光化学诱导大鼠后部缺血性视神经病变模型

本视频的目的是展示一种光化学诱导的后部缺血性视神经病变模型，并通过逆行标记视网膜神经节细胞来评估其在50岁以上患者中的影响。缺血性视神经病变是急性视神经病变中最常见的类型。根据受累的特定血液供应来源和临床表现，该疾病可分为两种亚型：前部缺血性视神经病变或后部缺血性视神经病变。

尽管前部缺血性视神经病变的发病机制已被广泛研究，但由于后部缺血性视神经病变发病率低、临床表现多样且诊断标准尚不明确，其病理机制仍知之甚少。此外，目前尚无任何治疗方法被证实可有效预防或逆转前部或后部缺血性视神经病变所致的视力丧失。因此，建立一种可重复且可靠的后部缺血性视神经病变动物模型，对于在活体中研究该疾病的病理过程，以及测试新的神经保护和轴突再生治疗方案具有重要意义。通过光化学诱导微血管系统缺血性损伤，导致血管源性水肿和血栓形成，可有效建立区域性组织缺血模型。

缺血性损伤由于伴随发生的血管源性水肿导致的微血管受压，会扩散至邻近区域并进一步加重。我们通过选择性地作用于Bbar视神经来诱导这种缺血形式，以模拟后部缺血性视神经病变所造成的损伤。在此，Wang和Dale Brown提供了该操作步骤的逐步演示。

据我们所知，目前尚无后段视神经缺血损伤模型的报道，而本模型可在不造成物理性创伤的前提下诱导缺血，因而能更好地模拟后段缺血性视神经病变的生理过程。在本视频中，我们将演示我们所建立的后段缺血性视神经病变模型的完整操作流程，包括后段视神经的手术暴露等步骤。

通过静脉注射一种光敏染料，并将激光束聚焦于视神经表面。在I辐射期间，伊红B与激光之间的光化学相互作用会损伤血管内皮，引发由血小板血栓形成和血管压迫介导的微血管闭塞。由此产生的缺血性损伤由于轴突输入丧失，导致视网膜神经节细胞出现渐进但显著的退变，这是一种远隔性损伤，具有临床相关性结果。

一台工作波长为532纳米、最大输出功率为300毫瓦的钇铝石榴石（YA）激光器。接下来是一个工作频率为250赫兹的斩波器，用于将平均功率降低至峰值功率的7.5%。我们还配备了一个通常处于关闭状态的光束快门，其上钻有一个直径为100微米的小孔，以便在快门关闭时产生一束较弱的瞄准光束。

接下来是一个焦距为25厘米的平凸透镜，最后是一个红色直角棱镜，用于将光束向下引导至视神经。激光束从光源发出后，首先通过斩波器，使其平均功率降低至峰值功率的7.5%。经过斩波的光束随后由快门拦截；当快门关闭时，通过一个直径为100微米的小孔对光束进行空间滤波，从而产生一条非常微弱的瞄准光束。

随后，该弱光束经透镜聚焦，并通过直角棱镜向下反射至暴露的视神经后部。照射开始时，先将安全滤光片插入手术显微镜的光路中，一秒钟延迟后打开光束快门。此时，全功率的 chopping 光束被聚焦并向下投射至暴露的视神经上。

当光束与溶解在血液中的乙醇蜂（ethin bee）相互作用时，532纳米的绿色激光光被循环中的红细胞和B染料高效吸收，激发后的染料分子与三重态的黄色分子氧碰撞，将激发能传递给氧分子，使其转变为单线态氧，该单线态氧具有高度反应活性。随后，这种活性氧直接对血管内皮进行过氧化，导致血管屏障出现点状损伤，从而特异性地吸引血小板聚集，并促进血浆渗漏至实质组织中。这一损伤过程进而引发血栓形成所致的血管闭塞，以及由于微血管受压导致的血管源性脑水肿，后者可使病灶范围扩展至超出激光穿透深度的区域。

如果操作正确，血小板凝血酶中将不含纤维蛋白。因此，该方法可区别于效率低得多的依赖热的足部凝固过程。高脉冲功率的运行可增强对乳白色视神经的有效穿透深度，同时通过光束将平均功率降低至7.5%。

切碎有助于确保足部的化学过程而非热过程引起组织损伤，术前对大鼠进行腹腔注射氯胺酮-地西泮混合物以实施麻醉。麻醉后，轻柔地将舌头向前推以防止窒息，剃除手术部位的毛发，并在双眼涂抹眼用润滑剂，以防止手术过程中角膜干燥。评估麻醉深度，以确保动物在手术期间无痛觉。

首先进行股静脉插管。在手术操作前，将一段已灭菌并用生理盐水冲洗过的导管连接至含有预定量2%伊文思蓝溶液的1 mL注射器。按照每公斤体重20毫克的剂量，将注射器安装到输液泵上，并设定输注速率为600微升每分钟。

用10%聚维酮碘擦拭手术区域进行清洁，随后使用70%乙醇擦拭。使用15号刀片在右侧大腿根部做一切口。用剪刀切开并撑开筋膜，用镊子分离肌肉，直至股静脉分支清晰可见。

根据需要使用剪刀和镊子继续向下解剖，以分离血管及其周围组织。用冰冷的无菌BSS清洗手术区域，以改善静脉的视野。仔细分离包绕静脉、动脉和神经的鞘膜与下方组织。

然后沿静脉两侧进行钝性分离以游离静脉。通过小心抬起血管，在其下方置入精细尖头镊子，穿过静脉下方并夹住拉出，将两根带针的尼龙缝线置于静脉下方。结扎远端静脉并扎紧，近端静脉则打一松结。

在远端结扎处附近对静脉进行部分切割，并根据需要适当扩大切口。用镊子夹住切口处的静脉壁，小心地将生理盐水冲洗管插入血管内。然后收紧近端松开的结，将其固定在导管周围。通过将导管与远端缝线打结，将其牢固固定在位。

检查导管插入的质量，确保其无阻塞或泄漏后，暂时用缝线关闭切口，以保护导管和组织。使用10%聚维酮碘洗涤剂溶液和70%乙醇准备手术部位。用15号刀片沿眼部后方皮肤做切口，然后使用Vannas剪刀剪开结缔组织。

沿视骨的上缘继续解剖分离结缔组织。注意避免损伤局部血管。解剖视部组织直至显露出上直肌。

视神经位于下方。将皮肤瓣和结缔组织向侧方和下方牵拉。眼球将向前外方向转动。

使用一对锋利的镊子小心插入，并沿神经方向平行展开，以暴露该神经。在激光照射过程中，将靶向照射为其供血的微血管网络。操作激光照射装置时，务必始终佩戴橙色防护眼镜，以保护眼睛免受激光光线伤害。

启动激光器，并在所有照射操作前数分钟调整峰值功率和平均功率。轻轻将动物放置于装置上，并调整其位置，使瞄准光束照射在视神经暴露区域附近。

然后用尖头镊子小心地重新暴露视神经的长度。微调位置，使瞄准光束对准视神经乳头后方3至4毫米处的视神经。通过启动输注泵注入2%玫瑰红B溶液，并在此期间以少量BSS液滴润湿视神经表面，使其循环数秒。

确认瞄准光束位置后，启动由脚踏开关控制的安全滤光片，随后进行激光照射，并持续照射90秒。通过滤光片应观察到神经上表面出现呈橙色的黄色荧光，且荧光应在视神经上分布均匀。通过轻微调整大鼠的位置，照射结束后安全滤光片将自动开启。

在某些情况下，可观察到微出血，应解除眼外肌的牵引，将眼球恢复至中立位置，并使用间断缝线关闭切口。剪断固定股静脉插管的缝线，小心撤出导管。牢固结扎近端股静脉以防止渗漏，并使用间断缝线关闭切口。

在两处切口处涂抹抗生素软膏，并检查眼底中央视网膜静脉和动脉的血管完整性。将动物放回清洁的加热笼中恢复，给予术后镇痛药物并进行动物护理。遵循机构动物护理指南。

经常检查术后动物，确保切口部位清洁且无感染迹象，评估其疼痛情况并给予充分的镇痛药物，同时监测其进食及其他行为是否正常。通过共聚焦成像技术对视网膜平铺片进行观察，可用于量化在诱导后部缺血性视神经病变后视网膜节细胞的存活情况，该方法采用逆行标记荧光染料与对照动物进行比较。在诱导PI后两周，实验动物中存活的节细胞数量显著减少。

对照假手术动物的视网膜神经节细胞数量之间未观察到显著差异。这表明视网膜神经节细胞的丢失是由A物质与激光照射联合作用所引发的，而非仅由激光产生的热能所致。该操作中最关键的步骤是对视神经的暴露与照射。

必须仔细进行解剖，以防止视神经被鲨鱼精细尖头镊子损伤或在眼动脉处受到牵拉。在距视神经头约一毫米处进入视神经。若辐射位置距离视神经头三至四毫米，则有助于将缺血限制在供应神经的毛细血管，而非供应内层视网膜及其分支的动脉。操作后需进行内窥镜检查，以确保在预设激光辐射参数条件下中央视网膜动脉和静脉的血管完整性。

该模型的细胞死亡过程具有可重复的时间进程，因为峰值强度和照射持续时间是缺血性损伤的两个决定因素。通过调整这两个参数的严重程度，可根据不同研究目的调节视网膜神经节细胞损伤的程度。经过进一步优化，该模型为后部缺血性视神经病变的发病机制和分子变化研究提供了一个新颖的平台，并可用于筛选该病及其他中枢神经系统缺血性疾病的治疗药物。