Name: 面神经干切断小鼠：模型，研究运动神经元损伤反应 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 11 s
Description: 学习面神经干切断术以研究小鼠运动神经元损伤反应。本视频演示了利用耳廓和茎乳孔等解剖标志暴露面神经并进行切断或压迫损伤的标准化手术流程，为神经再生和基因表达研究提供可重复的实验模型。

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本工作由美国国立卫生研究院（NIH）RO1 NS 40433（K.J.J.）资助。

所有操作程序均经印第安纳大学医学院机构动物照护与使用委员会批准，并遵循美国国立卫生研究院的指导方针。
1. 手术技术
<ol>
	<li>根据美国国立卫生研究院（NIH）指南25，在操作过程中使用无菌手套、无菌器械和无菌手术区域以维持无菌技术。手术开始前通过高压灭菌对器械进行灭菌（详见特定试剂/设备表中的完整列表）。手术过程中使用玻璃珠灭菌器对器械进行灭菌。</li>
</ol>
2. 麻醉与准备
<ol>
	<li>使用兽用异氟烷蒸发器系统，在麻醉箱中以每分钟0.9升氧气和2.5%异氟烷的混合气体对小鼠进行麻醉。在将小鼠从麻醉箱中取出前，需确保其对体位变化无反应。</li>
	<li>在小鼠眼睛上涂抹眼用软膏，以防止角膜干燥。</li>
	<li>将气体流向从麻醉箱切换至鼻罩。将小鼠平稳地仰左侧卧于覆盖有手术垫和吸水实验台纸的加热垫上，使其口鼻置于鼻罩内。持续监测小鼠的呼吸节律和频率，并根据需要调整异氟烷浓度（维持在2.5%–3%之间），以保持适当的麻醉深度；通过脚趾夹捏反射确认完全镇静状态。</li>
</ol>
3. 手术入路
<ol>
	<li>将体视显微镜与手术视野对齐并调焦。调整鼻罩位置，并用胶带固定，使其位于视野边缘。</li>
	<li>将小鼠左侧卧位放置，将右耳边缘用胶带固定于鼻罩上，暴露耳后将要进行切口的区域。确保耳后静脉横向穿过耳部。请注意，动物体位的正确摆放及耳朵的固定对于快速定位面神经至关重要。</li>
	<li>用70%乙醇润湿耳部及耳后的毛发，并使用剃刀或手术刀片剃除手术区域的毛发。在此解剖位置，预先润湿毛发&#160;可使剃除更顺利。</li>
	<li>使用碘溶液（如Betadine外科 scrub，含7.5%聚维酮碘）清洁皮肤，随后用70%乙醇冲洗。重复此清洁步骤两次，以彻底消毒该区域。</li>
	<li>为确定切口位置，沿耳后静脉从耳部向尾侧追踪至耳突后方区域。使用弹簧剪在耳突后方2–3 mm处做一4 mm长的切口。</li>
	<li>采用钝性分离法切开皮下脂肪和筋膜。避免直接用剪刀切割，以防损伤血管或肌肉组织。</li>
	<li>若出现出血，用无菌棉签对手术部位施压至少30秒。若发生明显体液流失，使用25或27 G针头向小鼠腹腔注射最多0.5 mL无菌0.9%氯化钠溶液。</li>
	<li>利用几个关键解剖标志——副神经、耳道和前腹肌（如下所述）——来定位面神经。围绕这些标志进行解剖，直至观察到面神经的分支。当神经暴露时，表现为明显的白色实性结构，且有一层筋膜将其附着于深层组织。
	<ol>
		<li>在皮下脂肪和筋膜被分离后，寻找从颅骨尾侧走行至支配斜方肌的副神经。面神经位于副神经的深面。</li>
		<li>寻找呈珍珠白色、位于面神经头侧的软骨性耳道。</li>
		<li>寻找位于面神经上方且偏尾侧的前腹肌肌腹。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>当观察到面神经的主要分支后，沿其向背侧追踪，找到其自茎乳孔发出的起点。使用尖头Dumont镊子#5/45撑开手术视野，沿神经走行推进弹簧剪尖端，然后将镊子向背侧移动，以保持新暴露区域的开放。</li>
	<li>此时应能观察到面神经主干及其颧支、颊支和下颌缘支。 
	注：颞支位于更靠近茎乳孔的位置。下颌缘支在接近下颌处分为上下两支，因此这些神经分支&#160;在此层面不可见。
	<ol>
		<li>若进行神经横断操作，用尖头镊子轻柔固定神经，再用弹簧剪将其切断。避免镊子对神经施加过大牵拉力，以防神经从脑干处撕脱。将断端相互推开，或切除一段远端神经，以确保无法重新连接。</li>
		<li>若进行压榨损伤操作，使用Dumont #5/45镊子以恒定压力压榨神经30秒，以完全切断所有轴突，然后在与第一次压榨部位垂直的方向上重复一次压榨。在30秒压榨过程中应避免压力变化，否则会导致不同动物之间的损伤程度不一致。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 封板与恢复
<ol>
	<li>将脂肪和肌肉重新置于深层结构之上。</li>
	<li>使用7.5 mm伤口夹闭合切口并近似对合切口边缘。&#160;缝合或医用胶均可用于伤口闭合。&#160; 此时可给予术后镇痛药物。&#160; &#160;</li>
	<li>取下小鼠耳朵上的胶带。关闭异氟烷气流，让小鼠呼吸纯氧30秒至1分钟。将小鼠放入无垫料的空笼中，使其从麻醉状态中恢复。</li>
	<li>当小鼠恢复后，观察其行为以确认是否存在面瘫的体征。 whiskers 将出现麻痹并朝向脸颊后方偏斜，鼻子会偏斜，眼睛对气流刺激无眨眼反应。</li>
	<li>术后雌性动物可共同饲养。避免将&#160;雄性小鼠共同饲养，因为它们&#160;更具攻击性，往往会强行移除笼中同伴的伤口夹，从而导致感染。必要时，此时应提供术后镇痛药。</li>
	<li>术后数天内每天监测小鼠一次，以确保未发生感染或其他并发症。若伤口夹未自行脱落，应在手术后7至10天将其拆除。</li>
	<li>每日为患眼涂抹润滑性眼膏，以预防角膜并发症，直至眼睑反射恢复或实施安乐死。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

该方案的关键步骤是在开始手术前正确固定小鼠体位。如果小鼠未平稳侧卧、耳部未以正确角度固定，或切口位置不准确，则将难以找到面神经。掌握该技术后，每只小鼠的手术仅需数分钟即可完成。
可以使用缝线、胶水或伤口夹闭合伤口。由于切口较小且操作迅速，优先选择伤口夹。我们发现，如果使用伤口夹并将小鼠同笼饲养，雌性小鼠的恢复情况优于雄性小鼠，因为同笼饲养的雄性小鼠常会拔除同伴的伤口夹，导致手术部位感染。
可以对损伤方式进行调整，例如改变沿神经的损伤位置。比如，可在面神经的某一分支上造成损伤28，或打开颅骨实施颅内损伤29。此外，还可采用多种干预措施，如对神经断端施加药物14、系统性注射药物30，甚至进行细胞移植31。面神经横断模型也可用于研究运动神经元疾病，例如肌萎缩侧索硬化症32。该技术的当前应用包括研究神经切断后的再连接策略，以及应用药物促进损伤后神经再生。
<p class='jove_conten...

目前已存在多种周围神经损伤模型，但其中一种特别适用于运动神经元研究的是面神经横断模型。面神经又称第七对脑神经，起源于脑桥，支配面部表情肌1,2。在此手术方案中，暴露面神经自茎乳孔穿出的部位，并对其进行切断或挤压损伤。神经损伤的严重程度可根据Sunderland3分类法进行分级，该分类法依据轴突以及神经内膜、神经束膜和神经外膜（这些是逐层包裹轴突束的结缔组织层）的完整性来区分损伤类型。在挤压性损伤（轴突失用性损伤，axonotmesis）中，轴突被切断，但神经束膜和神经外膜保持完整。由于完整的神经鞘可作为轴突再生的通道，因此面神经挤压伤通常约在11天内实现功能完全恢复4,5。相反，在切断性损伤（神经失用性损伤，neurotmesis）中，轴突及全部三层结缔组织均被切断，远端整个神经必须重新生长以恢复肌肉的神经支配。临床上常对神经横断伤患者实施神经外膜缝合术，但恢复效果往往不理想。仍需进一步研究以阐明神经为何无法准确再生至靶组织，以及可采用哪些治疗方法来改善并加速神经再生过程。
采用面神经横断模型研究神经损伤具有诸多优势。首先，面神经横断手术操作快速、简便且高度可重复；由此导致的面部肌肉瘫痪不影响动物的重要生命功能，因而耐受性良好。由于这是一种颅神经损伤模型，运动神经元胞体的研究较为简便，因为这些运动神经元位于脑桥的面神经运动核内，且细胞群体相对均一。然而，根据面神经运动核内的亚核分布模式，该细胞群体仍存在差异：面神经运动核包含七个亚核，各自特异性支配特定的肌肉群，因此不同亚核对横断损伤的反应差异可能影响实验结果2,6,7。
面神经损伤模型的一个主要优点是，未切断轴突的一侧可作为配对的内部对照，因为神经支配具有高度对称性，且面神经运动核之间不存在交叉信号传递8。采用这种手术方法的另一个优势是，不会对中枢神经系统造成直接创伤，也不会破坏血脑屏障9。该操作很少出现大出血和感染等并发症。
可通过多种分析方法评估神经损伤后的生理反应。眼睑反射和胡须活动的恢复可作为功能恢复的行为学指标10,11。目前，通过视频记录胡须运动是检测面神经再支配恢复最有效的方法12,13。在实施安乐死后，可对面部运动核内的运动神经元胞体进行脑干组织学分析。面部运动核可分为七个亚核，每个亚核特异性支配特定的面部肌肉，从而可对损伤反应进行差异性研究2,6。可通过计数面部运动神经元来量化细胞存活率，或通过免疫组织化学方法识别生物标志物和特定细胞群体14。可利用激光显微切割技术对面部运动核进行精确分离，以开展针对神经损伤后细胞反应的分子分析15,16。还可对面神经横断后运动皮层的变化进行分析17,18。此外，可解剖神经以研究沃勒变性19或轴突再生20，也可取肌肉组织以研究神经肌肉接头21。面神经横断模型还可用于研究伴随的中枢和外周胶质细胞22、靶向肌肉组织21以及免疫系统反应23。尽管在面神经横断模型研究方面已取得诸多成果24，但仍需进一步开展周围神经损伤的研究，因为神经损伤对患者而言是一个重大临床问题，而现有治疗手段尚无法达到理想疗效。该模型是研究神经损伤生理反应及评估神经再生疗法效果的有力工具。

<table><tbody><tr><td>体视显微镜</td><td>Leica</td><td>M60</td><td></td></tr><tr><td>标签胶带</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-952</td><td></td></tr><tr><td>Vannas-T&amp;uuml;宾根弹簧剪 - 直头/锐利/8.5 厘米/5 毫米剪切刃</td><td>Fine Science Tools</td><td>15003-08</td><td>使用前灭菌</td></tr><tr><td>Dumont #5/45 镊子 - 标准尖头/45° 弯角&amp;deg;Dumoxel/11 厘米</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-35</td><td>使用前灭菌</td></tr><tr><td>Michel缝合夹 - 7.5 mm × 1.75 mm</td><td>Fine Science Tools</td><td>12040-01</td><td>描述为 &quot;伤口夹&quot; 在方案中，使用前需灭菌</td></tr><tr><td>Hagenbarth 交叉作用伤口夹施加器 5&quot;</td><td>George Tiemann &amp;amp; 公司</td><td>160-910</td><td>用于施加伤口夹，使用前需灭菌</td></tr><tr><td>米歇尔缝合夹施夹器 &amp;amp; 移除器 - 适用于 7.5 mm 夹子</td><td>Fine Science Tools</td><td>12029-12</td><td>用于移除伤口夹</td></tr><tr><td>0.9% 氯化钠注射液，USP</td><td>Hospira</td><td>0409-4888-10</td><td></td></tr><tr><td>聚维酮碘，16 盎司，带分配器</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-027132</td><td></td></tr><tr><td>70% 乙醇</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>玻璃珠灭菌器</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

小鼠面神经切断术：研究运动神经元损伤反应的模型

Facial Nerve Axotomy in Mice: A Model to Study Motoneuron Response to Injury

本手术方案的目的是暴露面神经——该神经支配面部肌肉，在其自茎乳孔穿出处进行切断或压榨，以诱导周围神经损伤。该手术的优势在于操作简便、可重复性高，且继发的面瘫对生命功能或活动能力无显著影响，因此与其他神经损伤模型相比，手术结局相对温和。采用颅神经损伤模型的一个主要优势在于，运动神经元相对均一地聚集于脑桥的面神经运动核内，便于对运动神经元胞体进行研究。由于面神经支配具有对称性，且两侧面神经运动核之间无交叉通讯，因此可进行单侧手术，未轴突切断的一侧可作为配对的内部对照。术后可开展多种分析以评估生理反应，具体细节不在本文讨论范围之内。例如，肌肉功能的恢复可作为再支配的生物学行为指标，也可通过定量运动神经元来评估细胞存活情况。此外，可利用激光显微切割技术精确捕获运动神经元，用于分子水平分析。由于面神经横断术具有微创性且耐受性良好，因此适用于多种基因修饰小鼠。同时，该手术模型也可用于评估周围神经损伤治疗策略的有效性。面神经损伤不仅可用于研究运动神经元，还可用于探究中枢与周围胶质微环境、免疫系统以及靶肌肉组织的反应。面神经损伤模型是一种被广泛接受的周围神经损伤模型，是研究神经损伤与再生的有力工具。

面神经轴突切断术后，由于损伤会导致运动神经元丢失。损伤后运动神经元的存活情况取决于多种因素，如性别、手术时动物的年龄、运动神经元计数的时间点，以及Moran和Graeber的综述24 以及 Jinno 和 Yamada 的综述22 两者均用于总结运动神经元存活数据。通常，在轴突切断术后28天，约有86%的运动神经元存活14,15,26运动神经元丢失的动力学特征在Serpe中有所描述 等 2000. 图1 展示了多种基因修饰小鼠中运动神经元存活率的差异。对照侧的面神经运动神经元数量未见显著差异，表明基因修饰不影响基础神经元数量。与野生型小鼠的运动神经元存活率（84% ± 2.0）相比， 图1A,D)，在肌萎缩侧索硬化小鼠模型（SOD1G93A; 68% ± 1; 图1B,E）以及免疫缺陷型重组激活基因-2敲除小鼠（RAG-2-/-；57% ± 2.5； 图1C、F)27....

本文介绍了一种在小鼠面神经上进行切断或压榨性轴突切断术的手术方案。面神经轴突切断术可用于研究神经损伤后的生理反应，并测试治疗技术。

本手术方案的目的是暴露面神经，即在茎乳孔处出颅并支配面部肌肉的神经，……

本实验的总体目标是暴露面神经，以研究周围神经损伤。面神经起源于脑干的脑桥，经茎乳孔离开颅骨，随后分支形成其主要组成部分。暴露后，面神经在其自茎乳孔穿出处进行自体切断。有两个主要解剖标志有助于定位面神经。第一个是外耳道，由珍珠白色软骨板通过薄膜连接而成。另一个是二腹肌的前腹，它位于面神经及其从茎乳孔穿出的位置之上。面神经损伤后，研究人员可以研究多种因素，例如运动神经元死亡或基因表达。面神经损伤模型是目前研究最为透彻的周围神经损伤模型之一。该技术的优点在于操作简便、可重复性高，且后续的面神经麻痹不会影响重要的生理功能。此外，由于神经系统具有高度对称性，未损伤的一侧可作为实验的配对内对照。为确保整个操作过程中无菌技术的实施，务必提前将所有器械进行高压灭菌，并准备好玻璃珠灭菌器，以便在不同手术之间对器械进行消毒。通过在加热垫上放置吸水垫、设置显微镜并用胶带固定鼻罩使其与视野边缘对齐，来准备手术台。麻醉小鼠后，需确保小鼠对包括脚趾夹捏在内的各种操作均无任何生理反应。随后将气流从麻醉舱转移至鼻罩，并涂抹眼膏。将小鼠左侧卧于手术垫上，下方放置加热垫。持续监测动物呼吸，并根据需要调整异氟烷气流以维持麻醉状态。接下来，为暴露手术区域，用胶带将右耳固定至鼻罩。应观察到耳后静脉穿过耳部。接下来，用70%乙醇润湿毛发并剃除术区毛发。去除毛发后，用碘酒和70%乙醇交替擦拭三次，彻底清洁术区皮肤。继续进行手术。务必使动物头部侧方朝上，口部摆正，耳缘静脉呈水平走向。这将有助于更方便地找到面神经。为确定第一处切口的位置，从耳垂处沿耳后静脉向耳突后方区域进行追踪。然后使用弹簧剪刀，在耳突后方2至3毫米处做一个4毫米的切口，此步骤出于教学目的。该切口将被扩大，以暴露其下方的解剖结构。现在对皮下脂肪和筋膜进行钝性分离。血管和肌肉容易被剪刀损伤。如果发生出血。用无菌棉签施加压力至少 30 秒。如果出现明显的液体流失，可用 25 或 27 号针头向腹腔内注射最多半毫升的生理盐水。现在利用关键解剖标志定位面神经。副神经位于面神经的浅层，可见其从颅骨的乳突部穿行而出。为支配斜方肌，需辨认软骨性耳道，该结构呈珍珠白色，位于面神经的头侧。面神经环绕耳道的髁状部分。随后辨认位于面神经上方及邻近面神经的前腹二腹肌的肌腹。在此结构下方进行解剖，以暴露面神经。它是一个坚实的白色结构，附着于深层筋膜层。辨认面神经的主要分支，并从后方追溯其源自茎乳孔的起源。使用精细镊子夹住并撑开手术部位，同时用弹簧剪的尖端沿面神经走行方向进行分离。用镊子可触碰到Raymond处的乳突骨孔。现在，辨认出面神经主干，以进行神经挤压损伤。用精细镊子以恒定压力挤压30秒，以切断所有轴突。然后将挤压角度垂直旋转，再次挤压30秒。在不同实验之间保持压力一致。现在相关解剖标志已确定，我将演示更为精细的手术技术。采用较小的切口，从耳垂处沿耳后静脉向耳突后方走行，于耳突后方 2 至 3 毫米处做一 4 毫米长的切口。现在，利用三个解剖标志——副神经、耳道和二腹肌前腹，钝性分离皮下脂肪和筋膜。暴露面神经，沿面神经向茎乳孔方向追踪，直至到达面神经主干；用精细镊子轻柔固定，然后用剪刀切断该神经。避免对神经施加过大的牵拉力，否则可能导致其从脑干撕脱。然后将神经残端分开，或切除一段神经，确保神经无法重新连接。最后，仔细检查神经，确认其已完全切断。在完成解剖后，将所有脂肪和肌肉复位至其大致原始位置。随后使用7.5毫米伤口夹、缝合钉或氰基丙烯酸酯胶水关闭切口。必要时，此时可给予镇痛剂，关闭麻醉装置，并将小鼠放回无垫料的空笼中。在动物恢复期间，检查其是否存在面瘫迹象，胡须是否瘫痪。如果胡须向脸颊后侧偏斜，鼻子会显得偏移，且眼睛对气流刺激无眨眼反应。若该动物为雌性，应将其与另一只雌性动物同笼饲养。但如果雄性小鼠单独饲养，需在其眨眼功能恢复前每天涂抹眼膏以预防角膜并发症。同时，在手术部位愈合前持续监测小鼠是否出现感染或其他并发症的迹象。在接受面部神经横断手术的8周龄野生型小鼠中，运动神经元丢失的程度因小鼠的年龄和遗传背景而存在显著差异。在坐骨神经切断术后28天，约有86%的运动神经元存活。在肌萎缩侧索硬化症的SOD1小鼠模型以及免疫缺陷的重组激活基因2敲除小鼠的激光捕获显微切割实验中，观察到更为显著的细胞丢失。采用显微解剖技术分离面神经运动核的组织。可完整获取整个面神经运动核，也可分别单独收集其亚核。该技术具有很高的精确性。可单独捕获运动神经元，剩余的神经组织也可收集用于后续分析。采用定量PCR检测腹内侧亚核（以虚线表示）和腹外侧亚核（以实线表示）中与神经再生反应相关的四个基因的表达水平。在这些亚核之间发现了一些差异。Gap 43 表达在亚核之间的差异最为显著。一旦掌握该技术，手术可在短短几分钟内完成。务必注意正确摆放动物体位，在准确位置做切口，并利用解剖学标志定位面神经。头颈部区域结构复杂，容易迷失方向，如果感到困惑，只需找到软骨性耳道并沿其向后追溯，即可找到面神经。

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面神经干切断小鼠：模型，研究运动神经元损伤反应

本文描述的 spared nerve injury（SNI）动物模型是一种小鼠模型，通过损伤坐骨神经的胫神经和腓总神经分支，保留剩余的腓肠神经完整，从而建立外周神经病理性疼痛模型。由机械性异常性疼痛引起的行为学改变通过 von Frey...

小鼠中诱导机械性异常性疼痛的 spared nerve injury（SNI）模型

本视频演示了在大鼠模型上进行的外科手术方案，详细介绍了从麻醉准备到面神经损伤诱导的各个步骤。该方案在医学研究中对于研究神经再生和外科技术具有重要意义。...

在大鼠模型中诱导面神经损伤

来源：Olmstead, D. N., 等，小鼠面神经轴突切断模型：研究运动神经元对损伤反应的方法。J. Vis. Exp. (2015)。本视频演示了小鼠面神经 crush...

在小鼠模型中进行面神经压榨性轴切术

来源：Dalkin, W.，等．腓总神经损伤方法：一种可靠检测修复神经肌肉接头因素的实验方法．J. Vis. Exp.

在小鼠中诱导腓神经损伤以研究神经肌肉接头再生

胫神经横断模型是一种耐受性良好、经过验证且可重复的骨骼肌萎缩模型。该模型的手术方案在C57Black6小鼠中进行了描述和演示。...

胫神经横断——小鼠去神经诱导骨骼肌萎缩的标准模型

本方案描述了一种在大鼠模型中可重复的面神经外科手术方法，包括各种可诱导性损伤模式的描述。...

大鼠模型中的面神经手术用于研究轴突抑制与再生

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颅顶耳长肌体内联合电穿孔与短期再神经支配

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压力控制通气诱导小鼠急性肺损伤

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一种用于研究损伤后呼吸神经可塑性的颈椎脊髓损伤小鼠模型

学习面神经干切断术以研究小鼠运动神经元损伤反应。本视频演示了利用耳廓和茎乳孔等解剖标志暴露面神经并进行切断或压迫损伤的标准化手术流程，为神经再生和基因表达研究提供可重复的实验模型。

小鼠面神经切断术：研究运动神经元损伤反应的模型

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