流感病毒在鸡胚中的增殖

本实验的总体目标是利用一种经济高效的方法，大量制备高滴度的流感病毒。该目标通过以下步骤实现：首先获取无病原体血清的、新鲜受精的鸡胚；在第二步中，通过尿囊腔途径将流感病毒接种至鸡胚内。

将含有病毒的艾伦·托伊克液在48小时后收集，并在液氮中迅速冷冻病毒。最终，可进行蚀斑试验和血凝素试验，以确定所收集的艾伦·托伊克液中病毒滴度的影响。该方法的可视化演示至关重要，因为收获步骤非常敏感，需要对鸡蛋进行小心操作，并充分了解其解剖结构。

从合适的供应商处获取无病原体血清、新鲜受精的达维安鸡胚蛋，并开始实验操作。收到后立即放入加湿的孵卵器中，使用自动转蛋器，在37摄氏度、55%至60%湿度条件下定期旋转培养10至11天。孵化7至8天后，佩戴经70%乙醇消毒的手套。

用乙醇擦拭检卵灯，将孵化箱中的鸡蛋转移至空的鸡蛋盒中。然后关闭灯光，逐个将鸡蛋的大头端紧贴检卵灯进行观察。若鸡蛋已受精，应能清晰看到通向豆状胚胎的细小血管。

如果卵子未受精，则会观察到带有可见卵黄的小血斑。随后丢弃未受精的卵子，并将存活的卵子放回孵育箱。若无法确认卵子的状态，应标记该卵子，留待受精后第10天或第11天再次观察；在使用前立即用含HEPES的无菌PBS将甲型流感病毒原液稀释至每毫升1×10³到10⁴ PFU，并置于冰上。

然后再次对每个卵进行透光检查，剔除所有已死亡且无活动的胚胎。接着，从孵化箱中取出三枚卵，并将它们放置在独立的卵架上。将气室朝上，用永久性记号笔标记卵的气室位置。

然后用70%乙醇擦拭气室上方区域，并将鸡蛋气室朝上转移至生物安全二级（BSL-2）生物安全柜内的蛋托中。接着使用无菌的18号针头，在每枚鸡蛋气室对应的蛋壳处穿刺一个小孔，注意针头不要插入过深，以免刺伤胚胎或卵黄。

然后将稀释后的流感病毒吸入一支无菌的1毫升注射器中。安装一根22号针头，以45度角小心地将针头插入第一个鸡蛋的尿囊腔。向鸡蛋中注射0.2毫升稀释后的病毒，随后依次注射其余两个鸡蛋，注射完成后丢弃注射器和针头，并用热熔胶枪的胶滴将每个孔密封。

注意胶水不要渗入蛋内，然后将蛋放回孵育箱中。所有蛋接种完成后，将感染的蛋置于37摄氏度、60%湿度条件下孵育，孵育期间不翻蛋，孵育时间根据流感病毒类型确定为最佳时间。

孵育期结束后，将鸡蛋置于4°C条件下至少冷藏4小时，以杀死胚胎并收缩血管。待鸡蛋充分冷却后，将其转移至生物安全柜中的稳固容器内，并用70%乙醇擦拭蛋壳表面。

然后使用无菌剪刀在第一枚鸡蛋的气室上方剪开蛋壳。去除气室周围的蛋壳，注意不要损伤绒毛尿囊膜。

然后使用无菌钝头镊子打开绒毛尿囊膜，并用小刮勺或小勺子轻轻移开胚胎和卵黄囊，注意不要弄破卵黄。接着，用一支1 mL的移液器小心吸取尿囊液，根据需要将鸡蛋倾斜至一侧，以尽可能收集更多的液体。每枚鸡蛋通常可收获5至10 mL微黄色的液体。

将卵黄液收集到预冷的50毫升塑料锥形管中，置于冰上。待所有液体收集完毕后，离心病毒，将澄清的上清液转移至新的50毫升管中，置于冰上。最后，将废弃的卵壳投入生物安全二级废弃物容器中，并立即对澄清的卵黄液进行后续处理。

然后迅速将病毒在液氮中冷冻，并将冷冻的样本置于负80摄氏度的冰箱中保存。对于长期储存，流感病毒感染会引起细胞病变效应，导致在细胞单层上形成由裂解细胞构成的圆形区域或空斑。在本实验中，通过结晶紫染色使空斑可视化，在病毒稀释度为1×10⁻¹²的孔中计数到65个空斑，因为将500 µL稀释后的病毒储存液接种至细胞上进行培养。

在本实验中，最终滴度为每毫升 1.3 × 10¹⁴ PFU。血凝试验是一种基于流感病毒与红细胞表面结合能力来测定病毒滴度的方法。如所观察到的，病毒悬液使红细胞发生凝集，阻止红细胞从悬液中沉降下来。

在50微升中病毒稀释至2的负10次方时，观察到明显阴性结果。因此，最终滴度为每毫升2.1 × 10⁴ HAU。观看本视频后，您应能充分理解如何通过接种鸡胚增殖流感病毒，并收获含有病毒的羊水。