在生物安全二级条件下利用含四顺反子微基因组的病毒样颗粒模拟埃博拉病毒生命周期

以下实验的总体目标是在生物安全二级条件下模拟高致病性埃博拉病毒的生命周期。该目标通过生成病毒样颗粒来实现，这些颗粒具有与埃博拉病毒颗粒相同的蛋白质组成，但携带的是微型基因组而非完整的病毒基因组。微型基因组是病毒基因组的简化版本，其中病毒基因被移除，并由报告基因（如荧光素酶基因）所取代。

重要的是，本实验所用的微型基因组仍然携带多个病毒基因，这些基因编码病毒蛋白 VP40、GP-1,2 和 VP24。通过在 293T 细胞（称为生产细胞）中共同表达微型基因组以及病毒蛋白 NP、VP35、VP30 和 L，可产生病毒样颗粒，这些蛋白合称为核蛋白复合物（RNP 蛋白）。

迷你基因组随后由病毒蛋白进行复制，并转录为mRNA。这些mRNA编码荧光素酶报告基因以及额外的病毒蛋白VP40、GP-1,2和VP24。这三种蛋白共同作用，可产生类病毒颗粒，称为具有转录和复制能力的类病毒颗粒（TRVLPs），因为其中的核衣壳能够进行基因组复制和转录。由于TRVLPs携带埃博拉病毒的糖蛋白GP-1,2，因此能够感染靶细胞。

这些靶细胞已预先转染了编码np、VP35、VP30和L蛋白的表达质粒。这些核糖核蛋白（RNP）复合物可识别由TRVLPs带入靶细胞内的迷你基因组。随后，迷你基因组被复制和转录，从而产生报告基因信号，并生成新的TRVLPs，后者可再次用于感染新的靶细胞。

重要的是，微型基因组不携带其复制所需的遗传信息。因此，TRVLPs 无法对未表达四种 RNP 蛋白的细胞进行有效感染。这使得该系统在生物安全二级条件下使用是安全的。

该方法的主要优势在于，它能够在生物安全二级条件下模拟病毒的完整生命周期，包括基因组复制、病毒基因产物的表达、病毒颗粒的产生，以及在多轮感染因子循环中对靶细胞的感染。这意味着无需使用最高防护级别的实验室即可开展相关研究，而此类实验室通常是操作活体埃博拉病毒所必需的。该方法可与其他技术结合使用，例如通过RNA介导的细胞因子敲低或因子过表达，以研究这些因子在病毒生物学中的作用。此外，我们还可以在病毒基因中引入突变，以研究这些病毒基因及其基因产物在病毒生物学中的功能。

将80%至90%汇合度的293T细胞弃去培养基，用PBS洗涤两次，加入两毫升胰蛋白酶消化液，待细胞变圆后进行后续操作。

然后轻轻敲击培养瓶使细胞脱落，并向细胞中加入8 mL含10%胎牛血清（FBS）的培养基。使用自动细胞计数仪计数细胞，随后将细胞稀释至每毫升2×10⁵个细胞，并将2 mL细胞悬液接种到6孔板的每个孔中。将细胞放回37°C、含5%CO₂的湿润培养箱中培养。24小时后，用产生TRVLPs所需的质粒转染细胞。在生物安全柜中，使用带滤芯的吸头将DNA移入离心管中。作为阴性对照，其中一个孔中不转染编码病毒聚合酶L的质粒，而转染编码绿色荧光蛋白（GFP）的质粒，以观察转染效率。然后向每孔DNA中加入100 µL Opti-MEM培养基。涡旋混匀后短暂离心。

接下来，向稀释后的 DNA 中加入 7.5 µL transIT LT-one 转染试剂。轻轻涡旋混匀管内液体，并在室温下孵育 15 分钟。15 分钟后，通过移液枪轻柔吹打混合转染混合物，然后以逐滴加入的方式将 100 µL 混合物加入六孔板的每个孔中。

将转染复合物加入细胞后，轻轻前后摇动培养板，再左右摇动。切勿旋转摇动培养板，以免导致转染不均匀。操作完成后，将细胞放回培养箱。转染24小时后，移除细胞的上清液，然后向细胞中加入4 mL含5% FBS的培养基，并将细胞放回培养箱。

转染生产细胞24小时后，按先前所述方法将293T细胞进行传代。传代24小时后，用编码埃博拉病毒RNP蛋白以及作为埃博拉病毒黏附因子的Tim-one的质粒转染这些细胞。转染生产细胞72小时后，以及转染靶细胞24小时后，收集生产细胞的上清液，并将其移入15毫升离心管中。

收集上清液后，去除残留液体，向细胞中加入250微升裂解缓冲液，室温孵育至少10分钟。随后，按照本视频第三步所述方法测定荧光素酶活性。在此期间，将生产细胞的上清液在室温下以800 ×g离心5分钟。

然后移除靶细胞的培养基，并将P零代细胞的澄清上清液3毫升加入靶细胞中。每次操作一个孔。完成后，将靶细胞放回培养箱中。感染后24小时。

去除靶细胞的上清液，然后向细胞中加入4毫升含5%FBS的培养基，并将细胞放回培养箱中。为了检测生产细胞或靶细胞中的报告基因活性，需在转染后72小时收集生产细胞，在感染后72小时收集靶细胞。

为此，移除细胞的上清液，并向细胞中加入 250 µL 荧光裂解缓冲液，在室温下孵育至少 10 分钟。如需要，可将上清液用于感染一组新的靶细胞。在此情况下，收集上清液，并按照本视频第二步所述方法感染靶细胞。

在此期间，将每孔40微升的荧光素酶检测试剂缓冲液解冻，并向缓冲液中加入其体积1/100的荧光素酶底物。涡旋混匀配制好的荧光素酶试剂，确保其已升至室温后再进行后续操作。然后将40微升试剂加入白色不透明的96孔板中。为避免串扰问题，建议在样品孔之间留出一个空孔。10分钟孵育结束后，用移液器将细胞洗入裂解缓冲液中，并将细胞裂解液转移至离心管。在室温下以10,000 ×g离心3分钟。随后，取40微升裂解液加入含有荧光素酶试剂的96孔板中。在室温下孵育10分钟。孵育结束后，使用发光仪检测荧光素酶活性。发光检测的积分时间应为1秒。使用Modulus微孔板发光仪时，阳性对照的典型发光信号应在1×10⁶至1×10⁷范围内，而阴性对照信号应至少低2至3个数量级。在后续传代中，阳性对照的报告基因活性应保持稳定，而阴性对照的报告基因活性应降至背景水平。

观看本视频后，您应能够制备埃博拉病毒复制和转录有能的病毒样颗粒，利用这些颗粒感染靶细胞，并检测生产细胞和靶细胞中的报告基因活性。

重要的是，该方法可与其他技术结合使用，例如通过RNA介导的细胞因子敲低，以研究这些因子在病毒生物学中的作用。此外，还可以在本方法所使用的病毒组分中引入突变，以研究这些组分在埃博拉病毒生命周期中的功能。更多实验细节和特定试剂信息可参见本视频所配的手稿。