一根 9 毫米的 22 号不锈钢皮下注射管的轴中间。将一个 3 毫米的套环穿过轴，直到它到达中心，然后扭转它以使胶水在套环和轴之间均匀分布，如图所示。可以针对研究和接收者的特定目的设计各种引脚配置原型。
接下来，用一对数字卡尺测量引脚的尺寸。每个部分的长度应约为 3 毫米。让衣领凝固至少 15 小时，然后使用两个 20 粒度的 Emory 浸渍圆盘去除任何毛刺或过多的胶水。
接下来，使用旋转工具用毛毡抛光盘抛光销钉，然后用去离子水冲洗销钉并用压缩空气干燥。现在，通过将 19 号皮下注射钝针放在销轴上并将针头推向项圈来测试完整性，以确认项圈可以抵抗大约 25 克的重量。然后在无菌过滤的 PBS 中冲洗销钉，并通过将销钉滑入骨标本的股骨髓腔来测试贴合度，确保轴与项圈齐平与切割骨的边缘齐平。
确保销钉的末端也穿透骨干的小梁骨，以最大限度地固定并提高过盈配合。用皮肤活检刀打出一个 3 毫米的凝胶泡沫圆柱体，然后用 21 号针刺穿中心。然后穿过明胶泡沫圆筒并将其与项圈对齐。
最后，在 120 摄氏度和 15 PSI 的干燥循环中高压釜销。通过适当的机构批准的方法确认镇静后，泡沫会变干变暗。通过将麻醉剂后肢朝上放在无菌窗帘上来开始外科手术。
在动物身上涂抹眼膏，然后在去除皮毛后，用干净的开孔窗帘覆盖动物，并找到股骨的近端和远端晶状体。沿纵轴切开皮肤 5 到 10 毫米。然后使用 15 号手术刀将皮肤层与筋膜分开，通过 MA 和外侧前膜的二头肌露出通往股骨的外侧入路。
找到两块肌肉的隔膜位置。在肌肉的粉红色上遇到一条白色组织线，手术刀沿着这个肌间边界小心地解剖，直到可以看到股骨。接下来，使用钝骨膜电梯开发切口，以暴露整个骨干。
然后进一步暴露股骨的中央三分之二，注意保留内侧的后神经血管束。用手术刀轻轻刮下骨头上的软组织，然后用无菌的棉签涂抹器擦干骨头。现在使用无菌尺或卡尺定位股骨中心，并在距中心约 1.5 毫米和远端的骨头上标记。
然后用一对以前以当前样式制作的细鼻镊子轻轻抓住股骨，并使用装有细金刚石砂涂层切割轮的细钻头进行第一次切割，并在电梯就位以保护组织的情况下进行第一次切割。下面。将切开的股骨抬高至 45 度，同时牢牢握住骨干的末端。进行第二次切割，去除一个 3 毫米的段，骨头用镊子固定。
用钝的 23 号皮下注射针小心地铰孔每端的髓腔。然后使用由 22 号管制成的预制深度计放置在 19 号管中，确认腔体深度为 3 毫米。骨头准备好后，将准备好的销钉插入近端髓腔，然后插入远端髓腔，使股骨恢复到原来的长度，并建立稳定的 3 毫米间隙。
确认销钉紧贴两个髓腔，并且切割骨的边缘与衣领齐平。然后将肌肉和外周组织重新定位在针上，并用连续的可吸收五零缝合线将其闭合。用 5 个 7 方结尼龙、5 个 0 缝合线闭合皮肤，并用手术粘性动物密封切口。
根据 A VMA 指南和 IACUC 批准的方案实施安乐死。两到五周后，从动物的内侧暴露股骨近端和骨盆，小心地解剖掉后肢。然后从肢体的外侧轻轻向内按压关节，同时用手术刀将股骨头从髋臼上分离。
使用锋利的手术刀切掉剩余的肌肉和皮肤，将整个肢体从骨盆中释放出来。然后切掉膝关节下方约 5 毫米处多余的组织和下后肢，并去除皮肤，将肌肉留在原位。接下来，将组织固定在补充有 10 毫摩尔氯化钙固定剂的 10% 缓冲福尔辛中一周，然后在成像前储存和补充有 10 毫摩尔氯化钙的 PBS 长达一个月。
要分析标本，请将组织包裹在一层薄薄的塑料天花板中。拍摄并垂直放置它们，一次一个。在显微 CT 成像室中，将扫描设置为以下参数。
电压为 29 千伏，电流为 661 毫安，功率为 19 瓦。图像像素大小为 21 微米。360 度旋转 yes 帧平均到旋转时，步长到 1 度，随机移动到 on。
获取每张图像后，每次扫描时，请将它们作为 jpeg 文件保存在单个目标文件夹中。然后，使用每个文件的轴向图像和分析软件，选择包含环的部分，以设置原始缺陷的近端和远端边缘，并定义感兴趣区域。最后，在衣领周围画一个边距为 100 微米的排除区，将其从计算中排除，然后将该区域转移到感兴趣区域中的每个截面。
在没有治疗干预的情况下，缺损的边缘通常在手术后的前 0.5 天内延伸 21 毫米。愈合 14 至 21 天后，可以从显微 CT 扫描生成的轴向图像中轻松确定新骨的体积。生成的新骨的体积随着时间的推移而增加，但通常不会超过一立方毫米的总量。
在 21 天后没有治疗干预的情况下，距病变边缘 0.25 毫米的新骨的极惯性矩范围为 0.05 至 0.35 毫米四分之一，而病变中心为 0.02 至 0.08 毫米四分之一。进一步证实了在未经治疗的病例中存在不愈合，如该代表性图像所示，Mason 的 TRI chro 染色，脱钙纵切的染色允许可视化软骨内骨生长，软骨前缘后跟松质骨。虽然在解剖过程中不可避免地会发生一些损伤，但如果小心地去除针钉，骨骼和结缔组织的组织学结构将保持清晰。
或者，可以在疼痛就地的情况下进行甲基丙烯酸甲酯包埋和未脱矿切片。一旦掌握，这项技术可以在 30 分钟内完成。按照 CAR TPCR 微阵列或免疫印迹等方法，可以对回收的组织进行以下作，以回答其他问题，例如，某些基因型细胞、蛋白质甚至化合物如何影响骨骼修复？在我们的研究中，我们在免疫功能低下的小鼠中使用人类细胞和人类蛋白质。
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概述
本文介绍了一种在小鼠股骨中创建和分析临界大小缺损的方法，该方法对于研究骨愈合至关重要。该程序涉及使用髓针进行稳定，并通过放射影像学和组织学进行随后评估。
关键研究组成部分
科学领域
- 生物医学研究
- 骨骼损伤建模
- 实验手术
背景
- 动物模型对于研究骨骼损伤至关重要。
- 小动物模型，特别是小鼠，常被使用。
- 建立稳定的骨病变对研究人员来说可能具有挑战性。
- 该方法旨在简化创建股骨缺损的过程。
研究目的
- 开发一种简单的技术，用于在小鼠股骨中创建临界大小缺损。
- 促进对骨愈合过程的分析。
- 为未来的生物医学研究提供一个可靠的模型。
使用的方法
- 从外科钢管制造髓针。
- 在麻醉小鼠的股骨中引起临界大小缺损。
- 植入针以稳定骨骼。
- 通过放射影像学和组织学评估骨愈合。
主要结果
- 该方法成功地在股骨中产生了临界大小缺损。
- 通过髓针实现了缺损的稳定。
- 放射影像学和组织学分析提供了对骨愈合的见解。
- 该程序是可重复的，可以被各种研究小组使用。
结论
- 该方法提供了一种简单的方法来研究小鼠的骨愈合。
- 它可以增强对骨骼损伤和修复机制的理解。
- 未来的研究可以在这一技术的基础上进行进一步的见解。
常见问题
Executive Industry Relevance
Establishing reliable preclinical models of critical-size bone defects is essential for evaluating osteoinductive therapies and de-risking bone regeneration strategies. This murine femoral defect model enables target validation in genetically tractable systems, supporting mechanistic de-risking of therapeutic candidates prior to larger animal studies. The model provides quantitative endpoints for assessing de novo bone formation, directly informing go/no-go decisions in preclinical portfolios focused on bone repair.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses in immune-compromised mice engrafted with human cells or proteins.
- Operational Value: Supports functional target validation by establishing a reproducible, non-healing defect model for pathway clarification.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides a stabilized defect model suitable for standardized assessment of compound effects on bone healing.
- Operational Value: Facilitates assay readiness through quantitative microCT and histological readouts that enable reliable compound evaluation.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Offers disease-relevant segmental defect morphology aligned with clinical non-union phenotypes.
- Operational Value: Ensures continuity from discovery through preclinical validation via standardized stabilization and longitudinal imaging.
Pipeline & Workflow Integration
The model fits within the discovery continuum from target validation to preclinical efficacy testing, enabling iterative assessment of bone-healing agents.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by allowing genetic and pharmacological modulation of bone repair pathways in a controlled defect environment.
- Screening: Delivers assay readiness through quantitative volume and polar moment of inertia measurements that support comparative condition analysis.
- Analytics: Provides statistical outputs including de novo bone volume and mechanical property metrics that help teams compare therapeutic interventions.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity through histomorphometric validation of endochondral ossification patterns relevant to clinical healing.
- Enterprise Reuse: Represents a reusable surgical platform for longitudinal studies across multiple therapeutic modalities and genetic backgrounds.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target engagement through quantifiable bone formation metrics in a genetically manipulable system.
- Operational Value: Standardization and reproducibility via pin stabilization protocol and defined defect size (3mm segmental gap).
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions by reducing biological ambiguity in bone healing assessment.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization based on longitudinal bone regeneration data across dosing regimens.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microsurgical techniques and rodent anesthesia.
- Necessitates access to precision tools including rotary tools, digital calipers, and microCT imaging systems.
- Demands cross-team standardization of suture techniques and postoperative care protocols.
- Involves adaptation considerations for varying mouse strains and ages affecting bone density and healing kinetics.
- Includes practical limitations related to the technical challenge of maintaining pin stability and collar flush alignment during implantation.
