评定神经连接的形成在共培养体系的光遗传学方法

以下实验的总体目标是建立一个共培养系统，用于评估人诱导的多能干细胞衍生神经元形成功能连接的能力，该方法基于通过通道 RUSIN 2 或 CR 2 对培养的神经元进行光刺激。这是通过首先分离原代小鼠神经祖细胞或 NPC，并允许它们分化为星形胶质细胞来实现的。接下来，用 CH R 2 转染原代大鼠皮质神经元并接种到星形胶质细胞层上，星形胶质细胞层作为现有的神经元群。

然后，用突触蛋白 2D 番茄病毒转导来自诱导多能干细胞或 IPSC 培养物的人类 NPC，然后放在星形胶质细胞神经元培养物上并诱导分化，随后形成突触连接。结果表明，IPSC 衍生的神经元与大鼠皮层神经元形成突触连接，基于 IPSC 衍生神经元在对 CHR 两个表达皮层神经元的基因光刺激下突触后电流的电生理记录。与现有的物质相比，这种物质的主要优点是，与那些仅将星形胶质细胞与人类 IPSC 衍生的神经元共培养的物质相比，这种物质的成熟时间更短。

这是因为原代神经元的存在可以加速这种人类神经元的成熟，证明该程序将是我实验室的研究生 Uni Chin，并起诉乔治奥古斯丁实验室的 Y 收集胚胎大鼠大脑并分离皮质组织后，根据文本协议分离皮质组织，将皮质组织转移到装有预热皮质组织消化液的培养皿中。将皮质组织尽可能切碎，然后在 37 摄氏度下孵育 30 分钟。孵育后，将皮质组织转移到 50 毫升离心管中，使用血清移液管解离组织，直到产生没有组织块的均质溶液。

将组织溶液通过 70 微米的细胞过滤器，以过滤掉任何残留的组织团块。将 3 毫升溶液分装成 15 毫升。离心管。

将 800 微升 7.5% BSA 分装在一个 XPBS 中添加到每个试管的底部，在组织层下方形成一层，以 200 Gs 离心 5 分钟。然后通过从两层的界面吸出除去上清液。避免干扰管底部的 selp 颗粒。

使用 1 毫升原代神经元培养基重悬每个细胞调色板后，将它们全部混合在 15 毫升离心管中。然后使用血细胞计数器测定细胞密度离心机。600 万只大鼠皮层神经元在 200 G 下放置 5 分钟，然后去除上清液。

电穿孔至少需要 600 万个皮层神经元。为确保存活的神经元形成神经元网络，向细胞沉淀中加入 100 微升电穿孔溶液并轻轻重悬。然后将 100 微升细胞悬液与 6 微克 CR 2 质粒混合，并将其转移到经过认证的兽医中。

根据制造商的说明选择并应用适当的电穿孔程序。电穿孔后，向兽医中加入 500 微升 MEM。将细胞转移到 11.5 毫升原代神经元、培养基中，然后轻轻复苏悬浮液。

然后向含有小鼠星形胶质细胞的 24 孔板的每个孔中加入 500 μL。在 37 摄氏度和 5% CO 2 下孵育板。在产生诱导多能干细胞或 IPC 后，根据文本方案诱导并维持细胞作为人神经祖细胞或 NPC 培养物。

在这个例子中，在将原代神经元添加到星形胶质细胞培养物中的第二天，使用一个 TD 番茄中的慢病毒载体突触标记 NPC。使用一个 XPBS 洗涤人 NPC 一次，然后加入细胞分离溶液并在 30 摄氏度下孵育 5 分钟。确保所有单元格都已分离。

然后将它们转移到含有两倍量 D-M-E-M-F 12 的 15 毫升试管中，并以 200 G 离心 5 分钟。去除上清液，使用神经元分化培养基轻轻地将沉淀重悬到单个细胞中。使用血细胞计数器对细胞进行计数。

接下来，小心地从星形胶质细胞皮质神经元培养板中吸出培养基。人类 NPC 在神经元分化中每孔每平方厘米 5， 000 个细胞。中等。在 37 摄氏度和 5% CO2 下孵育，每 2 或 3 天更换一次培养基，至少持续 28 天。

为了确认人类 IPC 的行为是否像成熟神经元，请使用配备 60 x 水浸透镜的共聚焦显微镜来寻找与人类 IPC 分化的细胞。通过可视化 TD 番茄。将记录移液器拉至 4 至 6 欧姆灌注的电阻。

细胞在室温下的外部溶液中不断冒出 95% 氧气、5% 二氧化碳的气泡。使用内部溶液填充记录微量移液器，在全细胞模式下修补 TD 番茄阳性细胞，并记录响应电流钳中电流注入的动作电位放电。确认表达 CHR 2 的皮质细胞的动作电位是由光刺激可靠地诱发的。

首先，通过使用汞弧灯的光照来可视化 GFP，并使用 480 波长的激发滤光片超过 40 纳米，找到表达 CR 2 的皮质细胞。检查在整个电池模式下通过电流钳记录可靠地触发动作电位。为了进行基因刺激，在全电池模式下修补 TD 番茄阳性电池，并使用全场汞灯和 480 over 40 激发滤波器将电压钳设置为负 70 毫伏。

刺激整个场地 30 秒。记录由表达 CHR 的两个表达突触前皮层神经元的光刺激诱导的修补细胞的突触后电流或 PSC。在此处将幅度和电流区域的阈值设置为 5 个 Pico Amp，PICO 分别手动检查这些事件以丢弃任何非 PSC 迹线。

如本视频所示，需要几个步骤来产生源自 IPC 原代皮质神经元和星形胶质细胞的神经元的共培养物。该图像显示，在小鼠 NPC 分化为星形胶质细胞的第二天，可以很容易地观察到神经胶质纤维酸性蛋白或 GFAP 阳性星形胶质细胞。小鼠 NPC 在接种皮质神经元之前分化至少一周，在星形胶质细胞单层上表达 CR 2，并且在这种共培养中通过 GFAP 和 CHR 2 的免疫荧光染色鉴定两者。

人类 NPC 分化 3 至 4 周后，在培养物中检测到 TD 番茄阳性神经元，如图所示。当受到光刺激时，在表达 CHR 两个 IPSC 的皮层神经元中产生动作电位。衍生的神经元也是可兴奋的，显示出增加的动作。

随着去极化电流脉冲的幅度增加，电位触发。在没有光的情况下，IPSC 衍生的神经元接收自发的突触输入。这些向内的突触后电流主要由 AMPA 受体介导。

皮层神经元的光刺激在整个第 32 次长光闪光中持续存在，而 PSC 的频率升高。当 CHR 两个表达的皮层神经元受到光刺激时，它们的振幅不受影响。按照此程序，我们可以将其他共培养系统与不同的患者特异性细胞类型结合使用，以回答其他问题，例如候选药物化合物对特定目标疾病的影响。