Name: 一个简单的临界尺寸股骨缺损模型小鼠 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 41 s
Description: 了解小鼠股骨临界尺寸缺损模型的建立方法，使用髓内针固定缺损部位，并通过放射成像和组织学分析评估骨愈合过程。该技术为骨再生研究提供了可靠的实验模型。

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我们感谢斯科特动物医院的工作人员和兽医团队 &amp;#38; 白色医院比较医学科，德克萨斯州坦普尔，感谢他们在本技术开发过程中提供的宝贵建议和协助。本工作部分由再生医学研究所项目基金、Scott &amp;#38; 白色RGP资助 #90172，NIH 2P40RR017447-07 和 NIH R01AR066033-01（NIAMS）。我们感谢Suzanne Zeitouni博士对稿件的审校。

注意：本实验方案专为来自杰克逊实验室（Jackson Laboratories）的雌性裸鼠（Nu/J）（18–25 g，6周龄）设计。由于不同品系小鼠在解剖结构和生长速率上存在轻微差异，建议在将针体植入活体动物之前，根据受体小鼠的品系、性别和年龄优化针体的制备。若品系匹配得当，针体与骨髓腔之间的过盈配合具有高度可重复性。有关动物饲养、饮食及常规动物管理的操作程序不在本方案范围内，但所有小鼠的饲养均遵循《实验动物护理与使用指南》。 (8th 版本 以及斯科特与怀特医院的机构动物护理与使用委员会（IACUC）和比较医学部（DCM）制定的机构政策。
1. 针的制备
<img alt="骨植入物组装过程；逐步示意图，展示针、套管、明胶海绵及X射线分析。" src="/files/ftp_upload/52368/52368fig2highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 
图 2：针的组装。（A） 外科级不锈钢管在不同组装阶段的照片，以及从5 mm厚的明胶海绵片上切割下的直径为4 mm的圆柱体。（B） 组装好的针经抛光后（上方），将明胶海绵圆柱修剪并套在钢制套管上（中间），然后进行高压灭菌，得到被干燥明胶海绵包覆的无菌针（下方）。这有助于在损伤部位增强细胞附着，并维持愈合方向。（C） 安装了髓内针的切除股骨。（D） 不同厚度和长度的针组装示例，展示了该方法的灵活性。（E） 髓内针固定股骨缺损的µCT重建图像，显示髓内针与股骨近端和远端小梁骨之间的相互作用。
<ol>
	<li>使用安装在旋转工具上的直径为23.8 mm的玻璃纤维增强型重型切割轮，截取一段9 mm长的22 G不锈钢皮下注射针管，以及一段3 mm长的19 G针管。用小型精细尖头镊子固定针管（图2A，上方）。操作时应佩戴适当的眼部防护装备，并小心使用旋转工具。</li>
	<li>将少量（约10 µl）氰基丙烯酸酯粘合剂涂于9 mm长的针杆中部。将3 mm长的套管套入9 mm针杆，推至中心位置，并旋转以使胶水在套管与针杆之间均匀分布。使用数字卡尺测量尺寸，并与图1进行比对。静置至少15小时使其完全固化（图2A，中部）。</li>
	<li>使用220目砂轮片去除毛刺和多余的胶水。</li>
	<li>使用旋转工具配合毛毡抛光盘对针体进行抛光。</li>
	<li>用去离子水冲洗，并用压缩空气吹干。</li>
	<li>通过将一根19 G的钝头皮下注射针套在新制作的针杆上并抵住套管施加压力，测试其结构完整性。确保套管能够承受约25 g的重量。</li>
	<li>用无菌过滤的磷酸盐缓冲液冲洗针体（图2B，顶部）。确保针杆能紧密嵌入股骨髓腔，且套管与截骨边缘齐平（图2C）。根据研究的具体目的和受体需求，制作不同构型的原型（图2D）。确保针的两端穿入骨干的松质骨中，以最大化固定效果并增强过盈配合（图2E）。 
	注意：建议在活体小鼠植入前，先在骨标本上测试适配性（例如，图2C）。</li>
	<li>使用直径为4 mm的穿刺活检打孔器，从厚度为5 mm的外科明胶海绵片上切取一个圆柱体。用手术刀将圆柱体修整至3 mm长度，并沿其长度方向穿入一根20 G皮下注射针，以形成孔道（图2A，下方）。 
	注意：我们发现，在缺损部位放置明胶或胶原支架有助于提高细胞滞留率，并诱导沿骨轴方向的纵向生长。</li>
	<li>将明胶泡沫圆柱体套在针上，并与套管对齐（图2B，中部），然后在120 °C、15 psi条件下进行干热高压灭菌。明胶泡沫将变干并颜色加深（图2B，下方）。</li>
</ol>
2. 手术技术
注意：以下操作步骤严格遵循《实验动物护理与使用指南》中的各项规定 (8th 版次请遵守当地IACUC制定的所有附加政策，并在开展以下操作前确保已具备经IACUC批准的动物使用方案（或同等文件）。
<img alt="显微外科手术的手术器械和设置；包括手术刀、镊子和持针器。" src="/files/ftp_upload/52368/52368fig3highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图3"> 
图3：手术器械。（A）手术器械包。微型钻机（1）、切割轮（2）、可吸收缝线（3）、外缝线（4）、手术刀片（5）、手术刀柄（6）、用铝箔包裹的无菌髓内针（7）、由注射器管制成的髓腔深度测量计（8）、尖头镊（9）、鼠齿镊（10）、钝头扩髓针（11）、持针器（12）、小型止血钳（13）、精细剪刀（14）、骨膜剥离器（15）、改良Kern镊（16）。（B）：为小鼠制备Kern型骨夹所需进行的改装。
<ol>
	<li>选择一个有可关闭门且无人员穿行的手术室或洁净实验室。使用临床级季铵盐类消毒清洁剂对合适的工作台面进行消毒。</li>
	<li>佩戴一次性无菌手套和无菌手术衣，在已消毒的工作台面上铺设经高压灭菌的布巾，建立一个约 60 x 90 cm2 的无菌区域。 
	注意：建议由助手拆除外包装，并将无菌材料递交给设置无菌区域的研究人员。</li>
	<li>在布巾上放置连接温水循环器的消毒加热垫，并覆盖一次性无菌布巾。将 bead 灭菌器预热至工作温度（250–265 °C，此过程最长需 30 分钟）。</li>
	<li>在无菌区域内摆放手术器械包（图 3A），确保所有组件均易于取用。同时准备无菌棉纱布（2 x 2 英寸2）、无菌棉签、一个盛有无菌生理盐水（0.9% w/v）的无菌不锈钢碗（500 ml），以及氯己定/异丙醇外科消毒涂抹器。</li>
	<li>在无菌区域旁安装小型动物麻醉机，配备诱导室和鼻罩装置，操作应符合兽医指导原则和用户手册要求。使用临床级氧气作为气源，并使用 USP 级异氟烷。</li>
</ol>
<img alt="实验研究中显示小鼠肝移植手术步骤的示意图。" src="/files/ftp_upload/52368/52368fig4highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 4"> 
图 4：手术步骤。（A-C）股骨的入路与暴露。（D-E）骨膜剥离与截骨。（F-K）髓腔的扩髓与测量。
<img alt="在动物组织上进行缝合、夹闭和血管造影的手术操作序列。" src="/files/ftp_upload/52368/52368fig5highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 5"> 
图 5：手术操作。（A-B）置入钢针。（C-D）关闭切口。（E）术后24小时钢针位置正确的典型图像。
<ol start="6">
	<li>将一只小鼠放入麻醉系统的诱导室，并将输出设置为 2 L min-1 O2 并将异氟烷浓度调整至3%（v/v）。
	<ol>
		<li>1分钟内检查小鼠是否失去意识；必要时将麻醉剂浓度提高至4%（v/v）。取出小鼠，置于无菌区域，加热垫置于下方，并连接鼻式麻醉器。将气流切换至鼻式麻醉器，将异氟烷浓度降至2.5%，再等待20秒，根据机构规定评估手术麻醉深度。通常情况下，轻捏后肢无反射即可判断麻醉程度充分。</li>
		<li>在整个过程中，应由助手监测动物是否出现规律的强呼吸，以及四肢末端和口部区域是否呈现粉红色，以确保无意识状态下具有适当的氧合水平。必要时，根据兽医指导和机构规定调整麻醉深度。将无菌人工泪液润滑软膏（15% (v/v) 矿物油，83% (v/v) 白凡士林）涂抹于眼睛表面。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将小鼠侧卧置于新的 disposable 隔离单上，后肢朝上。如有必要，使用电动剃刀或脱毛膏去除毛发。用无菌生理盐水擦拭术区，并移除带有多余毛发的隔离单。在小鼠身上覆盖新的开窗隔离单，确保仅暴露整个后肢，其余部位均被覆盖。图4A但需保持对面部和前爪的观察，以监测肤色和呼吸情况。</li>
	<li>定位股骨的近端和远端，沿纵轴方向切开皮肤5-10 mm（图4B). 使用#15手术刀将皮肤层与筋膜分离，暴露股骨的外侧入路 股二头肌 和 股外侧肌. 找到两块肌肉的肌隔交汇处（此处为肌肉粉红色背景下的白色组织线条）。使用解剖刀，沿肌间边界小心分离，直至股骨可见（图4B).</li>
	<li>使用钝性骨膜剥离器分离切口，以暴露整个骨干图4C）。使用电梯进一步暴露股骨中段三分之二区域，同时注意保护内侧后方的神经血管束（图4D用手术刀轻轻刮取骨头上附着的软组织，并用无菌棉签或等效物擦干。</li>
	<li>必要时使用卡尺定位股骨中心，并用无菌手术刀或标记笔标记，然后在中心的近端和远端各标记1.5 mm处。使用预先按Kern式样改制的精细镊子轻轻夹持股骨，以避免对骨骼施加过大压力。 
	注意：修改部分的精确尺寸在文中提供 图3B建议在使用前先在已安乐死的标本上测试镊子，以确保骨骼在切割过程中因固定所需压力而不会断裂。</li>
	<li>使用装有细粒金刚石涂层切割轮（8 mm 直径 × 0.1 mm 宽度）的精密钻头，在骨膜 elevator 就位以保护下方组织的情况下进行第一次切割（图4E）。将截断的股骨抬起至 45° 在牢固握住骨干末端的同时，进行第二次切割，切下一段3 mm的节段。 
	注意：此步骤建议佩戴面部防护装备。</li>
	<li>用镊子固定骨骼后，使用钝化的23 G皮下注射针头仔细扩髓，对每一端的骨髓腔进行处理。使用预先制作的深度测量装置，该装置由一段插入19 G套管内的22 G管构成（图3A, i第8步），评估扩髓后髓腔的深度，并确保其为3 mm（图4F-K）。如果髓腔对22 G深度测量规有阻力，则使用钝化的22 G注射针头再次扩髓。</li>
	<li>将髓内针小心插入近端和远端髓腔，使股骨恢复至原始长度，并建立一个稳定的3 mm间隙（图 5A、B如有需要，可施加少量手动压力，使髓内针与股骨皮质骨达到良好的过盈配合。确保髓内针紧密贴合股骨两端的髓腔，且骨切割面与套管边缘平齐。若存在间隙，需使用22 G钝头针再次扩髓。</li>
	<li>将肌肉和周围组织复位至钢针上方，并使用连续可吸收的5-0缝线缝合切口图5C用5-0尼龙线打5-7个方结缝合皮肤切口，并使用外科粘合剂封闭图 5D).</li>
</ol>
3. 术后操作步骤
<ol>
	<li>缝合皮肤切口后，停止麻醉，但继续给予氧气2 持续灌注直至小鼠开始活动；此过程应少于1分钟。若小鼠在5分钟氧气灌注后仍无活动，2 给药，请参考机构关于兽医干预的政策。</li>
	<li>当小鼠开始活动时，轻柔地将其转移至一个笼子中，笼内最好装有干燥的高压灭菌垫料。
	<ol>
		<li>在每个笼子中放置一个圆顶形小屋，小鼠会躲入其中，从而减少活动。在小鼠恢复意识后5-10分钟，检查其后肢运动功能是否恢复。</li>
		<li>根据机构规定进行每日术后监测。术后前5-7天提供凝胶状饮水和置于笼底的食物，并根据机构批准的方案给予镇痛处理和术后监测。 
		注意：我们给予 0.05–0.1 mg/kg-1 布托啡诺24 皮下注射0.25 ml生理盐水，每日两次，持续3天；若小鼠未恢复正常使用能力，则此后继续给药。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在恢复后的最初24小时后，在麻醉状态下进行活体动物X射线成像，以观察钢针放置情况（图4E若发生螺钉移位，应考虑立即进行翻修手术。</li>
	<li>术后第7天，在麻醉条件下拆除缝线，并根据机构的动物饲养政策进行群养。</li>
	<li>2至5周后，按照美国兽医协会（American Veterinary Medical Association）批准的安乐死方法人道地处死动物25. 
	注意：腹腔注射市售的巴比妥类药物组合安乐死药剂是有效且人道的，但应遵循当地机构关于安乐死的政策。</li>
	<li>从内侧暴露股骨近端和骨盆，仔细解剖分离后肢。在将股骨头从关节窝中脱离时，从肢体外侧轻轻向内按压关节。 髋臼 用手术刀切开髋臼（髋关节窝），再用锋利的手术刀或显微剪剪断残留的肌肉和皮肤，使整个下肢从骨盆游离。使用锋利的咬骨钳或粗剪，于膝关节下方约5 mm处切断后肢下段（胫骨/腓骨）。 
	注意：建议所有样本在分析前均以相同方式储存。</li>
	<li>去除皮肤，但保留肌肉。将组织置于含10 mM CaCl₂的10%缓冲福尔马林中固定2 固定1周后，置于添加10 mM CaCl的磷酸盐缓冲液中保存2 成像前最多1个月进行固定和储存 4 °C或者，可立即对样本进行扫描，无需固定。</li>
</ol>
4. 标本分析
注意：骨愈合可通过多种方法进行评估，这些方法超出了本方案的范围。以下是我们成功采用的一种使用样本微型计算机断层扫描（µCT）成像仪的方法。建议首先测试以下参数，然后根据项目的具体需求进行优化。
<ol>
	<li>将样本用一层薄塑料密封膜包裹，并垂直放置于仪器腔室内。确保在整个扫描过程中股骨与样品台垂直。设置扫描参数如下：电压 = 29 kV，电流 = 661 µA，功率 = 19 W，图像像素尺寸 (μm) = 21.00；360度旋转 = 是；帧平均 = 开（5）；旋转步长（度）= 1.00，随机移动 = 开启。将每组扫描的图像以JPEG格式保存至单一目标文件夹中（例如 图6A）。 
	注意：扫描应在57分钟内完成。</li>
	<li>使用重建软件，根据以下参数生成轴向图像：平滑处理 = 开启（4），错位补偿 = 开启，环形伪影减少 = 开启（5），束硬化校正（40%），CS旋转（度）= 0.00。将输出范围设置为2,000–15,000 Hounsfield单位。将每组扫描的图像以JPEG格式保存至单一目标文件夹中。</li>
	<li>利用轴向图像和分析软件，通过首先设定原始缺损的近端和远端边界来定义感兴趣区域（ROI）。可通过选择仅包含套管的部分来实现。由于套管比髓内针更厚，因此这些部分易于界定（图6B，左）。通过在套管周围绘制一个排除区域（留出100 µm的边缘），并将该区域复制到ROI中的每一层图像中，从而在计算中排除套管（图6B，右）。 
	注意：使用该软件可轻松实现极惯性矩、三维重建以及新生骨体积等计算（图6C, D）。</li>
</ol>

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</ol>

作者无竞争性财务利益。

本文介绍一种利用标准实验室和兽医设备在小鼠股骨上制造临界尺寸针固定缺损的简单方法。尽管针具的组装和手术操作本身需要一定练习，但对于训练有素的生物医学科研人员或兽医而言，均可熟练掌握。
将钢针置入髓腔时无需额外固定，这使得该操作在技术上比使用外固定器或锁定螺钉的更复杂方法更具可行性。尽管在愈合早期阶段可能会发生一定程度的扭转运动，但通过仔细选择钢针直径并对髓腔进行充分扩髓，可使植入物与骨内膜之间形成牢固的过盈配合，从而最大限度地减少扭转。通过谨慎选择近交品系，并匹配年龄与性别，可在数天内实现稳定且可重复的固定效果。然而，随着3D打印技术的发展，未来有望通过改进钢针设计（如增加粗糙表面和/或带倒钩的附着位点）进一步减少扭转运动。由于钢针易于制作，且市面上有多种规格的皮下注射针管可供选择，因此该技术几乎可针对任何成年近交系小鼠进行优化，无论其具有何种天然或实验诱导的骨表型。
独特的销钉-套环设计具有两个目的：（i）防止因纵向滑移导致缺损异常变窄以及骨端损伤；（ii）提供解剖标志，以界定缺损的原始边界。因此，可使用如Skyscan 1...

据估计，到65岁时，美国有一半人口会发生骨折1。在接受手术治疗的骨折患者中，每年有50万例手术需要使用骨移植材料2，并且随着人口老龄化加剧，这一数字预计还将上升3。尽管骨骼是少数能够完全愈合而不留瘢痕的器官之一，但在某些情况下，其愈合过程仍会失败3,4。根据具体情况和治疗质量的不同，长骨骨折的失败率在2%至30%之间，导致骨不连3,5。尽管对于定义尚存争议，但假关节、临界尺寸缺损或骨不连性骨损伤通常是指在实验动物或患者自然寿命内无法自行愈合的损伤6。在实验研究中，该时间被缩短为普通大小骨损伤完全愈合所需的平均时间。骨不连的发生原因多种多样，主要因素包括造成临界尺寸缺损的严重创伤、感染、血管生成不良、吸烟，或因疾病或年龄导致的骨再生能力受损7。即使骨不连最终得到成功治疗，每例手术的费用也可能超过6万美元，具体金额取决于损伤类型及所采用的治疗方式8。
对于中度病例，通常采用自体骨移植。该策略涉及从供体部位获取骨组织并将其植入损伤部位。尽管这种方法非常有效，但可供使用的供体骨量有限，且该操作需要额外的手术，导致许多患者出现持续性疼痛9,10。此外，自体骨移植的效果依赖于患者的健康状况。由合成材料或经处理的尸体骨制成的骨替代物虽然来源丰富11-13，但存在显著局限性，包括宿主细胞黏附性能差、骨传导性降低以及可能引发免疫排斥反应14。因此，迫切需要安全、有效且可广泛获得的骨再生技术。
改进骨再生策略的能力在很大程度上依赖于在实验动物中模拟严重骨创伤的能力，但大段骨缺损的建立与稳定在技术上具有挑战性。通常情况下，实验上通过制造一个无法自然愈合的骨缺损来模拟严重的长骨创伤。尽管该尺寸可能因物种而异15，但一般需完全切除一段长度超过骨横截面直径1.5倍的骨组织才能实现16。随后使用金属植入物对骨骼进行固定，以维持骨折端的正确对位并允许动物活动。由于小鼠体型较小且长骨脆弱，大多数研究团队难以在小鼠中成功建立此类骨缺损模型。因此，长骨缺损模型通常局限于大鼠及更大的动物。然而，小鼠具有显著的研究优势，例如可进行基因修饰，并可培育为免疫缺陷品系，从而不会排斥人类细胞和组织。
在基于人类细胞的应用中，免疫缺陷小鼠具有较高的研究价值，因为其生理特征明确、易于饲养、成本较低，并且便于进行放射学和组织学分析。尤为重要的是，免疫缺陷小鼠不会排斥来自不同物种（包括人类）的细胞。其体型较小的特点也使得在骨科应用中可使用极少量的细胞或实验性支架材料进行测试。已有多种小鼠骨科模型被报道，这些模型可提供不同程度的骨稳定性17,18。其中，能够实现极高稳定性的系统（如外固定器和锁定钢板）主要通过膜内成骨方式愈合，尽管也有报道显示存在软骨内成骨愈合的情况19。相比之下，允许一定程度微动和/或宏观移动的系统（如使用未固定或部分固定的髓内针）通常以软骨内成骨为主进行愈合20,21。由于需要额外的稳定措施，长骨的延迟愈合或骨不连缺陷在小鼠中尤其难以实现。然而，已有多种方法被报道，包括使用带锁定钉的髓内针、锁定钢板和外固定器22。这些系统通常效果良好，但由于设计复杂，安装时可能存在技术上的挑战。例如，Garcia et al.23 设计了一种适用于小鼠的精巧的锁定髓内针系统，但该操作需要在两个不同部位做切口，并对股骨进行广泛的改造以容纳髓内针，这些操作需在解剖显微镜下完成。
在此，我们描述一种带有中央套环的简单股骨髓内针，该套环用于防止3 mm骨缺损闭合，并明确标示缺损的原始边缘。尽管该髓内针未直接固定于骨组织，但通过精确选择髓内针直径并扩髓，可产生足够的过盈配合，从而最大限度减少扭转运动图1）。通过精心选择近交系、年龄、性别和品系匹配的小鼠，可获得高度可重复的肥厚性骨不连缺损模型。22 可通过放射学方法轻松评估。此外，在显微计算机断层扫描（micro-computed tomography,µCT用于测量 从头合成 骨形成及组织形态学参数。这些针在我们的实验室中使用 readily available 工具进行原型制作。
<img alt="带有尺寸的结构梁示意图；组装与机械设计示意图。" src="/files/ftp_upload/52368/52368fig1highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 
图1：实验原理。节段性缺损模型的示意图总结。将小鼠股骨中央3 mm节段（全长9-10 mm）通过手术切除（左）。将一段长3 mm、19号规格的外科不锈钢管套在一段长9 mm、22号规格的不锈钢管上，并在正中央位置用粘合剂固定（右）。将所得的复合针插入股骨残余的近端和远端髓腔中，其中19号套管替代被切除的3 mm骨段（下方，中）。

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;针组件&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Dremel 旋转工具</td><td>Dremel</td><td>8220</td><td>或同等产品</td></tr><tr><td>重型切割轮</td><td>Dremel</td><td>420</td><td></td></tr><tr><td>手术管 19&amp;nbsp;G</td><td>Small Parts（亚马逊）</td><td>B000FMZ8LY</td><td>外径 1.07&amp;nbsp;mm，内径 0.889&amp;nbsp;mm</td></tr><tr><td>手术管 21&amp;nbsp;G</td><td>Small Parts（亚马逊）</td><td>B000FMZ8YQ</td><td>外径 0.82&amp;nbsp;mm，内径 0.635&amp;nbsp;mm</td></tr><tr><td>手术管 22&amp;nbsp;G</td><td>Small Parts（亚马逊）</td><td>B000FMYLZS</td><td>外径 0.719&amp;nbsp;mm，内径 0.502&amp;nbsp;mm</td></tr><tr><td>手术管 23&amp;nbsp;G</td><td>Small Parts（亚马逊）</td><td>B000FN0SY0</td><td>外径 0.643&amp;nbsp;mm，内径 0.444&amp;nbsp;mm</td></tr><tr><td>氰基丙烯酸酯粘合剂</td><td>Loctite</td><td>1365882</td><td></td></tr><tr><td>砂磨片</td><td>Dremel</td><td>413</td><td></td></tr><tr><td>橡胶抛光头</td><td>Dremel</td><td>462</td><td></td></tr><tr><td>毛毡抛光盘</td><td>Dremel</td><td>414</td><td></td></tr><tr><td>明胶海绵</td><td>Surgifoam/Ethicon</td><td>1974</td><td></td></tr><tr><td>穿孔活检切割器</td><td>Miltex</td><td>33-34</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;手术/术后处理&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>加热垫和循环泵</td><td>Stryker/Thermocare</td><td>TP700, TP700C, TPP722</td><td></td></tr><tr><td>四价消毒喷雾</td><td>Steris</td><td>1429-77</td><td></td></tr><tr><td>珠式灭菌器</td><td>Germinator/CellPoint Scientific</td><td>Germinator 500</td><td></td></tr><tr><td>麻醉系统</td><td>VetEquip Inc</td><td>901806 或 901807/901809</td><td></td></tr><tr><td>异氟烷麻醉剂</td><td>VETone/MWI</td><td>501017, 502017</td><td></td></tr><tr><td>外科消毒剂</td><td>Chloraprep/CareFusion</td><td>260449</td><td></td></tr><tr><td>手术器械</td><td>Fine Science Tools</td><td>多种型号</td><td>推荐德国制造</td></tr><tr><td>面部防护</td><td>Splash Shield</td><td>4505</td><td></td></tr><tr><td>可充电高速钻</td><td>Fine Science Tools</td><td>18000-17</td><td></td></tr><tr><td>金刚石切割轮</td><td>Strauss Diamond</td><td>361.514.080HP</td><td></td></tr><tr><td>可吸收缝合线&amp;nbsp;</td><td>Covidien</td><td>UM-213</td><td></td></tr><tr><td>外层缝合线</td><td>Ethicon</td><td>668G</td><td>或同等产品</td></tr><tr><td>Vetbond</td><td>3M</td><td>1469SB</td><td>或同等产品</td></tr><tr><td>水合凝胶</td><td>Clear H2O</td><td>70-01-1082</td><td></td></tr><tr><td>营养凝胶</td><td>Clear H2O</td><td>72-01-1062</td><td></td></tr><tr><td>丁丙诺啡</td><td>Reckitt and Benckiser</td><td>12496-0757-01</td><td>管制药品</td></tr><tr><td>小鼠窝</td><td>Bio Serv</td><td>K3328, 3570, 3327</td><td></td></tr><tr><td>安乐死混合剂</td><td>Euthasol/Virbac</td><td>710101</td><td>管制药品</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;分析&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>活体动物成像仪&amp;nbsp;</td><td>Orthoscan</td><td>FD Pulse</td><td>或同等产品</td></tr><tr><td>显微CT设备及软件</td><td>Bruker</td><td>Skyscan1174</td><td>或同等产品</td></tr><tr><td>密封膜/Parafilm M</td><td>VWR 或 Fisher</td><td>100501-338, S37441</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">*纱布、手术单、防护服、动物护理设备等其他物品可使用通用来源。</td></tr></tbody></table>

一种简单的小鼠股骨临界尺寸缺损模型

A Simple Critical-sized Femoral Defect Model in Mice

尽管骨组织具有显著的再生能力，但严重的骨创伤常常导致无法正常愈合的损伤。事实上，由于创伤程度、疾病或患者年龄等因素，所有四肢长骨骨折中有十分之一无法完全愈合。我们改进骨再生策略的能力在很大程度上依赖于在实验动物中模拟严重骨创伤的能力，但大段骨缺损的建立与稳定在技术上具有挑战性。通常情况下，实验上通过制造一个无法自然愈合的骨缺损来模拟严重的长骨创伤。这需要完全切除一段长度超过骨横截面直径1.5倍以上的骨组织来实现。随后使用金属植入物对骨进行固定，以维持骨折端的正确对位并允许肢体活动。
由于小鼠体型较小且长骨脆弱，大多数研究团队难以在小鼠体内建立此类损伤模型。因此，长骨缺损模型通常仅限于大鼠及其他较大的动物。然而，小鼠具有显著的研究优势，因其可进行基因改造，并可培育为免疫缺陷品系，不会排斥人类细胞和组织。
本文介绍了一种利用常规实验室和兽医设备在小鼠股骨上制造节段性骨缺损的技术。经过练习，大多数经过培训的兽医和动物研究人员均可完成固定装置的制备及手术植入。通过示例数据，我们还提供了该模型骨愈合定量分析的方法学。

小鼠通常在停止麻醉后5-10分钟内恢复意识和后肢活动能力。术后前5天建议将小鼠单独饲养，并提供环境丰富化措施，以防止肢体过度使用。为此，圆顶形窝巢可减少筑巢需求并促进休息。我们还观察到，在笼底提供食物和水凝胶可降低钢针移位的可能性。在此5天期间，应根据机构批准的政策按需给予镇痛处理。术后5天内，体重减轻最多可达术前体重的约15%。术后24小时建议对患肢进行X光检查，以评估钢针位置。钢针应完全插入近端和远端骨髓腔，骨缺损边缘应与套管 collar 齐平（图2C、2E、图5E 和 图6A）。在极少数情况下（<5%的病例），钢针可能在愈合早期发生脱位，动物使用方案应包含在此情况下进行翻修手术的预案。尽管在小鼠股骨上定量扭转运动在技术上具有挑战性，但通过标本的手动触诊证实，随着钢针周围结缔组织的积累，术后7天时扭转和纵向运动已微乎其微。完成术后5天的监测后，可根据机构批准的政策将小鼠恢复至常规群养环境。
若不进行治疗干预，缺损边缘在21天内通常会扩展0.5 mm，但在少数情况下，新骨生长可...

在生物医学研究中，动物模型常被用于模拟严重的骨损伤。由于小鼠体型较小，大多数研究团队难以在其体内建立稳定的骨缺损模型。本文中，我们描述了一种在小鼠中建立和分析实验性股骨缺损的简便方法。

尽管骨组织具有显著的再生能力，严重的骨创伤常导致无法正常愈合的损伤。事实上，所有……

本实验的总体目标是在小鼠股骨中创建一个简单且具有实验意义的临界尺寸骨缺损。该过程首先通过外科级不锈钢管制作髓内针；第二步，在麻醉小鼠的股骨中制造临界尺寸骨缺损。然后植入钢针以稳定骨骼。最终，可通过放射摄影和组织学方法评估骨愈合程度。在实施该操作时，务必注意仅使用当前的镊子固定骨骼，并确保套管与截骨边缘齐平。首先，将 10 微升氰基丙烯酸酯粘合剂置于一段 9 毫米长、22 号不锈钢皮下注射针管的管体中央。将一个 3 毫米长的套环沿管体推入，直至到达中心位置，然后旋转套环，使粘合剂在套环与管体之间均匀分布，如图所示。可根据研究的具体目的和受体需求，设计不同构型的针状原型。接下来，使用数字卡尺测量针的尺寸。每段长度应约为三毫米。让套管至少固化15小时，然后使用两个20目碳化硅浸渍圆盘去除任何毛刺或多余的胶水。接下来，使用旋转工具配合毛毡抛光盘对针进行抛光，然后用去离子水冲洗针体，并用压缩空气吹干。现在，通过将一支19号规格的钝头皮下注射针套在针杆上，将针头推向针座，以检测其完整性，确认针座能够承受约25克的重量。随后，用无菌过滤的PBS冲洗针体，并通过将针插入骨标本的股骨髓腔来测试其适配性，确保针杆与髓腔紧密贴合，且针座与骨切面边缘齐平。确保针的末端也穿入骨干的松质骨内，以最大限度地增强固定效果并改善干涉配合。使用皮肤活检刀冲切出一个直径3毫米的明胶海绵圆柱体，并用21号针头在其中心穿孔。然后将明胶海绵圆柱体穿过针体，并与套管对齐。最后，在120摄氏度和15 PSI条件下，使用干循环对针具进行高压灭菌。泡沫将干燥并颜色变深。在通过机构批准的适当方法确认麻醉效果后，将麻醉动物后肢朝上置于无菌布巾上，开始手术操作。为动物涂抹眼药膏，然后去除毛发，用无菌有孔洞巾覆盖动物，并定位股骨的近端和远端。沿纵轴方向切开皮肤5至10毫米。随后使用15号手术刀将皮肤层与筋膜分离，通过股二头肌暴露股骨外侧入路，用于肌内注射（MAs）和股外侧肌注射。定位两块肌肉的肌隔位置。在肌肉粉红色组织与白色结缔组织交界处，用手术刀沿此肌间隙仔细分离，直至暴露出股骨。接着，使用钝性骨膜剥离器扩大切口，以充分暴露整个骨干。然后进一步暴露股骨中间的三分之二部分，注意保护内侧后方的神经血管束。使用手术刀轻轻刮除骨表面的软组织，再用无菌棉签擦干骨骼。现在使用无菌直尺或游标卡尺确定股骨的中心位置，并在中心点近端和远端约1.5毫米处标记骨骼。然后用一对已按当前方式制备的精细尖头镊子轻轻夹住股骨，并使用装有细粒金刚石切割轮的精密钻头，在骨膜剥离器就位以保护组织的情况下进行第一处切割。下方。在牢固夹持骨干远端的同时，将被切割的股骨抬起至45度角。在镊子固定骨骼使其保持不动的情况下，进行第二处切割，去除一段3毫米长的骨段。使用钝头的23号皮下注射针仔细扩髓每端的骨髓腔。然后使用预先制作的深度测量规（由一段置于19号管内的22号管构成）确认骨髓腔深度为三毫米。当骨骼准备就绪后，将预制的钢针插入近端，然后插入远端骨髓腔，以使股骨恢复至原始长度，并建立一个稳定的三毫米间隙。确认钢针紧密地插入两个髓腔，且骨切割面的边缘与套管齐平。随后将肌肉和周围组织复位覆盖于钢针之上，使用连续可吸收的5-0缝线进行缝合。皮肤采用5-7方结尼龙线、5-0缝线缝合，并用手术黏合剂封闭切口。根据美国兽医协会（AVMA）指南，并在经机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准的方案下实施安乐死。2至5周后，从动物内侧暴露股骨近端和骨盆，小心分离后肢。然后从肢体外侧轻轻向内按压关节，同时使用手术刀将股骨头从髋臼中分离。使用锋利的手术刀切除残留的肌肉和皮肤，将整个下肢从骨盆处游离。然后去除多余的组织，并在膝关节下方约五毫米处切断后肢下段，去除皮肤，保留肌肉。接下来，将组织置于含有10毫摩尔氯化钙的10%缓冲福尔马林固定液中固定一周，随后转移至含有10毫摩尔氯化钙的磷酸盐缓冲液（PBS）中保存，可在成像前保存长达一个月。为分析样本，将组织用一层薄塑料天花板膜包裹，并依次垂直放置。在微型CT成像室中，将扫描参数设置如下。电压设为29千伏，电流设为661毫安，功率设为19瓦。图像像素大小设为21微米。旋转360度设为是，帧平均设为开启，旋转步进设为1度，随机移动设为开启。每获取一幅图像后，将其作为 jpeg 文件保存至每次扫描对应的单一目标文件夹中。然后，利用轴向图像和每个文件的分析软件，选择仅包含套管的层面，以确定原始缺损的近端和远端边界，并定义感兴趣区域。最后，在套管周围绘制一个留有 100 微米边距的排除区域，将其从计算中排除，然后将该区域复制到感兴趣区域内的每一层面上。若不进行治疗干预，术后前21天内缺损边缘通常会扩展0.5毫米。在愈合14至21天后，可通过显微CT扫描生成的轴向图像轻松确定新生骨的体积。新生骨的体积随时间增加，但通常不超过1立方毫米。在未进行治疗干预的情况下，21天后，距离病灶边缘0.25毫米处新生骨的极惯性矩范围为0.05至0.35毫米的四次方，而病灶中心处则为0.02至0.08毫米的四次方。进一步证实了未经治疗病例中骨不连的存在，如本代表性图像所示。对脱钙的纵向切片进行Mason三色染色，可清晰显示软骨内成骨的向外生长，其前沿为软骨，随后为松质骨。尽管在解剖过程中不可避免地会造成一些损伤，但如果小心地移除钢针，骨组织和结缔组织的组织学结构仍将保持清晰。此外，也可对未脱钙的组织进行甲基丙烯酸甲酯包埋并切片，且可在疼痛存在的情况下进行。一旦掌握该技术，可在30分钟内完成。在获取组织后，可对组织进行CAR-T、PCR、微阵列或免疫印迹等后续分析，以回答更多科学问题，例如：特定基因型的细胞、蛋白质甚至化合物如何影响骨修复？在我们的研究中，我们在免疫缺陷小鼠体内使用人源细胞和人源蛋白质。

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一个简单的临界尺寸股骨缺损模型小鼠

尽管小鼠模型在骨组织工程中是不可或缺的工具，但长骨缺损模型却较为稀少。这一需求促使了本实验方案的开发，该方案采用带有四枚螺钉的锁定钢板和专用导板，以建立并稳定可重复的股骨临界尺寸缺损，且具有较低的并发症发生率。...

建立经钢板内固定稳定的鼠股骨节段性临界尺寸缺损模型

本方案描述了一种使用髓内螺钉进行股骨骨折标准化固定的微创接骨技术，可用于分析小鼠的软骨内成骨愈合过程。...

一种在标准化生物力学条件下分析小鼠软骨内骨折愈合的微创模型

小鼠闭合性股骨骨折模型是研究骨折愈合及加速骨再生新型治疗策略的有力平台。本手术方案的目标是通过使用髓内钢针固定股骨，在小鼠体内建立单侧闭合性股骨骨折。...

小鼠闭合性股骨骨折的建立：一种用于研究骨愈合的模型

体内哺乳动物大段骨缺损模型对于研究骨愈合机制和骨科治疗方法的研究人员至关重要。本文介绍了一种通过外固定装置稳定大鼠股骨节段性缺损的可重复造模方案。...

一种使用定制外固定架稳定的、可靠且可重复的大鼠股骨临界尺寸节段性骨缺损模型

本方案描述了一种对成年小鼠进行骨折处理并监测其愈合过程的方法。...

小鼠股骨横断骨折固定针模型

本方案描述了一种在小鼠股骨上建立骨干骨折并用髓内钢针固定的外科手术方法，用于骨折愈合研究。...

建立小鼠股骨骨干骨折模型

本研究建立了一种大鼠股骨半节段性缺损模型，用于评估骨替代材料在无内固定或外固定条件下承受负荷时的力学性能和成骨性能。...

用于评估承重区域骨替代材料性能的大鼠半节段性骨干骨缺损模型

为了评估胶质瘤治疗的新疗法模式，需要建立生理相关性高的模型。我们采用一种可植入式导向螺钉技术建立颅内异种移植模型，该方法比立体定向技术更快速、更安全。...

一种用于小鼠颅内异种移植研究的简易导向螺钉法

本文介绍了一种基于改良Ilizarov外固定器应用的长骨骨折稳定方法1-3。在安装固定器并制造骨损伤后，可对骨愈合过程进行评估，实施牵张成骨，或制造骨不连或临界尺寸缺损，用于研究治疗干预措施。...

创建刚性固定的骨折模型以评估膜内成骨、牵张成骨或临界尺寸缺损的愈合

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使用抽脂术获取的脂肪源性基质细胞修复颅骨临界尺寸缺损模型

了解小鼠股骨临界尺寸缺损模型的建立方法，使用髓内针固定缺损部位，并通过放射成像和组织学分析评估骨愈合过程。该技术为骨再生研究提供了可靠的实验模型。

一种简单的小鼠股骨临界尺寸缺损模型

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