Name: 在鸡胚的流感病毒传播 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 56 s
Description: 学习利用受精鸡胚生产高滴度甲型流感病毒的方法，通过尿囊腔接种和收获尿囊液实现。该技术为病毒学研究和疫苗开发提供经济高效的病毒制备方案。

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本研究由美国国立卫生研究院（NIH）资助，项目编号为HL120947（P.C.）、HL103868（P.C.）以及美国心脏协会资助项目（P.C.）

注意：一般说明：所有涉及卵操作的步骤均需在无菌条件下进行，并相应地采用无菌技术。使用前用70%乙醇对所有设备进行预清洁。通常，流感病毒的接种与收获应在生物安全二级（BSL-2）实验室中进行。然而，若本方案用于扩增致病性更强的流感病毒（例如，大流行及大流行前毒株、对家禽和牲畜具有威胁的毒株、高致病性禽流感毒株、1918年H1N1毒株），需要更高的生物安全等级，某些情况下还需采取生物安保措施并获得相应授权。所有涉及流感病毒的研究均应获得当地机构生物安全委员会的批准。
1. 接种用鸡蛋的准备
<ol>
	<li>从合适的供应商处获取无特定病原体（SPF）的新鲜受精禽蛋。通常使用鸡卵。卵应在到达后立即使用。</li>
	<li>卵到达后，将其放入带有自动转蛋器的加湿孵化箱中，以定期旋转卵。若无自动转蛋器，需每天手动旋转卵至少2–3次（务必佩戴手套，并尽可能保持无菌操作）。</li>
	<li>在37 °C、55–60%湿度条件下孵化10–11天。</li>
</ol>
2. 鸡蛋照检
<ol>
	<li>使用验蛋灯在暗室中将鸡蛋置于明亮光源下照射，孵化约7至8天后通过照蛋检查鸡蛋是否未受精。
	<ol>
		<li>用70%乙醇擦拭验蛋灯。频繁更换手套，并用70%乙醇进行消毒，以尽量降低病原体污染的风险。</li>
		<li>将鸡蛋从孵化箱中取出，放入空的蛋托中。</li>
		<li>关闭房间内的灯光。</li>
		<li>依次将每个鸡蛋的钝端紧贴验蛋灯。</li>
		<li>观察鸡蛋，判断其是否受精。 
		注意：应能清晰看到通向豆状胚胎的细小血管。未受精的鸡蛋则仅可见一个小血点和明显的蛋黄。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>丢弃未受精的鸡蛋，并将存活的鸡蛋放回孵化箱。鸡蛋在孵化箱外放置时间不得超过30分钟。若无法确认鸡蛋状态，应做好标记，稍后再次观察。</li>
</ol>
3. 病毒接种物的制备
<ol>
	<li>将流感病毒原液用含有10 mM HEPES（pH 7.4）的无菌PBS稀释至约103 – 104 pfu/ml。关键步骤：病毒原液需在使用前立即稀释，并始终将稀释后的病毒置于冰上。</li>
</ol>
4. 通过尿囊途径接种流感病毒
<ol>
	<li>在接种病毒当天（第10或11天），再次照蛋并剔除所有已死亡的胚胎。通过观察蛋内是否有活动来区分存活的胚胎。</li>
	<li>从培养箱中取出三个鸡蛋，并将其放置在独立的蛋架上，气室朝上。</li>
	<li>用永久性记号笔标记鸡蛋气室的位置。</li>
	<li>用70%乙醇清洗气室上方的蛋壳表面。</li>
	<li>将气室朝上的鸡蛋放入蛋托中，然后置于生物安全柜（BSL-2）内。</li>
	<li>使用无菌18G针头在每个鸡蛋气室上方的蛋壳上扎一个小孔。注意不要将针头插入过深，以免刺伤胚胎或卵黄。</li>
	<li>用无菌1 ml注射器吸取稀释后的流感病毒，并安装22G针头。</li>
	<li>将带针头的注射器以45°角小心插入尿囊腔。</li>
	<li>注入0.2 ml稀释后的流感病毒。</li>
	<li>对另外两个鸡蛋重复上述注射操作，然后丢弃注射器和针头。</li>
	<li>用热熔胶枪（或熔化的石蜡）滴一滴胶封闭小孔。注意避免胶液渗入蛋内。</li>
	<li>将鸡蛋重新放回孵化箱，保持气室朝上。</li>
	<li>重复步骤4.2–4.12，直至所有鸡蛋均完成接种。</li>
</ol>
5. 孵育时间
<ol>
	<li>将感染的鸡蛋在37 °C、约60%湿度条件下孵育，期间不进行翻动。</li>
	<li>根据流感病毒类型选择最佳孵育时间：甲型流感病毒孵育48小时；乙型和丙型流感病毒孵育72小时。</li>
</ol>
6. 流感病毒收获
<ol>
	<li>孵育结束后，将鸡蛋置于 4 °C 冷却至少 4 小时（或过夜），以杀死胚胎并收缩血管，从而降低血液污染感染性尿囊液的风险。此步骤可防止红细胞吸附病毒，避免降低病毒产量。也可将鸡蛋在 -20 °C 冷冻 30 分钟，但此方法会增加血液污染的风险。</li>
	<li>待鸡蛋充分冷却后，将其转移至生物安全柜中。将鸡蛋放入固定架，使气室朝上。用 70% 乙醇擦拭蛋壳表面进行消毒。</li>
	<li>使用无菌剪刀在气室上方剪开蛋壳。小心去除气室周围的蛋壳，注意不要破坏绒毛尿囊膜。</li>
	<li>用无菌钝头镊子轻轻撕开绒毛尿囊膜。用小刮勺或小勺轻轻移开胚胎和卵黄囊，注意避免刺破卵黄。</li>
	<li>使用 1 ml Eppendorf 移液器小心吸取尿囊液。必要时可将鸡蛋稍倾斜，以尽可能收集更多液体。</li>
	<li>将所有鸡蛋的尿囊液合并至一个 50 ml 塑料锥形管中。病毒收获过程中，始终将管子置于冰上。每枚鸡蛋可收获 5–10 ml 淡黄色液体。</li>
	<li>将含有病毒的尿囊液在 4 °C 下以 1,000 × g 离心 10 分钟，以沉淀杂质。将上清液转移至另一个预冷的 50 ml 管中，并始终保持在冰上。将废弃鸡蛋放入 BSL-2 级生物废物容器中处理。</li>
</ol>
7. 储存
<ol>
	<li>立即分装澄清的尿囊液（例如， 50、100 或 500 μl 分装后，于液氮中速冻。将冻存的病毒原液转移至 -80 °C 冰箱中长期保存。</li>
</ol>

<ol><li>Centers for Disease Control and Prevention (CDC). <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimates+of+deaths+associated+with+seasonal+influenza+---+United+States%2C+1976-2007%5BTitle%5D)+AND+%22MMWR.+Morbidity+and+mortality+weekly+report%22%5BJournal%5D)">Estimates of deaths associated with seasonal influenza --- United States, 1976-2007.</a> MMWR. Morbidity and mortality weekly report. 59 (33), 1057-1062 (2010).</li>
<li>Neumann, G., Noda, T., Kawaoka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emergence+and+pandemic+potential+of+swine-origin+H1N1+influenza+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Emergence and pandemic potential of swine-origin H1N1 influenza virus.</a> Nature. 459 (7249), 931-939 (2009).</li>
<li>Tumpey, T. M., Garcia-Sastre, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenicity+of+Influenza+Viruses+with+Genes+from+the+1918+Pandemic+Virus%3A+Functional+Roles+of+Alveolar+Macrophages+and+Neutrophils+in+Limiting+Virus+Replication+and+Mortality+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Pathogenicity of Influenza Viruses with Genes from the 1918 Pandemic Virus: Functional Roles of Alveolar Macrophages and Neutrophils in Limiting Virus Replication and Mortality in Mice.</a> J Virol. 79 (23), 14933-14944 (2005).</li>
<li>Doherty, P. C., Turner, S. J., Webby, R. G., Thomas, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influenza+and+the+challenge+for+immunology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immu%22%5BJournal%5D)">Influenza and the challenge for immunology.</a> Nat Immu. 7 (5), 449-455 (2006).</li>
<li>Webster, R. G., Govorkova, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuing+challenges+in+influenza%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+N+Y+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Continuing challenges in influenza.</a> Ann N Y Acad Sci. 1323 (1), 115-139 (2014).</li>
<li>Szretter, K. J., Balish, A. L., Katz, J. M. Unit 15G.1 Influenza: propagation, quantification, and storage. . <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSzretter%2C+KJ+%22Current+protocols+in+microbiology%22">Current protocols in microbiology</a>. , Wiley. (2006).</li>
<li>Short, K. R., Kroeze, E. J. B. V., Fouchier, R. A. M., Kuiken, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenesis+of+influenza-induced+acute+respiratory+distress+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Pathogenesis of influenza-induced acute respiratory distress syndrome.</a> Lancet Infect Dis. 14 (4), 57-69 (2014).</li>
<li>Ito, T., Suzuki, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differences+in+sialic+acid-galactose+linkages+in+the+chicken+egg+amnion+and+allantois+influence+human+influenza+virus+receptor+specificity+and+variant+selection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Differences in sialic acid-galactose linkages in the chicken egg amnion and allantois influence human influenza virus receptor specificity and variant selection.</a> J Virol. 71 (4), 3357-3362 (1997).</li>
<li>Robertson, J. S., Nicolson, C., Major, D., Robertson, E. W., Wood, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+amniotic+passage+in+the+egg-adaptation+of+human+influenza+virus+is+revealed+by+haemagglutinin+sequence+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Virol%22%5BJournal%5D)">The role of amniotic passage in the egg-adaptation of human influenza virus is revealed by haemagglutinin sequence analyses.</a> J Gen Virol. 74 (Pt 10), 2047-2051 (1993).</li>
<li>Gaush, C. R., Smith, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+and+plaque+assay+of+influenza+virus+in+an+established+line+of+canine+kidney+cells%29%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Replication and plaque assay of influenza virus in an established line of canine kidney cells).</a> Appl Microbiol. 16 (4), 588-594 (1968).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

流感在全球范围内造成了巨大的疾病负担，目前仍在持续开展关于肺损伤发病机制的研究7。为了促进对这种致命疾病的研究，已开发出多种方法用于扩增流感病毒6。本文介绍一种在鸡胚中制备流感病毒的技术。该方法的优势在于具有高度可重复性，并能产生大量高滴度的流感病毒储备液，这通常是体外（in vitro）研究所需的。
大多数实验室均可以较低的启动成本快速、简便地建立本实验方案。尽管我们建议投资购买带有自动翻蛋功能的孵卵器，但本方案也可在无此类设备的情况下完成，只是操作会更加繁琐。我们还建议通过商业性科研供应商购买受精卵，以确保卵的均一性和无菌性。根据美国卫生与公共服务部（PHS）《实验动物人道照护与使用政策》中实验室动物福利办公室（OLAW）的解释，对于活体禽类胚胎卵的研究使用，PHS 政策仅在孵化后适用。因此，大多数机构不要求本方案获得实验动物管理与使用委员会（IACUC）的批准。然而，不同机构的政策存在差异，在启动本方案前必须获得机构生物安全委员会的批准。
处理病毒时，从感染的...

甲型流感病毒仍然是人类健康的重大威胁。它是一种可能带来严重后果的呼吸道疾病，全球疾病负担巨大，每年在全球范围内导致多达50万人死亡 1流感病毒属于正粘病毒科，其基因组包含8个负链单股RNA片段。 1,2. 高突变性（即，病毒基因组的抗原“漂移”导致无法产生长期免疫力。此外，流感病毒对抗病毒药物的耐药性日益增强 3.
2009年H1N1流感大流行凸显了与流感疾病相关的所有挑战性问题（大流行毒株、抗病毒药物耐药性、疫苗生产延迟）。世界卫生组织每年都会确定疫苗配方，以应对最可能流行的致病性流感毒株（分别为H1N1、H3N2和乙型流感病毒各一种）4。由于该方法基于对流感毒株的预测，有时会出现致病毒株识别错误，导致疫苗效力显著下降。此外，新型流感毒株的出现可能绕过这些预防措施，引发大流行疾病2。
通用流感疫苗的研制一直难以实现5。因此，必须继续深入研究肺损伤的发病机制。为了促进实验室研究，目前已开发出多种病毒分离与扩增方法6。人流感病毒可在多种哺乳动物细胞基质中扩增，但大量制备高滴度病毒的最佳方法仍是在鸡胚中进行。以下方案描述了从现有病毒储备株中进行甲型流感病毒扩增与保存的技术。

<table><tbody><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>Cellgro&amp;nbsp;</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>无特定病原体（SPF）受精鸡胚&amp;nbsp;</td><td>VALO BioMedia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>加湿型孵蛋器&amp;nbsp;</td><td>FARM iNNOVATORS</td><td>Model 2100</td><td></td></tr><tr><td>自动翻蛋器</td><td>FARM iNNOVATORS</td><td>Model 3200</td><td></td></tr><tr><td>照蛋仪</td><td>FARM iNNOVATORS</td><td>Model 3300&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>1 ml 注射器</td><td>BD Bioscience</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>18G 针头</td><td>BD Bioscience</td><td>305196</td><td></td></tr><tr><td>20G / 22G 针头</td><td>BD Bioscience</td><td>305176 / 305156</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>乙醇&gt;99.5%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>459844</td><td>用水稀释至 70%</td></tr><tr><td>热熔胶枪 &quot;Ad tech Hi Temp Project Pro&quot;</td><td>Ad tech, Adhesive Technologies, Inc.</td><td>Model 1105</td><td></td></tr><tr><td>胶棒 &quot;Ad tech MINI SIZE, Multi Temp&quot;</td><td>Ad tech, Adhesive Technologies, Inc.</td><td>220-34ZIP30</td><td></td></tr><tr><td>MDCK 细胞</td><td>ATCC</td><td>CRL-2935</td><td></td></tr><tr><td>洗涤混合火鸡红细胞，10%</td><td>Lampire Biological Laboratories</td><td>724908</td><td></td></tr></tbody></table>

流感病毒在鸡胚中的增殖

Influenza Virus Propagation in Embryonated Chicken Eggs

流感感染每年在美国导致约36,000人死亡和超过200,000例住院。由于病毒不断发生突变和基因重配，新的流感病毒株持续出现，这使病毒的控制变得复杂，并需要持续开发新的药物和疫苗。在实验室中研究流感需要一种可靠且成本效益高的病毒扩增方法。本文提供了一种在受精鸡胚中高效扩增甲型流感病毒的全面方案，该方法可稳定获得高滴度的病毒储备液。简要而言，将无特定病原体（SPF）级别的受精鸡胚置于37 °C、55–60%湿度条件下孵育10–11天。在此期间，可通过照蛋仪方便地监测胚胎发育情况。通过注射器将病毒原液注入尿囊腔进行接种。接种后，在37 °C继续孵育2天，随后将鸡蛋在4 °C下冷藏至少4小时。然后小心打开气室上方的蛋壳和绒毛尿囊膜，收集含有病毒的尿囊液。通过离心去除杂质后，将尿囊液分装并转移至-80 °C长期保存。本方法每个鸡蛋可获得大量病毒液（每枚蛋5–10 mL），且通常能实现高病毒滴度，因此我们优先采用鸡胚法进行病毒制备，尤其适用于需要大量相同病毒储备液的高剂量 in vitro 研究。

已开发出多种方法用于测定流感病毒滴度。选择合适方法时需考虑的一个因素是，某些方法测定的是病毒总颗粒数，而不论其是否具有活性（例如，血凝素测定法），而另一些方法则基于感染性，用于评估具有活性的病毒颗粒（例如，蚀斑测定法）6。本研究中，通过蚀斑测定法（图 1）和血凝测定法（图 2）测定了从接种了小鼠适应性流感病毒（A/PR/8/34）的鸡胚尿囊液中收获的病毒滴度。
流感病毒感染会引起细胞病变效应，导致细胞单层上形成空斑（溶解细胞的圆形区域）。通过结晶紫染色显示空斑，在病毒10-12 稀释度的孔中计数到65个空斑（图1）。由于向细胞中加入了500 µL稀释后的病毒原液，最终滴度为1.3 × 1014 PFU/mL。
血凝试验是一种基于流感病毒与红细胞表面结合能力来滴定病毒的方法。病毒悬液会使红细胞发生凝集，从而阻止红细胞从悬液中沉降...

可孵化的鸡胚被广泛用于大量生产人流感A病毒，因其提供了一种便捷且经济高效的方法，可获得高产量的病毒。

流感感染每年在美国与约36,000例死亡和超过200,000例住院相关。其持续……

本实验的总体目标是利用一种经济高效的方法，大量制备高滴度的流感病毒。该目标首先通过获取无特定病原体（SPF）且新鲜受精的鸡胚来实现；第二步，通过尿囊腔途径将流感病毒接种至鸡胚中。将含有病毒的艾伦·托伊克液在48小时后进行收集，并在液氮中迅速冷冻病毒。最终，可进行蚀斑试验和血凝素试验，以确定所收集的艾伦·托伊克液中病毒滴度的影响。该方法的可视化演示至关重要，因为收获步骤非常敏感，需要对鸡蛋进行小心操作，并充分了解其解剖结构。从合适的供应商处获取无病原体血清、新鲜受精的达维安鸡胚蛋，然后开始实验操作。鸡胚蛋到达后立即放入加湿的孵卵器中，并使用自动转蛋器，在37摄氏度、55%至60%湿度条件下定期翻蛋，孵育10至11天。孵育7至8天后，佩戴经70%乙醇消毒的手套进行操作。用乙醇擦拭检卵灯，将孵化箱中的鸡蛋转移至空的鸡蛋盒中。然后关闭灯光，逐个将鸡蛋的钝端紧贴检卵灯。若鸡蛋已受精，应能清晰看到通向豆状胚胎的细小血管。如果卵子未受精，将观察到一个小的血斑，并可见卵黄。随后丢弃未受精的卵子，将可存活的卵子放回孵化箱。若无法确认卵子的状态，应标记该卵子，留待受精后第10天或第11天再次观察。在使用前立即用含HEPES的无菌PBS将甲型流感病毒原液稀释至每毫升1×10³到1×10⁴ PFU，并置于冰上。然后再次对每个卵进行透光检查，剔除所有已死亡且无活动的胚胎。接着，从孵化箱中取出三枚卵，并将它们放置在独立的卵架中。将气室朝上，用永久性记号笔标记卵的气室位置。然后用70%乙醇擦拭气室上方区域，并在生物安全二级（BSL-2）生物安全柜内将鸡蛋气室朝上转移至蛋盒中。接着使用无菌的18号针头在每枚鸡蛋气室上方的蛋壳处扎一个小孔，注意不要将针头插入过深，以免刺伤胚胎或蛋黄。然后将稀释后的流感病毒吸入一支无菌的1毫升注射器中。安装一个22号针头，以45度角小心地将针头插入第一枚鸡蛋的尿囊腔。向鸡蛋内注入0.2毫升稀释的病毒，随后在注射完另外两枚鸡蛋后，丢弃注射器和针头，并用热熔胶枪的胶滴将每个穿刺孔密封。注意胶水不要渗入蛋内，然后将蛋放回孵育箱中。所有蛋接种完成后，将感染的蛋置于37摄氏度、60%湿度条件下孵育，孵育期间不翻蛋，孵育时间根据流感病毒类型确定为最佳时间。孵育期结束后，将鸡蛋在4°C条件下冷藏至少4小时，以杀死胚胎并收缩血管。当鸡蛋充分冷却后，将其转移至生物安全柜中的稳固蛋架上，并用70%乙醇擦拭蛋壳表面。然后使用无菌剪刀在第一枚鸡蛋的气室上方剪开蛋壳。去除气室周围的蛋壳，注意不要损伤绒毛尿囊膜。然后使用无菌钝头镊子打开绒毛尿囊膜，并用小刮勺或小勺轻轻移开胚胎和卵黄囊，注意不要弄破卵黄。接着，用一支1毫升移液器小心吸取羊水，必要时将蛋壳侧倾以尽可能收集更多的液体。每枚蛋可收获5至10毫升略带淡黄色的液体，随每枚蛋的采集而获得。将所有含病毒的尿囊液汇集到预冷的50毫升塑料离心管中，置于冰上。待全部液体收集完毕后，离心去除病毒沉淀，将上清液转移至新的50毫升离心管中，置于冰上。最后，将使用过的鸡蛋弃置于生物安全二级（BSL-2）废弃物容器中，并立即对澄清的尿囊液进行后续处理。然后迅速将病毒在液氮中冷冻，并将冻存的样品置于负80摄氏度的冰箱中。对于长期保存，流感病毒感染会引起细胞病变效应，导致在细胞单层上形成圆形的细胞空斑或蚀斑。在本实验中，通过结晶紫染色使蚀斑显色，随后在病毒稀释度为1×10⁻¹²的孔中计数到65个蚀斑，因为已将500 µL稀释后的病毒原液接种至细胞上进行培养。在此实验中，最终滴度为每毫升 1.3 × 10¹⁴ PFU。血凝试验是一种基于流感病毒与红细胞表面结合能力来测定病毒滴度的方法。如所观察到的，病毒悬液使红细胞发生凝集，阻止红细胞从悬液中沉降下来。在50微升中病毒稀释至2的负10次方时，观察到明确的阴性结果。因此，最终滴度为每毫升2.1×10⁴ HAU。观看本视频后，您应能充分理解如何通过接种鸡胚增殖流感病毒，以及如何收获含有病毒的尿囊液。

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Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

在鸡胚的流感病毒传播

从质粒DNA中拯救甲型流感病毒是一项基础且关键的实验技术，该技术可使流感研究人员能够构建重组病毒，用于研究流感病毒生物学的多个方面，并可作为潜在的载体或疫苗使用。...

从质粒DNA生成重组流感病毒

流感病毒A型的并发感染是无症状携带Streptococcus...

利用生物发光成像研究协同作用 肺炎链球菌 以及流感病毒A在幼鼠中的研究

来源：Brauer, R. et al.，鸡胚中流感病毒的增殖。J. Vis. Exp.

从受精鸡胚中扩增与收获流感病毒

本视频展示了一种用于生成中和性流感病毒单克隆抗体逃逸变异株的技术。将抗体中和后的病毒悬液接种至鸡胚中，以选择性扩增逃逸变异株。由此获得的病毒群体主要为逃逸变异株，其存在经测序验证 通过...

生成流感病毒对中和抗体的逃逸变体

该视频展示了一种构建耐冷重组流感病毒的方法。该方法包括将双向质粒转染至人源细胞，随后在较低温度下孵育，以获得适用于疫苗生产的病毒，这些病毒在较高温度条件下复制能力降低。...

生成用于疫苗的重组减毒流感病毒

近年来，为了开发新的疫苗和治疗载体等应用，人们对新城疫病毒（NDV）进行了广泛研究。这些研究得以实现，得益于从cDNA中拯救重组病毒的技术，例如本文所描述的方法。...

从cDNA拯救重组新城疫病毒

展示了用于人类甲型流感病毒的全身性及局部感染斑马鱼模型。利用全身性感染模型，可将斑马鱼用于抗病毒药物的筛选；利用局部感染模型，可将斑马鱼用于宿主免疫细胞反应的表征。...

利用斑马鱼模型研究人类甲型流感病毒感染以筛选抗病毒药物并表征宿主免疫细胞反应

本文提供了一种通过核转染子孢子或第二代裂殖子实现鸡艾美球虫（Eimeria）寄生虫稳定转染的方法。表达外源抗原基因的基因修饰艾美球虫可作为疫苗递送载体。...

核转染与鸡体内扩增 艾美耳球虫 寄生虫

本文的总体目标是描述如何对鸡胚进行in...

在卵内 鸡胚血管内注射

在此，我们提供了一种高效价重组新城疫病毒的制备、纯化与定量的详细操作流程。该方案可稳定获得 &gt; 6 × 109 每毫升噬斑形成单位，提供适用于病毒定量的合适数量 体内 动物实验。为确保安全性而进行的额外质量控制检测 体内...

从尿囊液中制备高滴度重组新城疫病毒

该方法展示了鸡胚作为一种简单且经济高效的体内模型，可用于将处于可存活但不可培养（VBNC）状态的细菌病原体L.

鸡胚作为 在体 内 复苏可存活但不可培养病原体的模型

学习利用受精鸡胚生产高滴度甲型流感病毒的方法，通过尿囊腔接种和收获尿囊液实现。该技术为病毒学研究和疫苗开发提供经济高效的病毒制备方案。

流感病毒在鸡胚中的增殖

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