Name: 光化学诱导后部缺血性视神经病变的大鼠模型 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 54 s
Description: 了解光化学诱导后部缺血性视神经病变的大鼠模型，用于研究视网膜神经节细胞损伤机制。该模型通过激光照射和光敏剂玫瑰红实现微血管闭塞，模拟缺血性病理过程，为神经保护治疗策略的开发提供可靠的实验平台。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

我们感谢Eleut Hernandez在动物饲养方面提供的帮助，Gabe Gaidosh在显微成像方面的专业支持，以及Khue Tran和Zhenyang Zhao在视频剪辑方面的贡献。本研究由美国国立卫生研究院国家眼科研究所资助，项目编号为R01-EY022129（授予JLG），P30-EY022589（授予加州大学圣地亚哥分校）和P30-EY014801（授予迈阿密大学）；同时获得美国心脏协会、James和Esther King基金会、复旦大学研究生院博士生交换项目基金（编号2010033）以及防盲研究组织（Research to Prevent Blindness, Inc.）的无限制资助。

所有动物实验程序均经加州大学圣地亚哥分校和迈阿密大学机构动物护理与使用委员会（IACUC）批准，并遵循ARVO关于在眼科与视觉研究中使用动物的声明进行。手术中使用的所有试剂和仪器均为无菌。
1. 麻醉大鼠并进行手术准备
<ol>
	<li>手术前，根据大鼠体重，通过腹腔注射给予氯胺酮（60 mg/kg）和赛拉嗪（8 mg/kg）进行麻醉。麻醉深度应通过脚趾夹捏刺激无反应来确认。</li>
	<li>麻醉成功后，将舌头向前牵拉以防止窒息，并在双眼涂抹润滑眼膏，以防手术期间角膜干燥。</li>
	<li>使用毛发剪剃除手术区域的毛发，并用10%聚维酮-碘洗涤剂溶液和70%乙醇各擦拭三次。</li>
	<li>将动物置于无菌区域内，并覆盖无菌巾。手术过程中使用无菌手套和无菌手术器械。在不同动物之间，需使用高温珠灭菌器对器械尖端进行重新灭菌。</li>
</ol>
2. 手术入路
<ol>
	<li>PION 诱导
	<ol>
		<li>股静脉插管
		<ol>
			<li>准备并清洁手术区域。使用毛发修剪器剃除右侧大腿内侧的毛发，然后依次用10%聚维酮-碘消毒液和70%乙醇各擦拭三次。</li>
			<li>准备导管。剪取一段40 cm长的聚乙烯导管（PE 10），该导管经70%乙醇灭菌。用生理盐水冲洗导管，并将其连接至含有预先量取的2%赤藓红溶液的1 ml注射器上。&#160;B染料（1 &#956;l/mg，给药剂量为20 mg/kg体重）。将注射器安装至脚踏开关控制的输注泵中，设定流速为600 &#956;升/分钟</li>
			<li>使用15号刀片，在右侧大腿根部做一个小的横向切口。切开并撑开内部膜组织，用无菌棉签清洁该区域。</li>
			<li>用镊子分离肌肉，直至可见股静脉的分支。动脉、静脉和神经周围包有筋膜鞘。捏住并向上牵拉此筋膜鞘。&#160;用镊子（尖头Dumont镊）夹住，使用Vannas弹簧剪在三角形楔状组织基部附近剪开一个小切口（通常2-4 mm即可）。根据需要扩大切口。</li>
			<li>用钝性显微外科钩沿静脉走向平行分离静脉与动脉。注意避免损伤脆弱的膜结构及静脉分支。随后，轻柔抬起静脉，将其与下方的结缔组织分离。</li>
			<li>获取一根无针尼龙缝合线，将其放置于股静脉旁。使用显微外科钩抬起静脉，并将缝合线穿过&#160;用精细尖头镊子在远端区域下方操作。抓住缝线一端，将其从静脉下方穿过，结扎远端静脉并扎紧。以相似方式将第二根缝线穿过近端静脉下方，并打一个松结。</li>
			<li>在远端结扎处附近用Vannas弹簧剪在静脉上做一个小切口。必要时用尖头镊子扩大切口。可能会有少量血液从切口渗出。使用冰冷的无菌BSS溶液和无菌棉签清洁手术区域。</li>
			<li>用持针器夹住切口边缘的静脉壁，将预先用生理盐水冲洗过的导管插入血管。收紧近端结扎线，将其固定在静脉和导管周围。随后，通过将导管与远端缝线打结，将其固定锚定。</li>
			<li>通过按压脚踏开关注入生理盐水，检查导管插入的质量， &#60;1 ml 即可。确保管路畅通无阻且无泄漏。暂时用缝线关闭切口，以保护导管插入部位及周围组织。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>视神经暴露
		<ol>
			<li>用10%聚维酮碘消毒液和70%乙醇分别对左眼上方已剃毛区域擦拭三次，以准备手术部位。</li>
			<li>用15号刀片在眼球后方2-3 mm处的皮肤上做一切口。用有齿镊夹起并提起结缔组织，使用Vannas弹簧剪做一小切口。该小切口通常长约5 mm，但可根据需要适当延长，以提供更充分的暴露视野&#160;接受培训的外科医生。继续沿眶骨上缘钝性分离结缔组织，注意避免损伤血管。使用棉签清洁手术区域。</li>
			<li>向下分离结膜，直至显露出上直肌。钳夹并分离该肌肉，使其从眼眶深部游离出来。此时可利用周围组织协助牵拉和抬高眼球，以利于视野的暴露。</li>
			<li>向侧方和下方牵拉皮肤及结缔组织瓣，并用缝线和止血钳固定。这将使眼球向前外侧旋转，从而暴露包绕视神经的含脂肪鞘膜。</li>
			<li>小心插入一对尖头镊子，沿视神经方向平行展开，以分离包裹鞘周围的结缔组织。切勿用镊子的尖端接触视神经。</li>
			<li>此时应可见一段长约5 mm的视神经及其周围鞘膜。鞘膜表面的微血管网络环绕视神经，激光照射时将以此为靶点。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>静脉注射伊红B与激光照射
		<ol>
			<li>始终佩戴橙色安全护目镜，以保护自己免受绿光激光的伤害。打开激光器，开启快门，并根据需要调节激光的峰值功率和平均功率。随后关闭快门。</li>
			<li>将大鼠置于激光照射装置中。为确保光束准确定位，可通过将激光束经100 μm小孔进行空间滤波，产生一束较弱的瞄准光束 &#181;在闭合的快门叶片上钻一个直径为 m 的孔。使用精细镊子重新暴露视神经，并将瞄准光束对准视神经乳头后 3 mm 至 4 mm 处的眶内视神经。</li>
			<li>注射2%伊红溶液&#160;B 通过启动输液泵注入。在几秒钟内循环，同时外科医生添加少量BSS以湿润视神经表面。</li>
			<li>验证瞄准光束的位置，然后点击脚踏开关以启动照射。显微镜光路中会立即触发一个橙色的安全滤光片，1秒延迟后快门随之打开。</li>
			<li>照射视神经90秒&#160;峰值功率为135 mW、平均功率为18 mW，由以250 Hz频率旋转且占空比为15%的光束斩波器产生（以最小化热效应）。视神经上表面将发出荧光，在安全滤光片下呈现为亮橙色，该荧光足以确保光束照射到位&#160;神经对称地。</li>
			<li>照射后，橙色安全滤光片将自动打开。在某些情况下可观察到微出血。</li>
			<li>放松眼外肌的牵拉，将眼球恢复至中立位置。使用间断缝合关闭切口。随后拔出导管&#160;结扎股静脉并扎紧，以防渗漏；采用间断缝合关闭切口。在两处切口处涂抹抗生素软膏。检查眼底，以确认视网膜中央静脉和动脉的血管完整性。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>逆行标记视网膜神经节细胞（RGCs） 注意：为了评估RGC&#160;存活实验中，应在PION手术前一周完成氟金（Fluorogold, FG）逆行标记。该方法在文中已有详细描述。 乔维 方案 81913.
	<ol>
		<li>简要步骤：使用氯胺酮（60 mg/kg）和赛拉嗪（8 mg/kg）麻醉动物，并剃除头部毛发。</li>
		<li>手术刷洗切口部位，并沿头部中线做一切口以暴露颅骨。</li>
		<li>在颅骨上钻出双侧孔洞（&#248; 距矢状缝和横缝均为 0.5 mm 的 2×2 mm 区域。</li>
		<li>使用真空泵小心吸除上丘（SC）背侧表面的脑组织。然后，将一小块浸有4% FG的明胶海绵置于SC表面。</li>
		<li>用缝线闭合切口，并按照标准术后护理程序对动物进行护理。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>术后护理与安乐死
	<ol>
		<li>手术后，将动物置于单独的清洁笼具中，并放置在循环加热水垫上，直至动物恢复。</li>
		<li>术后镇痛剂（盐酸丁丙诺啡，0.01 mg/kg）应每天给药两次，连续三天，以减轻不适。</li>
		<li>大鼠应单独饲养并密切观察，直至能够维持胸卧位并恢复足够的意识。</li>
		<li>术后需每日监测恢复状况及健康体征，至少持续5天，或直至缝线拆除且手术部位充分愈合，以两者中较晚发生者为准。</li>
		<li>在手术后根据研究需求选择科学合理的实验时间点，通过4% PFA灌注处死动物。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Wang, Y., Brown, D. P. Jr, Duan, Y., Kong, W., Watson, B. D., Goldberg, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+rodent+model+of+posterior+ischemic+optic+neuropathy.%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">A novel rodent model of posterior ischemic optic neuropathy.</a> JAMA Ophthalmology. 131, 194-204 (2013).</li>
<li>Rucker, J. C., Biousse, V., Newman, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ischemic+optic+neuropathies%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurol%22%5BJournal%5D)">Ischemic optic neuropathies.</a> Curr Opin Neurol. 17, 27-35 (2004).</li>
<li>Hayreh, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Posterior+ischaemic+optic+neuropathy%3A+clinical+features%2C+pathogenesis%2C+and+management.%5BTitle%5D)+AND+%22Eye+%28Lond%29%22%5BJournal%5D)">Posterior ischaemic optic neuropathy: clinical features, pathogenesis, and management.</a> Eye (Lond). 18, 1188-1206 (2004).</li>
<li>Hayreh, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inter-Individual+Variation+in+Blood-Supply+of+the+Optic-Nerve+Head.%5BTitle%5D)+AND+%22Doc+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Inter-Individual Variation in Blood-Supply of the Optic-Nerve Head.</a> Doc Ophthalmol. 59, 217-246 (1985).</li>
<li>Jacobson, D. M., Vierkant, R. A., Belongia, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonarteritic+anterior+ischemic+optic+neuropathy+-+A+case-control+study+of+potential+risk+factors.%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Ophthalmol-Chic%22%5BJournal%5D)">Nonarteritic anterior ischemic optic neuropathy - A case-control study of potential risk factors.</a> Arch Ophthalmol-Chic. 115, 1403-1407 (1997).</li>
<li>Kosmorsky, G., Straga, J., Knight, C., Dagirmanjian, A., Davis, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+transcranial+Doppler+in+nonarteritic+ischemic+optic+neuropathy.%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">The role of transcranial Doppler in nonarteritic ischemic optic neuropathy.</a> Am J Ophthalmol. 126, 288-290 (1998).</li>
<li>Hayreh, S. S., Zimmerman, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-arteritic+anterior+ischemic+optic+neuropathy%3A+role+of+systemic+corticosteroid+therapy.%5BTitle%5D)+AND+%22Graefe%27s+archive+for+clinical+and+experimental+ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Non-arteritic anterior ischemic optic neuropathy: role of systemic corticosteroid therapy.</a> Graefe's archive for clinical and experimental ophthalmology. 246, 1029-1046 (2008).</li>
<li>Prado, R., Dietrich, W. D., Watson, B. D., Ginsberg, M. D., Green, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photochemically+Induced+Graded+Spinal-Cord+Infarction+-+Behavioral%2C+Electrophysiological%2C+and+Morphological+Correlates.%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosurg%22%5BJournal%5D)">Photochemically Induced Graded Spinal-Cord Infarction - Behavioral, Electrophysiological, and Morphological Correlates.</a> J Neurosurg. 67, 745-753 (1987).</li>
<li>Dietrich, W. D., Busto, R., Watson, B. D., Scheinberg, P., Ginsberg, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photochemically+induced+cerebral+infarction.+II.+Edema+and+blood-brain+barrier+disruption.%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica%22%5BJournal%5D)">Photochemically induced cerebral infarction. II. Edema and blood-brain barrier disruption.</a> Acta Neuropathologica. 72, 326-334 (1987).</li>
<li>Watson, B. D., Dietrich, W. D., Busto, R., Wachtel, M. S., Ginsberg, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+reproducible+brain+infarction+by+photochemically+initiated+thrombosis.%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Neurology%22%5BJournal%5D)">Induction of reproducible brain infarction by photochemically initiated thrombosis.</a> Annals of Neurology. 17, 497-504 (1985).</li>
<li>Watson, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+photochemically+induced+brain+ischemia+and+stroke.%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebrovascular+Disease+-+Pathophysiology%2C+Diagnosis+and+Treatment%22%5BJournal%5D)">Animal models of photochemically induced brain ischemia and stroke.</a> Cerebrovascular Disease - Pathophysiology, Diagnosis and Treatment. , 52-73 (1998).</li>
<li>Watson, B. D., Prado, R., Dietrich, W. D., Ginsberg, M. D., Green, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photochemically+induced+spinal+cord+injury+in+the+rat.%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Photochemically induced spinal cord injury in the rat.</a> Brain Research. 367, 296-300 (1986).</li>
<li>Chiu, K., Lau, W. M., Yeung, S. C., Chang, R. C., So, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrograde+labeling+of+retinal+ganglion+cells+by+application+of+fluoro-gold+on+the+surface+of+superior+colliculus.%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Retrograde labeling of retinal ganglion cells by application of fluoro-gold on the surface of superior colliculus.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , (2008).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文详细描述了一种在大鼠模型中诱导PION的方法。该实验方案最关键的步骤是视神经的暴露与照射——需尽可能充分暴露视神经，同时避免因使用尖端精细镊子或牵拉过度而造成损伤。在大鼠中，眼动脉在距视盘≤1 mm处进入视神经。因此，对距离视盘3–4 mm处的视神经进行照射，仅会导致供应视神经的毛细血管发生缺血，而不会影响供应视网膜内层的动脉。必须通过眼底检查来确认视网膜中央动脉和静脉的血管完整性。经过练习，整个手术过程可在半小时内完成。结合固定的激光照射参数，该模型具有可重复的细胞死亡时间进程。
由于峰值强度和照射持续时间是决定缺血性损伤严重程度的两个因素，因此可以通过调整这些参数来改变损伤程度，以满足不同的研究目的。
作为首个且目前唯一可用的PION动物模型，该技术为研究PION的发病机制和分子变化提供了全新的平台，并可用于筛选治疗PION及其他中枢神经系统缺血性疾病的药物。

对于50岁以上的患者，缺血性视神经病变（ION）是急性视神经病变中最常见的类型2该病症可根据受累血液供应的具体来源表现为两种亚型之一。&#160;临床表现：前部（AION）或后部（PION）3. 尽管AION的发病机制和病程&#160;已被广泛研究4-7，由于后部缺血性视神经病变（PION）发病率低、临床表现多样、诊断标准不明确且缺乏动物模型，其病理机制一直 poorly understood。此外，目前尚无任何治疗方法被证实可有效预防或逆转前部缺血性视神经病变（AION）或PION所致的视力丧失。因此，建立一种可重复且可靠的PION动物模型对于研究该疾病的发病机制具有重要意义 体内 并测试用于神经保护和轴突再生的新治疗方案。
光化学诱导的微血管缺血性损伤可导致血管源性水肿和血栓形成，从而有效引发局部组织缺血8-12。将光敏染料赤藓红B注入血管循环后，在激光照射&#160;靶血管时可产生活性单线态氧分子。单线态氧直接使血管内皮发生过氧化，促进血小板黏附/聚集，进而导致闭塞性血栓形成。由于血管源性水肿引起的微血管受压，缺血性损伤会向邻近区域扩散&#160;并进一步加重&#160;。本方案的总体目标是通过光化学方法在&#160;球后视神经诱导缺血，以模拟PION所造成的损伤。
据我们所知，这是首个针对后段视神经缺血性损伤的模型1。由于该模型在不造成物理创伤的前提下诱导缺血，因而能更真实地模拟并研究后段缺血性视神经病变的生理过程。此外，该模型为视神经病变及其他中枢神经系统缺血性疾病的候选治疗药物筛选提供了全新的平台。本文详细描述了在大鼠PION模型中进行股静脉插管、视神经暴露、静脉注射伊红B以及激光照射的完整实验方案。

<table><tbody><tr><td>532-nm Nd:YAG 激光器&amp;nbsp;</td><td>Laserglow</td><td>LRS-532-KM-200-3</td><td></td></tr><tr><td>光束斩波器</td><td>定制</td><td>定制</td><td></td></tr><tr><td>机械快门及配套快门驱动定时器</td><td>Vincent Associates</td><td>SD-10</td><td></td></tr><tr><td>25 cm 焦距球面透镜</td><td>CVI/Melles-Griot</td><td>01 LPX 293</td><td>平凸 BK7 玻璃透镜，带 HEBBAR&lt;sup&gt;TM&lt;/sup&gt; 抗反射涂层</td></tr><tr><td>伊红 B&amp;nbsp;</td><td>MP Biomedicals</td><td>190449</td><td></td></tr><tr><td>荧光金</td><td>Fluorochrome, LLC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>明胶海绵</td><td>Cardinal Health</td><td>CAH1203421</td><td></td></tr><tr><td>聚乙烯导管（PE10）</td><td>BD Intramedic</td><td>427400</td><td></td></tr><tr><td>10 号刀片</td><td>Miltex</td><td>4-110</td><td></td></tr><tr><td>精细镊子</td><td>F.S.T.</td><td>91150-20</td><td>Dumont #5 无磁不锈钢</td></tr><tr><td>带齿镊子</td><td>F.S.T.</td><td>11153-10</td><td>德国不锈钢</td></tr><tr><td>镊子</td><td>F.S.T.</td><td>18025-10&amp;nbsp;</td><td>德国不锈钢</td></tr><tr><td>Vannas 弹簧剪</td><td>F.S.T.</td><td>2-220&amp;nbsp;</td><td>JJECK 不锈钢</td></tr><tr><td>聚乳酸羟基乙酸缝合线</td><td>Ethicon</td><td>J488G</td><td>7-0 缝线</td></tr><tr><td>止血钳</td><td>F.S.T.</td><td>12075-12&amp;nbsp;</td><td>德国不锈钢</td></tr></tbody></table>

光化学诱导大鼠后部缺血性视神经病变模型

Rat Model of Photochemically-Induced Posterior Ischemic Optic Neuropathy

后部缺血性视神经病变（PION）是临床实践中一种致盲性疾病。然而，其发病机制和自然病程至今尚不明确。&#160;仍 poorly understood。最近，我们建立了一种可靠且可重复的PION动物模型，并在该模型中测试了某些神经营养因子的治疗效果1本视频旨在演示我们建立的光化学诱导的后部缺血性视神经病变模型，并通过视网膜神经节细胞的逆行标记评估其效应。在手术暴露后段视神经后，静脉注射光敏染料赤藓红B，并将激光束聚焦照射于视神经表面。照射期间，赤藓红B与激光发生光化学反应，损伤血管内皮，引发由血小板血栓形成及水肿压迫介导的微血管闭塞。由此产生的缺血性损伤导致视网膜神经节细胞出现渐进性但显著的轴突退变，其原因是轴突输入丧失——这是一种远隔的、损伤诱导的、具有临床相关性的结果。因此，该模型为研究PION的病理生理过程提供了一个新颖的平台。&#160;并可进一步优化用于视神经病变及其他中枢神经系统缺血性疾病的治疗策略研究。

该技术诱导的缺血性损伤会导致视网膜神经节细胞在缺血性轴突损伤后出现渐进但显著的死亡。这一结果在临床上具有相关性，类似于人类疾病中所观察到的现象。采用氟金（FluoroGold，FG）逆行标记法对PION术后视网膜神经节细胞（RGC）的存活情况进行定量分析。该方法同样用于验证动物模型构建的成功，以及评估不同治疗方案的效果。图1展示了对照组（图1A）、假手术组（仅激光处理，无赤藓红B，图1B）及PION处理后2周（图1C）动物视网膜铺片中FG阳性细胞的代表性共聚焦图像。与对照组动物相比，PION诱导2周后动物视网膜中FG阳性细胞数量明显减少。而对照组与假手术组（仅激光处理，无赤藓红B）动物的RGC数量之间无显著差异。这表明PION诱导的RGC丢失是由赤藓红B与激光照射共同作用所致，而非仅由激光产生的热能引起。
<img alt="神经元密度比较，荧光显微镜，对照组 vs 假手术...

本实验方案的目的是通过光化学方法在大鼠的视神经后段诱导缺血性损伤。该模型对于研究视神经后段缺血性病变的病理生理机制、此类及其他视神经病变的治疗策略，以及中枢神经系统其他缺血性疾病的机制至关重要。

后部缺血性视神经病变（PION）是临床实践中一种致盲性疾病。然而，其发病机制和自然病程……

本视频的目的是展示一种光化学诱导的后部缺血性视神经病变模型，并通过逆行标记视网膜神经节细胞来评估其在50岁以上患者中的影响。缺血性视神经病变是急性视神经病变中最常见的类型。根据受累的特定血液供应来源及临床表现，该疾病可分为两种亚型：前部缺血性视神经病变或后部缺血性视神经病变。尽管前部缺血性视神经病变的发病机制已被广泛研究，但由于后部缺血性视神经病变发病率低、临床表现多样且诊断标准不明确，其病理机制仍知之甚少。此外，目前尚无任何治疗方法被证实可有效预防或逆转前部或后部缺血性视神经病变所致的视力丧失。因此，建立一种可重复且可靠的后部缺血性视神经病变动物模型，对于在活体中研究该疾病的病理过程，以及测试新的神经保护和轴突再生治疗方案具有重要意义。通过光化学诱导微血管系统缺血性损伤，导致血管源性水肿和血栓形成，可有效建立区域性组织缺血模型。由于伴随的血管源性水肿导致微血管受压，缺血性损伤会扩散至邻近区域并进一步加重。我们通过直接作用于Bbar视神经选择性地诱导这种缺血状态，以模拟后部缺血性视神经病变所造成的损伤。在此，y Wang和Dale Brown提供了该操作步骤的逐步演示。据我们所知，目前尚无后段视神经缺血损伤模型的报道，而本模型可在不造成物理创伤的前提下诱导缺血，因而能更好地模拟后段缺血性视神经病变的生理过程。在本视频中，我们将演示我们所建立的后段缺血性视神经病变模型的完整操作流程，包括后段视神经的手术暴露等步骤。通过静脉注射一种光敏染料，并将激光束聚焦于视神经表面。在I辐射期间，伊红B与激光之间的光化学相互作用会损伤血管内皮，引发由血小板血栓形成和血管受压介导的微血管闭塞。由此产生的缺血性损伤导致视网膜神经节细胞逐渐但显著地退变，这是由于轴突输入丧失所引起的远隔性损伤，是一种可诱导且具有临床相关性的结果。一台工作波长为532纳米、最大功率为300毫瓦的钇铝石榴石（YA）激光器。接下来是一个工作频率为250赫兹的斩波器，用于将平均功率降低至峰值功率的7.5%。我们还配备了一个通常处于关闭状态的光束快门，其上钻有一个直径为100微米的小孔，以便在快门关闭时产生一束较弱的瞄准光束。接下来是一个焦距为25厘米的平凸透镜，最后是一个红光反射棱镜，用于将光束向下引导至视神经。激光束从光源发出后，首先通过斩波器，使其平均功率降低至峰值功率的7.5%。经过斩波的光束随后由快门拦截；当快门关闭时，通过一个直径为100微米的小孔对光束进行空间滤波，从而产生非常微弱的瞄准光束。随后，该弱光束通过透镜聚焦，并经直角棱镜向下反射至暴露的视神经后部。辐射开始时，先将安全滤光片插入手术显微镜的光路中，一秒钟延迟后打开光束快门。此时，全功率的斩波光束被聚焦并向下投射到暴露的视神经上。当光束与溶解在血液中的乙啶蜂相互作用时，532纳米的绿色激光被循环中的红细胞和B染料高效吸收，激发后的染料分子与三重态的分子氧碰撞，将能量传递给氧分子，使其转变为单线态氧，后者具有高度反应活性。这种单线态氧直接对血管内皮进行过氧化，导致血管屏障出现点状损伤，从而特异性地吸引血小板聚集，并促进血浆渗漏至实质组织中。该损伤过程因此导致血栓形成引起的血管闭塞，以及由于微血管受压所致的血管源性水肿，后者可使病灶范围扩展至超出激光穿透的深度。如果操作正确，血小板凝血酶中将不含纤维蛋白。因此，该方法可区别于效率低得多的依赖热的足部凝固过程。高脉冲功率的运行可增强对乳白色视神经的有效穿透深度，同时通过光束将平均功率降低至7.5%。切碎有助于确保足部的化学过程而非热过程诱导组织损伤，对使用氯胺酮-地西泮混合物进行腹腔注射麻醉的大鼠进行操作。麻醉后，轻柔地将舌头向前推以防止窒息，剃除手术部位的毛发，并在双眼涂抹眼用润滑剂，以防止手术过程中角膜干燥。评估麻醉深度，以确保动物在手术期间无痛觉。首先进行股静脉插管。在手术操作前，将一段已灭菌并用生理盐水冲洗过的导管连接至含有预定量2%伊文思蓝溶液的1 mL注射器。按照每公斤体重20毫克的剂量，将注射器安装到输液泵上，并设定输注速率为600微升每分钟。用10%聚维酮碘擦拭手术区域进行清洁，随后使用70%乙醇擦拭。使用15号刀片在右侧大腿根部做一切口。用剪刀剪开并撑开筋膜，用镊子分离肌肉，直至股静脉分支清晰可见。根据需要使用剪刀和镊子继续向下解剖，以分离血管及其周围组织。用冰冷的无菌BSS清洗手术区域，以改善静脉的视野。仔细分离包绕静脉、动脉和神经的鞘膜与下方组织。然后沿静脉两侧进行钝性分离以游离静脉。通过轻柔抬起血管，在其下方置入精细尖头镊子，小心地将两根带针的尼龙缝线从静脉下方穿过并拉出。结扎远端静脉并扎紧，近端静脉则打一个松结。在远端结扎处附近对静脉进行部分切割，并根据需要适当扩大切口。用镊子夹住切口处的静脉壁，小心地将生理盐水冲洗管插入血管内。然后收紧近端松开的结，将冲洗管固定。通过将冲洗管与远端缝线打结，将其牢固固定在位。检查导管插入的质量，确保其无阻塞或泄漏后，用缝线暂时关闭切口，以保护导管和组织。使用10%聚维酮碘洗涤剂溶液和70%乙醇准备手术部位。用15号刀片沿眼后方的皮肤做切口，然后使用韦纳氏剪刀剪开结缔组织。沿视骨的上部继续解剖分离结缔组织。注意避免损伤局部血管。解剖视部组织直至显露出上直肌。视神经位于下方。将皮肤瓣和结缔组织向侧方和下方牵拉。眼球将向前外方向转动。使用一对锋利的镊子小心插入，并沿神经方向平行展开，以暴露该神经。激光照射时将靶向供应神经的微血管网络。操作激光照射装置时，务必始终佩戴橙色防护眼镜，以保护眼睛免受激光光线伤害。启动激光器，并在所有辐照操作前数分钟内调节峰值功率和平均功率。轻轻将动物放置于仪器上，并调整其位置，使瞄准光束照射在视神经暴露区域附近。然后用尖头镊子小心地重新暴露视神经的长度。微调位置，使瞄准光束对准视神经乳头后方3至4毫米之间的视神经部位。通过启动输注泵注入2%罗辛B溶液，并在此期间以少量BSS液滴润湿视神经表面，使溶液循环数秒钟。在确认瞄准光束位置后，启动由脚踏开关控制的安全滤光片，随后进行激光照射，并持续照射90秒。通过滤光片应观察到神经上表面出现呈橙色的黄色荧光，且荧光应在视神经上分布均匀。通过轻微调整大鼠的位置，照射结束后安全滤光片将自动开启。在某些情况下，可观察到微出血，需解除眼外肌的牵引，将眼球恢复至中立位置，并使用间断缝线关闭切口。剪断固定股静脉插管的缝线，小心撤出导管。牢固结扎近端股静脉以防止渗漏，并使用间断缝线关闭切口。在两处切口上涂抹抗生素软膏，并检查眼底中央视网膜静脉和动脉的血管完整性。将动物放回清洁的加热笼中恢复，给予术后镇痛药物并对动物进行护理。遵循机构动物护理指南。经常检查术后动物，确保切口部位清洁且无感染迹象，评估其疼痛情况并给予充分的镇痛药物，同时监测其进食及其他行为是否正常。通过共聚焦成像技术对视网膜平铺标本进行观察，可用于量化在逆行注射氟化蓝诱导后部缺血性视神经病变后，实验组与对照组动物视网膜节细胞的存活情况。在诱导PI后两周，实验组动物中存活的节细胞数量显著减少。对照假手术动物的视网膜神经节细胞数量之间未观察到显著差异。这表明视网膜神经节细胞的丢失是由A和B与激光照射联合作用引起的，而非仅由激光产生的热能所致。该操作中最关键的步骤是视神经的暴露与照射。必须仔细进行分离操作，以防止鲨鱼细尖镊子或在眼动脉处牵拉对视神经造成损伤。在距视神经头约一毫米处进入视神经。若需在距视神经头三至四毫米处进行激光照射，应确保缺血范围仅限于供应神经的毛细血管，而非供应内层视网膜及其分支的动脉。手术后需进行内窥镜检查，以确认在预设激光辐射参数条件下中央视网膜动静脉的血管完整性。该模型的细胞死亡过程具有可重复的时间进程，因为峰值强度和照射持续时间是缺血性损伤的两个决定因素。通过调整这两个参数的严重程度，可根据不同研究目的调节视网膜神经节细胞损伤的程度。经过进一步优化，该模型为后部缺血性视神经病变的发病机制及分子变化研究提供了新的平台，并可用于筛选该病及其他中枢神经系统缺血性疾病的治疗药物。

rat-model-photochemically-induced-posterior-ischemic-optic

Research

科研

JoVE Journal

Medicine

医学

光化学诱导后部缺血性视神经病变的大鼠模型

光血栓法是一种快速、微创的技术，可高度可重复地在特定感兴趣区域诱导产生小而界限清晰的梗死灶。该方法特别适用于研究转基因小鼠中脑可塑性相关的细胞和分子反应。...

光血栓性缺血：一种用于小鼠卒中研究的微创且可重复的光化学皮层损伤模型

光化学血栓法是一种微创且高度可重复的操作，可用于在脊髓中诱导局灶性缺血，是小鼠脊髓损伤的模型。...

光血栓法诱导的局灶性缺血作为小鼠脊髓损伤模型

本文介绍了一种通过升高眼内压在小鼠中诱导视网膜缺血-再灌注损伤的方法。通过升高眼内压造成视网膜缺血-再灌注损伤，可模拟人类视网膜因氧气和营养供应受损所导致的病理状态，使研究人员能够探究视网膜神经血管单元相关人类疾病的潜在细胞机制及治疗方法。...

通过升高眼内压建立小鼠视网膜缺血-再灌注损伤模型

以下报告介绍了如何使用适当的染料、接触镜片和激光参数来复制非动脉炎性前部缺血性视神经病变（rNAION）的啮齿类动物模型。同时，我们还揭示了评估rNAION病灶的适当步骤 体内.

非动脉炎性前部缺血性视神经病变的啮齿类动物模型（rNAION）

视网膜神经节细胞（RGCs）的继发性变性在青光眼中较为常见。本研究描述了一种部分视神经横断的创新手术方法。该节省空间的手术方法拓展了模型的应用范围，使得以一种新的方式探索RGCs中的继发性损伤机制成为可能。...

大鼠部分视神经横断模型：一种评估视网膜神经节细胞继发性变性的新型手术方法建立

氧诱导的视网膜病变（OIR）可用于模拟缺血性视网膜疾病，如早产儿视网膜病变和增殖性糖尿病视网膜病变，并可作为评估抗血管生成药物治疗新生血管疾病的概念验证研究模型。OIR...

用于啮齿类动物缺血性视网膜疾病的氧诱导视网膜病变模型

本文介绍了一种通过暂时性双侧颈总动脉结扎并结合夹闭法建立的小鼠视网膜缺血模型。该模型有助于理解由心血管异常引发的视网膜缺血的病理机制。...

一种通过短暂双侧颈总动脉阻塞诱导的缺血性视网膜损伤小鼠模型

本方案详细描述了小鼠视网膜平铺片的制备与免疫荧光染色及分析方法。同时详细介绍了小鼠幼崽的荧光素眼底血管造影（FFA）技术及图像处理方法。...

监测氧诱导视网膜病变小鼠模型中视网膜血管的动态生长

本文介绍了一种使用玫瑰红（rose...

视网膜静脉阻塞小鼠模型的优化以减少变异性的研究

本方案通过前房插管并升高眼内压以诱导小鼠眼视网膜缺血，随后恢复正常眼内压以启动再灌注，从而建立视网膜缺血-再灌注损伤模型。...

小鼠眼球模型中视网膜缺血-再灌注损伤的诱导

本方案提供了一种整合性方法，包括病毒递送、光探针植入、光血栓诱导、星形胶质细胞与神经元活动的同步记录，以及星形胶质细胞的光遗传学刺激。该整合性方法旨在对缺血性脑卒中从急性期到慢性期各个阶段的星形胶质细胞-神经元相互关系进行同步研究。...

一种用于光栓法脑卒中建模的整合方法 在体 内 行为小鼠中神经元和星形胶质细胞活动的光探针记录

了解光化学诱导后部缺血性视神经病变的大鼠模型，用于研究视网膜神经节细胞损伤机制。该模型通过激光照射和光敏剂玫瑰红实现微血管闭塞，模拟缺血性病理过程，为神经保护治疗策略的开发提供可靠的实验平台。

光化学诱导大鼠后部缺血性视神经病变模型

探索更多视频