Name: 评定神经连接的形成在共培养体系的光遗传学方法 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 22 s
Description: 学习利用光遗传学方法在共培养体系中评估诱导多能干细胞来源神经元与初级皮层神经元形成功能性突触连接的技术。该方法通过电生理记录验证突触活性，为神经发育与疾病研究提供重要工具。

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我们感谢 K. Deisseroth 和 S. Je 分别提供 ChR2 和 Synapsin1-tdTomato 慢病毒载体，感谢 C. Chai 分享诱导多能干细胞（iPSC）建系的专业知识与实验方案，感谢 W.Y. Leong 提供技术支持，感谢 Goh 实验室成员分享试剂与专业经验。本研究由雅培营养品公司以及葛兰素史克（GSK）授予 E.L.G. 的卓越学术中心（ACE）研究奖资助；由新加坡国家研究基金会通过竞争性研究计划（NRF 2008 NRF-CRP 002-082）资助 E.L.G. 和 G.J.A.；并由韩国国家研究基金会（NRF）通过世界顶级研究所（WCI）计划在韩国教育科技部（MEST）资助下（NRF 资助编号：WCI 2009-003）资助 G.J.A.。

注意：所有实验均遵循新加坡保健集团机构动物护理和使用委员会批准的方案进行。
1. 收集早期出生后小鼠大脑
<ol>
	<li>解剖前，配制海马组织消化液：每1 ml 1× Earle's平衡盐溶液（EBSS）（含1% HEPES）中加入10 µl 木瓜蛋白酶（papain）、脱氧核糖核酸酶I（DNase I）（250 U/ml）和分散酶II（Dispase II）（1 U/ml）。配制约2.5 ml组织消化液，并使用0.20 µm滤器过滤。将溶液置于37 °C保温，备用。</li>
	<li>将出生后第5天（P5）的小鼠幼崽置于冰上5分钟以进行麻醉。从冰上取出后，通过脚趾或尾部夹捏测试疼痛反射。用70%乙醇喷洒幼崽。断头后将头部置于冰上的培养皿中。</li>
	<li>使用小型剪刀或精细解剖镊，在皮肤正中线从颅底至鼻部做一纵向切口。掀开皮肤，并在颅骨上做类似切口。在颅骨两侧各做两个横向切口，一个位于前部（前囟处），另一个位于后部（人字缝处）。</li>
	<li>沿切口线掀开颅骨，暴露下方脑组织。用镊子去除覆盖嗅球区域的颅骨以及其间存在的中线骨片。操作时用非主手的镊子固定头部以保持稳定。</li>
	<li>将刮勺的扁平部分从脑组织腹侧与颅底后端交界处轻轻插入。保持刮勺与颅底平行并位于脑组织下方，向前端移动，以切断脑组织与颅底之间的任何粘连。
	<ol>
		<li>用刮勺将脑组织取出，放入盛有冰浴1× EBSS（含1% HEPES）的培养皿中。始终保持组织浸没于溶液中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>所有显微解剖步骤均需在解剖显微镜下进行，双手各持一把精细解剖镊，一手用于切割组织，另一手用于固定组织。</li>
	<li>在大脑皮层后方稍作切割，将其与后脑分离。沿正中线切开，将大脑皮层分为左右两个半球。去除大脑半球表面的脑膜。</li>
	<li>将一个半球内侧面朝上放置，将镊子插入海马下方的侧脑室区域。切除中脑组织。
	<ol>
		<li>在海马的头端和尾端以及齿状回/内嗅皮层交界处附近进行切割，以将海马从皮层中分离。将分离出的海马收集至盛有冰浴1× EBSS（含1% HEPES）的培养皿中。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 海马组织解离
<ol>
	<li>将海马体转移至含有预热的海马组织消化液的培养皿中。将海马组织尽可能切碎，并在37 °C下孵育30分钟。</li>
	<li>通过机械吹打将组织轻柔地解离为单细胞，并将细胞转移至15 ml离心管中。</li>
	<li>以200 × g离心5分钟，弃去上清液。</li>
	<li>将细胞沉淀重悬于20 ml含蔗糖（0.9 M）的0.5× Hank’s平衡盐溶液（HBSS）中，以200 × g离心10分钟。</li>
	<li>弃去上清液，将细胞沉淀重悬于2 ml神经前体细胞维持培养基（表1）中，铺加在含有10 ml 4%牛血清白蛋白（BSA）的1× EBSS溶液上，以200 × g离心5分钟。</li>
	<li>弃去上清液，向细胞沉淀中加入小鼠神经前体细胞维持培养基（表1）。轻柔吹打5–10次，确保细胞沉淀完全分散为单细胞悬液。</li>
	<li>将含细胞的培养基转移至预先包被Matrigel的培养板中，并加入表皮生长因子（EGF）和成纤维细胞生长因子2（FGF2）（均为20 ng/ml），以及肝素（5 mg/ml）。将培养板置于37 °C、5% CO2条件下孵育。</li>
</ol>
3. 贴壁培养的小鼠海马神经前体细胞的维持
<ol>
	<li>在传代小鼠海马神经前体细胞（NPC）前至少一小时准备包被的培养板或培养瓶。加入足量的Matrigel以覆盖每个培养板或培养瓶的表面，并在室温下孵育1小时。</li>
	<li>从90%汇合度的小鼠NPC培养物中移除培养基，用1×磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤一次，然后吸除PBS。</li>
	<li>加入足量的细胞解离溶液以覆盖所有孔或培养瓶，并在37 °C下孵育5分钟。</li>
	<li>在倒置明场显微镜下以10倍放大倍数观察，确保所有细胞均已解离。若仍有细胞附着，则继续孵育培养容器1至2分钟，再次检查细胞状态。当所有细胞均解离后，向孔或培养瓶中加入相当于细胞解离溶液体积两倍的达尔伯克改良伊格尔培养基/汉姆F-12营养混合物（DMEM/F-12）。</li>
	<li>将含有细胞的DMEM/F-12转移至15 ml离心管中，在200 × g下离心5分钟。</li>
	<li>移除上清液，并将细胞沉淀重悬于5 ml小鼠NPC维持培养基中（表1）。轻柔吹打数次，使细胞团块分散为单细胞悬液。</li>
	<li>将总细胞数的三分之一接种至新的培养孔或培养瓶中，并补充足够的含有EGF和FGF2的培养基。将培养容器置于37 °C、5% CO2条件下孵育。每隔两天更换一次培养基，并每3至4天以1:3比例传代一次。避免小鼠NPC培养物过度生长，以防细胞聚集和脱落。</li>
</ol>
4. 小鼠NPCs向星形胶质细胞的分化
<ol>
	<li>在开始小鼠NPC向星形胶质细胞分化之前，至少提前一天准备聚-L-赖氨酸（PLL）/层粘连蛋白包被的12 mm盖玻片。将盖玻片放入24孔板中，并用足量的PLL（1 mg/ml溶于硼酸盐缓冲液）覆盖每个孔的整个表面。
	<ol>
		<li>在4 °C下孵育过夜。次日，移除PLL，并用1×PBS洗涤一次。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>加入层粘连蛋白（1 mg/ml溶于冰上预冷的DMEM/F-12），再次覆盖每个孔的整个表面，然后在37 °C下孵育至少4小时。</li>
	<li>移除小鼠NPC培养物中的培养基，并用1×PBS洗涤一次，随后吸除PBS。</li>
	<li>加入足够的细胞解离液以覆盖所有孔或培养瓶表面，在37 °C下孵育5分钟。</li>
	<li>确认所有细胞均已解离后，向孔或培养瓶中加入相当于细胞解离液体积两倍的DMEM/F-12。</li>
	<li>将含有细胞的DMEM/F-12转移至15 ml离心管中，在200 × g下离心5分钟。</li>
	<li>弃去上清液，将细胞重悬于5 ml星形胶质细胞分化培养基中（表1）。轻轻吹打细胞悬液，使细胞团块分散为单细胞。使用血细胞计数板计数单细胞数量。</li>
	<li>以每孔500 µl培养基接种细胞，密度为5 × 104 个细胞/cm2。将培养板置于37 °C、5% CO2条件下孵育。每隔两天更换一半新鲜培养基。小鼠NPC在2天内迅速分化为星形胶质细胞，在进行后续实验前需持续分化一周。</li>
</ol>
5. 大鼠胚胎脑的收获及皮层组织解离
<ol>
	<li>从星形胶质细胞培养物中移除星形胶质细胞分化培养基（表 1），并在开始收获胚胎大鼠脑组织前至少 4 小时，替换为原代神经元培养基（表 1）。</li>
	<li>在解剖前，配制皮质组织消化液：每 1 ml 1× EBSS（含 1% HEPES）中加入 10 µl 木瓜蛋白酶和 12.1 mg/ml L-半胱氨酸。配制约 2.5 ml 组织消化液，并使用 0.20 µm 滤器过滤。将溶液置于 37 °C 保温，待用。</li>
	<li>使用压缩二氧化碳气体对怀孕母鼠实施安乐死，通过脚趾或尾部夹捏测试确认无痛反射。</li>
	<li>将动物仰卧位放置于吸水垫上，用 70% 乙醇浸润其腹部区域。用镊子夹起皮肤，使用手术剪做横向切口，切口宽度足以暴露腹腔。用镊子夹住腹膜并剪开腹腔。</li>
	<li>用镊子提起子宫角，沿子宫系膜剪下。将解剖出的子宫置于冰上放置的培养皿中。通过在子宫组织之间剪切，将各个胚胎分离。
	<ol>
		<li>在胚胎囊上做一切口，轻柔地将胎儿从开口处剥出。将胎儿断头，把头部置于冰上放置的培养皿中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>为收获胚胎大鼠脑组织，请参照步骤 1.3 至 1.5 的描述进行操作。
	<ol>
		<li>为解剖皮质组织，将一侧脑半球外侧朝上放置。从中间开始横向将半球切成两部分，弃去靠近脑基底部的一半。修整所取组织，去除中脑部分。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将皮质组织转移至含有预热皮质组织消化液的培养皿中。尽可能将皮质组织切碎，并在 37 °C 下孵育 30 分钟。</li>
	<li>将皮质组织从消化液中转移至含有 10 ml 预热原代神经元培养基（表 1）的 50 ml 离心管中。使用移液管反复吹打，使组织充分解离，直至获得无组织块的均一悬液。</li>
	<li>将组织悬液通过 70 µm 细胞筛网过滤，以去除残留的组织团块。将滤液分装至 15 ml 离心管中，每管约加 3 ml。</li>
	<li>向每根离心管底部加入 800 µl 7.5% BSA 的 1× PBS 溶液，形成上层为组织悬液、下层为 BSA 的两层结构。</li>
	<li>以 200 × g 离心 5 分钟。吸除上清液时应从两层界面处小心吸取，避免扰动管底的细胞沉淀。</li>
	<li>将每管的细胞沉淀用 1 ml 原代神经元培养基（表 1）重悬，并合并至同一 15 ml 离心管中。使用血细胞计数板测定细胞密度。</li>
</ol>
6. 原代皮层神经元的电穿孔与接种
注意：基因转移可通过多种方法实现，包括电穿孔、磷酸钙转染和病毒转导。在本方案中，我们描述了使用电穿孔将 ChR2 载体导入原代皮层神经元的方法。
<ol>
	<li>将 6 × 106 个大鼠皮层神经元在 200 × g 条件下离心 5 分钟，弃去上清液。电穿孔至少需要 6 × 106 个皮层神经元，以确保存活的神经元能够形成神经网络。</li>
	<li>向细胞沉淀中加入 100 µl 电穿孔溶液，轻轻重悬。将 100 µl 细胞悬液与 6 µg pLenti-Synapsin-hChR2(H134R)-EYFP-WPRE4 质粒混合后转移至认证的电穿孔杯中。转移过程中避免产生气泡。</li>
	<li>根据制造商说明书选择并应用合适的电穿孔程序。</li>
	<li>电穿孔后，向电穿孔杯中的细胞/DNA 悬液中加入 500 µl MEM 培养基。将样品转移至 11.5 ml 原代神经元培养基（表 1）中，并轻轻重悬。总体积足够用于一整块 24 孔板。每孔分配 500 µl 培养基至 24 孔板的每个孔中。将培养板置于 37 °C、5% CO2 条件下培养。</li>
</ol>
7. 诱导性多能干细胞的生成
注意：本方法改编自 Okita et al.10
<ol>
	<li>在6孔板中，使用添加10%胎牛血清（FBS）的DMEM培养人成纤维细胞。</li>
	<li>在开始成纤维细胞重编程之前，用Matrigel包被6孔板，并在室温下孵育至少1小时。当细胞达到80%融合度时，移除成纤维细胞培养基，并用1×PBS洗涤一次。</li>
	<li>加入足量0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液覆盖整个孔板，于37 °C孵育10分钟。</li>
	<li>待细胞从孔板脱落之后，加入相当于胰蛋白酶体积两倍的含10% FBS的DMEM以终止胰蛋白酶消化。轻轻吹打细胞悬液，使细胞充分分散。使用血细胞计数板计数单细胞数量。</li>
	<li>将7 × 105个细胞转移至15 ml离心管中，于200 × g离心5分钟。</li>
	<li>弃去上清液，将细胞沉淀重悬于电穿孔溶液中。按照制造商说明书进行成纤维细胞电穿孔。将细胞重悬于100 µl电穿孔缓冲液中，加入每种附加体质粒1 µg。采用1,650 V、10 ms、3次脉冲的参数进行电穿孔。</li>
	<li>将细胞悬液转移至含10% FBS的DMEM中，按每孔5 × 104个细胞接种至6孔板。将培养板置于37 °C、5% CO2条件下孵育。</li>
	<li>转染48小时后，移除成纤维细胞培养基，更换为mTeSR培养基。每日更换培养基，直至诱导性多能干细胞（iPSC）克隆可进行分离。iPSC克隆通常在28–35天后可见。</li>
	<li>当克隆准备分离时，通过机械切割法分离一个iPSC克隆，并将其重新接种至含有10 µM Rho相关蛋白激酶（ROCK）抑制剂（Y-27632）的mTeSR培养基中，接种于Matrigel包被的6孔板12。每日更换培养基。</li>
</ol>
8. 人类神经前体细胞的神经诱导与维持
注意：此方法已由 Li et al.11 描述。
<ol>
	<li>当iPSC培养物汇合度约为20%时，移除mTeSR培养基，并更换为神经诱导培养基（表1）。每两天更换一次培养基。</li>
	<li>7天后，移除神经诱导培养基，并更换为人NPC维持培养基（表1）。每两天更换一次培养基，直至传代前7天为止。</li>
	<li>在传代培养前，用Matrigel在室温下包被培养板或培养瓶，至少孵育1小时。</li>
	<li>从汇合的人NPC培养物中移除培养基，用1×PBS洗涤一次，然后吸除PBS。</li>
	<li>加入足量的细胞解离溶液以覆盖所有孔，于37 °C孵育5分钟。</li>
	<li>确保所有细胞均已解离。向孔或培养瓶中加入相当于细胞解离溶液体积两倍的DMEM/F-12培养基。</li>
	<li>将含有细胞的DMEM/F-12转移至15 ml离心管中，在200 × g条件下离心5分钟。</li>
	<li>移除上清液，将细胞重悬于5 ml人NPC维持培养基（表1）中。轻轻吹打细胞悬液，使细胞充分分散。</li>
	<li>将总细胞数的三分之一接种至Matrigel包被的培养孔或培养瓶中，并补加足量含10 µM Y-27632的培养基。将培养容器置于37 °C、5% CO2条件下孵育。
	<ol>
		<li>每3至4天以1:3比例传代一次，每隔一天更换培养基。保持人NPC培养物的高密度，以防止分化。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
9. 人NPCs在共培养条件下向神经元的分化
<ol>
	<li>在启动人NPC向神经元分化之前，将慢病毒载体Synapsin1-tdTomato加入人NPC培养物中。在人NPC开始分化前一天，预先准备好星形胶质细胞/皮层神经元共培养体系。</li>
	<li>用1×PBS洗涤人NPC培养物一次，加入足量的细胞解离液覆盖所有孔/瓶，于37 °C孵育5分钟。</li>
	<li>确保所有细胞均已解离。向孔/瓶中加入相当于细胞解离液体积两倍的DMEM/F-12培养基，转移至15 ml离心管中，以200 × g离心5分钟。</li>
	<li>弃去上清液，将细胞重悬于5 ml神经元分化培养基（表1）中。轻轻吹打细胞悬液，使细胞团块分散为单细胞。使用血细胞计数板计数单细胞数量。</li>
	<li>小心吸除星形胶质细胞/皮层神经元培养物中的培养基。在每孔24孔板中，将人NPC以5 × 103 个细胞/cm2 的密度接种于500 µl神经元分化培养基（表1）中，并补充10 µM Y-27632。轻柔地将含人NPC的培养基加入各孔，避免扰动星形胶质细胞和皮层神经元。</li>
	<li>将培养板置于37 °C、5% CO2 条件下孵育。每两至三天更换一半培养基，使用新鲜培养基，持续至少28天。</li>
</ol>
10. 诱导多能干细胞来源神经元的电生理记录
<ol>
	<li>确认人iPSCs是否表现出成熟神经元的特性。
	<ol>
		<li>使用配备60倍（0.9 NA）水浸物镜的直立共聚焦显微镜，通过观察tdTomato荧光来识别由人iPSCs分化而来的细胞。</li>
		<li>将记录电极拉制至电阻为4至6 MΩ。在室温下用持续通入95% O2/5% CO2的外部溶液（表1）灌流细胞。用内部溶液（表1）填充记录微电极。</li>
		<li>对tdTomato阳性细胞进行全细胞膜片钳记录，在电流钳模式下通过注入电流（持续1秒，步长10 pA）记录动作电位的发放。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>确认表达ChR2的皮层细胞的动作电位是否可被光刺激可靠诱发。
	<ol>
		<li>在共聚焦显微镜下通过观察GFP荧光来识别表达ChR2的皮层细胞。按照步骤10.1.2至10.1.3对皮层细胞进行全细胞膜片钳记录。</li>
		<li>使用汞灯（100 W）进行光照刺激，检测动作电位是否可被可靠诱发。激发滤光片波长为480/40 nm。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>进行光遗传学刺激。
	<ol>
		<li>对tdTomato阳性细胞进行全细胞膜片钳记录，并将电压钳制在-70 mV。电流信号以2 kHz滤波，10 kHz采样。记录过程中监测串联电阻，保持其在10至20 MΩ范围内稳定。</li>
		<li>使用100 W汞灯配合480/40 nm激发滤光片，对整个视野进行30秒的光刺激。</li>
		<li>记录由表达ChR2的突触前皮层神经元光刺激所诱发的被钳制细胞的突触后电流（PSCs），检测并测量PSCs。将电流幅值和电荷量的检测阈值分别设为5 pA和20 pC。手动检查这些事件，剔除非PSC信号痕迹。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

未声明利益冲突。

光遗传学技术可实现对特定神经元群体激活的时间和空间精确控制13。在我们的实验中，使用显微镜物镜全视野照射30秒，以光刺激仅表达ChR2的皮层神经元。该方法使我们能够确定共培养体系中不同神经元群体之间是否形成了突触连接。实验结果表明，光刺激可增加由iPSC分化而来的神经元中的突触后电流（PSC）频率，这证明这些神经元接收到来自表达ChR2的突触前皮层神经元的突触输入。由此证实，iPSC分化的神经元已成功整合到与皮层神经元构成的神经环路中。
建立该共培养体系有几个关键步骤。在接种其他细胞类型之前，必须确保小鼠NPC来源的星形胶质细胞培养状态良好，细胞死亡极少。皮层神经元和人NPC能够很好地贴附于健康的星形胶质细胞上，而电生理记录结果高度依赖于培养条件。本实验方案中的其他关键步骤包括皮层神经元的电转染及其接种至星形胶质细胞培养物上。由于电转染后大量细胞会死亡，因此必须确保在24孔板中每孔接种的电转染皮层神经元数量至少为600万个。我们观察到，当电转染细胞数量少于600万时，存活的神经元无法形成致密的神经网络，从而影响电生理记录结果。为了便于不同研究之间的比较，每次共培养实验所使用的电转染皮层神经元数量也应保持一致。对于所有涉及酶消化的步骤，必须注意不要让细胞在消化液中停留过久，以免导致细胞死亡。
该方法可用于筛选由患者特异性成纤维细胞衍生的神经元与其他神经元形成突触连接的能力。来自患有神经发育障碍——雷特综合征（Rett Syndrome, RTT）患者成纤维细胞的神经元表现出突触传递缺陷：与健康神经元相比，RTT神经元的突触后电流（PSC）频率和幅度显著降低，这可能是由于突触连接减少所致14。我们的共培养系统可用于检测药物对具有发育缺陷的神经元的作用。该检测可通过在患病人源神经前体细胞（NPCs）接种时添加待研究化合物，以及在神经元分化期间持续暴露于该化合物的过程中实现。
尽管该共培养系统也可用作药物测试的模型，但这种方法的一个局限性在于，由于其并非高通量筛选方法，研究每种候选化合物效应的过程可能耗时且繁琐。在使用候选化合物处理后，必须对诱导多能干细胞（iPSC）来源的神经元进行单个膜片钳记录，以确定每种化合物对PSCs的影响。此外，目前可获得的患者来源成纤维细胞和iPSC数量仍然有限。因此，未来值得关注的方向是获取更多患者细胞，并将本方案改进为适用于高通量筛选。例如，通过使用活性指示剂（如基因编码的离子传感器或膜电位传感器）标记iPSC来源的神经元，可绕过耗时的电生理操作，从而显著提高筛选通量。由于从成纤维细胞重编程到完成电生理记录的整个共培养系统构建过程需要超过90天，建议在完成重编程和神经诱导步骤后，分别对人iPSC或神经前体细胞（NPCs）进行扩增并冻存，以便减少后续实验所需的时间。
在我们的实验中，我们在突触素1（synapsin1）启动子的驱动下于皮层神经元中表达ChR2。由于该启动子具有泛神经元特异性，我们可能同时对抑制性和兴奋性皮层神经元进行了光刺激。如果未来实验的目标是特异性地研究抑制性或兴奋性神经环路，则可使用更具特异性的启动子。或者，也可从转基因小鼠（或病毒注射小鼠）中获取皮层神经元，使ChR2的表达特异性地靶向遗传学定义的神经元亚群。例如，将表达含小清蛋白中间神经元（PV中间神经元）中表达Cre重组酶的小鼠与携带floxed ChR2基因的小鼠杂交，所获得的皮层组织中，仅PV中间神经元会表达ChR215。在我们的共培养系统中使用此类表达ChR2的中间神经元，将有助于确定膜片钳记录的iPSC来源神经元是否能够整合到与PV中间神经元构成的神经环路中。
根据之前的一项研究9，皮层神经元在14天后成熟，树突相互重叠 体外因此，如果光刺激未能引发膜片钳记录的iPSC来源神经元产生反应，则表明该神经元不具备与皮层神经元形成突触连接的能力。iPSC来源的神经元可接收来自其他iPSC来源神经元或皮层神经元的突触输入。若采用传统的膜片钳记录技术，则无法区分突触输入的来源。本系统的优点在于可选择性地诱发并识别来自皮层神经元轴突前体输入的突触后反应。本文所述的操作步骤为评估iPSC来源神经元整合入特定神经网络的能力提供了一种简便的方法。

近年来，多种能够调控神经元兴奋性的光遗传学工具彻底改变了我们对神经元及其神经环路功能的理解。其中一种工具是光激活阳离子通道——通道视紫红质-2（channelrhodopsin-2, ChR2）：表达ChR2的神经元在光照刺激下可产生动作电位1-3。由于神经元通常并不对光敏感，这一独特能力为精确控制特定基因型神经元群体的时空活动提供了全新途径4，并极大推动了脑功能研究的发展。ChR2已被应用于干细胞研究中的多个方面，从监测神经元发育5到调控神经网络活动6均有涉及。
本研究中，我们使用ChR2来提高神经元共培养系统的实用性。共培养系统可用于评估不同类型细胞之间的相互作用。神经元与胶质细胞（神经系统的主要细胞类型）的共培养常被用于研究这些不同细胞类型之间的信号传递，以及评估此类信号传递在生理反应、损伤扩散中的意义，并探究可能参与该信号过程的分子机制7。先前一项研究表明，在含有神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞和小胶质细胞的大鼠皮层原代培养环境中，人iPSCs能够非常快速地分化为神经元8。
在本实验方案中，我们展示了一种利用ChR2在共培养体系中研究大鼠皮层神经元与人诱导性多能干细胞（iPSCs）来源神经元之间突触连接的方法。我们描述了分离和获取脑组织9的步骤，以及将小鼠神经前体细胞（NPCs）维持并分化为星形胶质细胞、将人NPCs分化为神经元以构建共培养体系的操作流程。为建立该共培养体系，我们采用了Okita et al.10所述的无整合重编程方法来生成人iPSCs。随后，根据Li et al.11的方法，在化学成分明确的条件下，使用小分子抑制剂将这些iPSCs高效地分化为NPCs。
在共培养体系中，可通过检测皮层神经元中ChR2的表达以及利用荧光蛋白串联二聚体番茄（tdTomato）标记iPSC来源的神经元，来区分不同类型的神经元群体。将iPSC来源神经元的电生理记录与皮层神经元的光遗传学光刺激相结合，可评估这两类神经元之间形成神经环路的能力。具体而言，对表达ChR2的皮层神经元进行光刺激，会诱发那些已与受光刺激的皮层神经元网络形成突触连接的iPSC来源神经元产生突触反应。我们证明，在此类条件下，确实在iPSC来源神经元中检测到增强的突触后电流。该实验方案可用于在多种实验条件下评估突触环路的形成，包括利用来自疾病患者成纤维细胞的iPSC构建不同的神经系统疾病模型，以重现疾病表型。

<table><tbody><tr><td>Neurocult 增殖试剂盒（小鼠）</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>5702</td><td>包含 NSC 基础培养基和 NSC 增殖补充剂</td></tr><tr><td>Epi5 附加体 iPSC 重编程试剂盒</td><td>Invitrogen</td><td>A15960</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Lonza</td><td>12719F</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>354277</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal 培养基</td><td>Invitrogen</td><td>21103049</td><td></td></tr><tr><td>不含谷氨酰胺的 MEM</td><td>Invitrogen</td><td>11090081</td><td></td></tr><tr><td>N2</td><td>Invitrogen</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Invitrogen</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>Invitrogen</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX 补充剂</td><td>Invitrogen</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素（PenStrep）</td><td>Invitrogen</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA）</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>人 LIF</td><td>Invitrogen</td><td>PHC9484</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130103926</td><td></td></tr><tr><td>SB431542</td><td>Sigma</td><td>S4317</td><td></td></tr><tr><td>Compound E</td><td>Merck Millipore</td><td>565790</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>Merck Millipore</td><td>324856</td><td></td></tr><tr><td>FGF2</td><td>R&amp;D Systems</td><td>233FB025</td><td></td></tr><tr><td>研究级 FBS</td><td>Thermo Scientific</td><td>SV30160.03</td><td>用于星形胶质细胞分化培养基</td></tr><tr><td>明确成分的 FBS</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH30070.03</td><td>用于原代神经元培养基</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH30028.02</td><td></td></tr><tr><td>葡萄糖</td><td>Sigma</td><td>G8270</td><td>用于原代神经元培养基</td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Sigma</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>肝素</td><td>EMD Millipore</td><td>375095</td><td></td></tr><tr><td>木瓜蛋白酶（Papain）</td><td>Worthington</td><td>3126</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Invitrogen</td><td>14175095</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Roche</td><td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>Dispase II</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>7923</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630080</td><td>用于脑组织收获</td></tr><tr><td>EBSS</td><td>Invitrogen</td><td>14155063</td><td></td></tr><tr><td>L-半胱氨酸（L-Cysteine）</td><td>Sigma</td><td>C7352</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>70 &amp;micro;m 细胞筛</td><td>BD Biosciences&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>20 &amp;micro;m 滤膜单元</td><td>Sartorius Stedim</td><td>16534K</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P5405</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Fluka</td><td>71505</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>C1016</td><td></td></tr><tr><td>D(+)-葡萄糖</td><td>Sigma</td><td>G7520</td><td>用于电生理学研究</td></tr><tr><td>K-葡萄糖酸盐（K-gluconate）</td><td>Sigma</td><td>P1847</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>KANTO Chemical</td><td>3234400</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td>用于电生理学研究</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;ATP</td><td>Sigma</td><td>A7699</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;GTP</td><td>Sigma</td><td>G8877</td><td></td></tr><tr><td>硼硅酸盐玻璃毛细管</td><td>World precision instruments, Inc</td><td>1604323</td><td></td></tr><tr><td>15 ml 离心管</td><td>BD Biosciences&amp;nbsp;</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>50 ml 离心管</td><td>BD Biosciences</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>24 孔板</td><td>Corning</td><td>9761146</td><td></td></tr><tr><td>6 孔板</td><td>Corning</td><td>720083</td><td></td></tr><tr><td>T25 培养瓶</td><td>Corning</td><td>430641</td><td></td></tr><tr><td>12 mm 盖玻片</td><td>Marienfeld-Superior</td><td>111520</td><td></td></tr><tr><td>AMAXA 大鼠神经元核转染试剂盒&amp;nbsp;</td><td>Lonza</td><td>VPG1003</td><td>用于原代皮层神经元的电穿孔</td></tr><tr><td>Neon 转染系统&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>MPK5000</td><td>用于人成纤维细胞的电穿孔</td></tr><tr><td>Mini Analysis&amp;nbsp;</td><td>Synaptosoft</td><td>Mini Analysis v.6</td><td>用于测量 PSCs</td></tr><tr><td>正常人皮肤成纤维细胞</td><td>PromoCell</td><td>C12300</td><td></td></tr><tr><td>pLenti-Synapsin-hChR2(H134R)-EYFP-WPRE</td><td>Addgene</td><td>20945</td><td></td></tr><tr><td>汞短弧灯</td><td>OSRAM</td><td>HBO 103 W/2</td><td></td></tr></tbody></table>

一种用于评估共培养系统中神经元连接形成的光遗传学方法

An Optogenetic Approach for Assessing Formation of Neuronal Connections in a Co-culture System

本文介绍了一种建立包含两种不同神经元群体共培养体系的实验方案。通过附加体型载体将人成纤维细胞重编程为诱导性多能干细胞（iPSCs）。在成纤维细胞重编程开始后约30天可观察到iPSC克隆。挑选出多能性克隆，并在神经诱导培养基中培养，以促进其分化为神经前体细胞（NPCs）。iPSCs在一周内迅速转化为神经上皮细胞，并在高密度培养条件下保持自我更新能力。原代小鼠NPCs通过暴露于含血清的培养基中培养7天，分化为星形胶质细胞，并形成单层结构，随后接种胚胎第18天（E18）的大鼠皮层神经元（转染了通道视紫红质-2（ChR2））。次日，将标记有荧光蛋白串联二聚体番茄（tdTomato）的人源NPCs接种至该星形胶质细胞/皮层神经元共培养体系中，并继续培养28至35天使其分化。我们证明，该体系可在iPSC来源的神经元与皮层神经元之间形成突触连接，表现为光刺激皮层神经元后突触电流频率显著增加。该共培养体系为评估iPSC来源神经元与其他神经元群体建立突触连接的能力提供了一个全新的平台。

本文介绍了一种共培养体系的建立流程，该体系包含星形胶质细胞、皮层神经元和人类神经元。通过使用附加体质粒载体重编程成纤维细胞获得人诱导多能干细胞（iPSCs）10，并利用小分子抑制剂混合物将其定向分化为神经前体细胞（NPCs）11，随后在高密度条件下维持培养（图1A）。共培养体系的建立需经历多个步骤：将小鼠神经前体细胞分化为星形胶质细胞，接种表达ChR2的大鼠皮层神经元，以及接种标记有tdTomato的人神经前体细胞（图1B）。在分化第2天，即可在培养物中明显观察到胶质纤维酸性蛋白（Glial Fibrillary Acidic Protein, GFAP）阳性的星形胶质细胞（图1C）。小鼠神经前体细胞需至少分化一周后，再将表达ChR2的皮层神经元接种至星形胶质细胞单层上（图1D）。人神经前体细胞经过3至4周的分化后，可在培养物中检测到tdTomato阳性的神经元（图1E）。
该共培养系统能够稳定地检测到单个iPSC来源的神经元在光刺激下产生的突触后电流（图2A）。当接受光刺激时，表达ChR2的皮层神经元会产生动作电位（图2B）。iPSC来源的神经元也具有兴奋性（图2C），随着去极化电流脉冲幅度的增加，其动作电位发放频率升高（图2D）。因此，这些细胞表现出成熟的神经元特性。在无光刺激条件下，iPSC来源的神经元可接收到自发的突触输入（图2E）。这些内向突触后电流主要由AMPA受体介导，因为GABA受体介导的电流应为外向，而NMDA受体在-70 mV的钳制电位下不携带电流。其中至少部分输入来源于表达ChR2的突触前皮层神经元，因为光刺激显著增加了突触后电流的发生频率（图2E）。突触输入频率增加的时间过程如图2F所示：对皮层神经元的光刺激在整个持续30秒的光照期间持续存在。当对表达ChR2的皮层神经元进行光刺激时，突触后电流的频率升高（图2G），但其幅度不受影响（图2H）。综上所述，这些结果表明，iPSC来源的神经元具有成熟的神经元特性，并能够与突触前皮层神经元形成突触连接。
<img alt="iPSC differentiation timeline; reprogram fibroblasts; NPC and neuron induction; microscopy images." src="/files/ftp_upload/52408/52408fig1highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 1"> 
图1：共培养系统构建的示意图. （A） 人成纤维细胞重编程为诱导多能干细胞及神经诱导为神经前体细胞的时间线 （B） 人NPC在皮层神经元和星形胶质细胞共培养体系中向成熟神经元终末分化的时程 (C) 小鼠NPC在2天后迅速分化为GFAP+星形胶质细胞 体外. (D) 一周后，表达ChR2的皮层神经元被接种到GFAP+星形胶质细胞上。 (E) 在人NPCs分化后4至5周，对tdTomato+神经元进行电生理记录。比例尺代表 100 µm.
<img alt="Optogenetic activation of iPSC-derived neurons; ChR2 stimulation, electrophysiology data analysis." src="/files/ftp_upload/52408/52408fig2highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 2"> 
图2：功能性突触连接的光遗传学分析。（A） 表达tdTomato（红色）的iPSC来源细胞与表达光敏通道ChR2（绿色）的皮层神经元共培养。对iPSC来源神经元的记录显示存在突触后电流（PSC）反应，该反应可能来源于皮层神经元或其他iPSC来源神经元。 （B） 光照（蓝色条）在表达ChR2的皮层神经元中诱发了一系列动作电位。 (C) 通过电流刺激激发由iPSC衍生的细胞。 （D） 诱导多能干细胞来源细胞的放电频率与电流曲线 (E) 表达ChR2的皮层神经元的光刺激（蓝色条）增加了iPSC来源神经元中PSCs的频率。 (F) 光刺激引起PSC频率增加的时间进程。蓝色条表示光刺激时间。G, H) 尽管光刺激增加了PSC的频率 (G)，PSC 振幅未受影响 (H). * 表示 p &lt;0.05，与对照组进行学生t检验。

本文描述了一种建立共培养体系的方案，该体系包含由诱导性多能干细胞（iPSCs）衍生的神经元、原代皮层神经元以及星形胶质细胞。该共培养系统可用于检测新生成的、由iPSCs衍生的神经元与已存在的表达光敏通道蛋白-2（channelrhodopsin-2）的皮层神经元之间突触连接和神经回路的形成。

在此，我们描述了一种建立包含两种不同神经元群体共培养体系的实验方案。诱导性多能干细胞（iPSCs）是……

本实验的总体目标是建立一种共培养系统，用于评估人源诱导性多能干细胞分化而来的神经元通过基于光刺激的基因方法形成功能性连接的能力，该方法利用通道视紫红质蛋白 ChR2 或 CR2 对培养的神经元进行光刺激。首先分离小鼠原代神经前体细胞（NPCs），并使其分化为星形胶质细胞；随后将大鼠原代皮层神经元转染 ChR2，接种至星形胶质细胞层上，后者作为已存在的神经元群体。然后，将来源于诱导性多能干细胞（iPSC）培养物的人类神经前体细胞（NPCs）用突触素启动子驱动的tdTomato病毒进行转导，随后接种到星形胶质细胞-神经元共培养体系中，并诱导其分化，进而形成突触连接。结果显示，基于在表达ChR2的皮层神经元接受光遗传学刺激后，iPSC来源的神经元中记录到的突触后电流，表明iPSC来源的神经元与大鼠皮层神经元之间形成了突触连接。该方法相较于现有的仅将星形胶质细胞与人iPSC来源神经元共培养的方法，其主要优势在于此类人类神经元的成熟时间更短。这是因为初级神经元的存在可以加速这些人源神经元的成熟。接下来演示该实验步骤的是来自我实验室的研究生 Uni Chin，以及来自 George Augustine 实验室的 Y。按照文本方案收获胚胎大鼠脑并分离皮层组织后，将皮层组织转移至含有预热皮层组织消化液的培养皿中。尽可能将皮层组织切碎，然后在 37 摄氏度下孵育 30 分钟。孵育结束后，将皮层组织转移至 50 毫升离心管中，使用移液管吹打组织，直至形成无组织块的均一溶液。将组织溶液通过70微米细胞滤筛，以滤除任何残留的组织团块。取3毫升溶液分装至15毫升离心管中。向每支试管底部加入 800 微升含 7.5% BSA 的 1×PBS，形成位于组织层下方的一层，于 200 ×g 离心 5 分钟。然后从两层液体的界面处抽吸去除上清液，避免扰动试管底部的细胞沉淀。用一毫升初级神经元培养基重悬每个细胞样本后，将其全部转移至一个15毫升离心管中。然后使用血细胞计数板测定细胞密度，并在200 ×g 条件下离心5分钟，以收集600万个大鼠皮层神经元，随后弃去上清液。电穿孔至少需要 600 万个皮层神经元。为确保存活的神经元能够形成神经网络，向细胞沉淀物中加入 100 微升电穿孔溶液并轻轻重悬。然后将 100 微升细胞悬液与六微克 CR2 质粒混合，并转移至经认证的电穿孔杯中。根据制造商的说明选择并应用适当的电穿孔程序。电穿孔后，向电穿孔杯中加入 500 µL MEM。将细胞转移至 11.5 mL 原代神经元培养基中，并轻轻重悬。然后将500 µL加入含有小鼠星形胶质细胞的24孔板的每个孔中。将培养板置于37°C和5% CO2条件下孵育。在生成诱导性多能干细胞（iPSCs）或IPCs后，根据文本方案将细胞诱导并维持为人类神经前体细胞（NPC）培养物。在此示例中，将原代神经元加入星形胶质细胞培养物后的第二天，使用慢病毒载体synapse对NPCs进行标记，标记为一种TD番茄红色荧光。用一倍PBS洗涤人NPCs一次，然后加入细胞解离溶液，在30摄氏度下孵育五分钟。确保所有细胞均已解离。然后将它们转移至一个含有两倍体积D-M-E-M-F 12的15毫升离心管中，在200 G条件下离心5分钟。弃去上清液，用神经元分化培养基轻轻重悬细胞沉淀，使其成为单细胞悬液。使用血细胞计数板对细胞进行计数。接着，小心吸除星形胶质细胞-皮层神经元共培养板中的培养基。以每平方厘米每孔5,000个细胞的密度将人源神经前体细胞接种于神经元分化培养基中。在37摄氏度、5%CO2条件下培养，并每两至三天更换一次培养基，持续至少28天。为了确认人类诱导性多能神经元（IPCs）是否具有成熟神经元的特性，使用配备60倍水浸物镜的共聚焦显微镜寻找由人类IPCs分化而来的细胞。通过观察TD番茄红色荧光标记的细胞进行定位。将记录电极拉制至电阻为4到6欧姆，并进行灌流。将细胞置于持续通入95%氧气和5%二氧化碳混合气体的外部溶液中，并在室温下孵育。使用内液填充记录用微电极，在全细胞模式下对表达TD番茄红的阳性细胞进行膜片钳记录，通过电流钳注入电流，记录其动作电位的发放情况。以此验证表达CHR2的皮层细胞的动作电位可被光刺激可靠地诱发。首先，通过汞灯照射并使用激发滤光片波长为480±40纳米的条件，观察GFP荧光以定位表达CR2的皮层细胞。通过全细胞模式下的电流钳记录，确认能够稳定诱发动作电位。为进行基因刺激，对表达TD番茄红的细胞进行全细胞膜片钳记录，使用全场汞灯及480±40纳米激发滤光片，将电压钳制在-70毫伏。对整个视野刺激30秒。记录通过光刺激表达CHR2的突触前皮层神经元所诱导的膜片钳细胞的突触后电流或PSCs。将电流幅值和面积的阈值手动设置为5皮安（Pico Amp）和PICO，分别检查这些事件，以剔除任何非PSC的痕迹。如本视频所示，生成由诱导性前体细胞（IPCs）来源的原代皮层神经元与星形胶质细胞共培养体系需要多个步骤。该图像显示，在小鼠神经前体细胞（NPCs）向星形胶质细胞分化的第二天，即可清晰观察到胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）阳性的星形胶质细胞。在接种表达CHR2的皮层神经元之前，小鼠NPCs需先培养至少一周以完成分化，随后将神经元接种至星形胶质细胞单层上。在此共培养体系中，通过GFAP与CHR2的免疫荧光染色可分别鉴定星形胶质细胞与神经元。人NPC分化三到四周后，培养物中检测到表达TD番茄红的神经元，如图所示。当受到光刺激时，表达CHR2的皮层神经元可产生动作电位。所获得的神经元也具有兴奋性，表现出增强的动作电位活动。随着去极化电流脉冲幅度的增加，神经元出现动作电位发放。在无光照条件下，IPSC来源的神经元接收到自发性突触输入。这些内向性突触后电流主要由AMPA受体介导。在整个第32次长时闪光期间，皮层神经元的光刺激持续存在，同时PSCs的频率升高。当对表达CHR2的皮层神经元进行光刺激时，其振幅未受影响。通过此方法，我们可以采用其他含有不同患者特异性细胞类型的共培养系统，以回答更多问题，例如候选药物化合物对特定疾病的影响。

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Research

科研

JoVE Journal

Developmental Biology

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