在鸡胚的流感病毒传播

该程序的总体目标是在具有成本效益的系统中生产大量高滴度流感病毒。这是通过首先获得不含血清病原体的新鲜受精鸡蛋来实现的。在第二步中，鸡蛋通过 Alan Toic 根感染流感病毒。

在 48 小时内，收集含有病毒的 Alan Toic 液，并将病毒在液氮中快速冷冻。最终，可以进行噬菌斑和血凝素测定以确定收集的 Alan Toic 的病毒滴度的影响。这种方法的流体目视演示至关重要，因为收获步骤非常敏感，需要小心处理种蛋并充分了解其解剖结构。

在开始该程序之前，从合适的供应商处获得不含血清病原体的新鲜受精戴维安卵。到达后，立即将鸡蛋放入带有自动翻蛋器的加湿鸡蛋孵化器中，在 37 摄氏度和 55% 至 60% 湿度下定期旋转鸡蛋 10 至 11 天。孵育 7 至 8 天后，戴上 70% 乙醇消毒手套。

用乙醇擦拭鸡蛋蜡烛机，然后将鸡蛋从孵化器转移到空鸡蛋盒中。然后关灯，将鸡蛋的大端，一次一个地靠在 Candler 上。如果卵子是可育的，则通向豆形胚胎的细血管应该清晰可见。

如果鸡蛋未受精，则会观察到一个带有可见蛋黄的小血点。然后丢弃未受精的鸡蛋，将有活力的鸡蛋放回孵化器。如果无法确认卵子的状态，请在受精后第 10 天或第 11 天标记以备后观察，并在使用前立即将甲型流感病毒原液稀释至每毫升 10 至 10 至 10 至 4 PFU 在补充有嬉皮士的无菌 PBS 中稀释至每毫升 PFU 的 1 倍，并将其置于冰上。

然后再次用蜡烛照射每个鸡蛋，并消除任何死亡的固定胚胎。接下来，从孵化器中取出三个鸡蛋，并将它们放在一个单独的支架中。将气袋升起，用永久性记号笔标记鸡蛋的空域。

然后用 70% 乙醇清洗空域上方的区域，并将鸡蛋空域向上转移到 A BSL 两个生物安全罩内的鸡蛋盒中。现在用无菌的 18 号针在每个鸡蛋的气袋上的蛋壳上打一个小孔。注意不要将针头插入太深，以免刺伤胚胎或蛋黄。

然后将稀释的流感病毒吸入无菌的 1 毫升注射器中。连接一根 22 号针头，小心地将针头以 45 度角推进到第一个鸡蛋的 Alan Toic 腔中。将 0.2 毫升稀释的病毒注射到鸡蛋中，然后在注射另外两个鸡蛋后，丢弃注射器，并用胶枪中的一滴胶水针头密封每个孔。

注意胶水不要泄漏到鸡蛋内部，然后将鸡蛋放回孵化器中。接种所有种蛋后，在 37 摄氏度和 60% 湿度下孵化受感染的种蛋，不要转动以获得最佳孵化时间。取决于流感病毒类型。

在孵化期结束时，将鸡蛋在 4 摄氏度下冷却至少 4 小时，以杀死胚胎并收缩血管。当鸡蛋充分冷却时。将它们转移到生物安全罩和坚固的支架上，并用 70% 乙醇清洁鸡蛋表面。

然后用无菌剪刀打开第一个鸡蛋气袋上方的蛋壳。拆下气袋周围的外壳。注意不要损坏绒毛膜 Alan Toic 膜。

然后用无菌钝钳打开绒毛膜 Alan Toic 膜，用小抹刀或勺子轻轻地将胚胎和蛋黄袋移到一边，注意不要使蛋黄破裂。接下来，使用 1 毫升 einor 移液器小心收集 Alan Toic 液体，将鸡蛋向一侧倾斜，以收集尽可能多的液体。收获每个鸡蛋时，每个鸡蛋应产生 5 到 10 毫升略带黄色的液体。

将 Alan Toic 液体混合在冰上的 50 毫升塑料锥形管中。收集完所有液体后，旋转病毒并将透明液体转移到冰上新的 50 毫升试管中。最后，将鸡蛋丢弃在 A BSL 两个废物容器中，并立即用 Eloqua 澄清的 LAN toic 液体。

然后咬住病毒，在液氮中冷冻，并将冷冻的茎放入零下 80 摄氏度的冰箱中。对于长期储存，流感病毒感染会引起细胞病变效应，导致在单层细胞上形成带状细胞或斑块的圆形区域。在本实验中，通过用结晶紫对细胞进行染色来观察噬菌斑，并在孔中用 1 乘以 10 至负 12 稀释的病毒储液计数 65 个噬菌斑，因为在细胞上培养了 500 μL 稀释的病毒储液。

在该实验中，最终滴度为每毫升 10 至第 14 个 PFU 的 1.3 倍。血凝素国家测定是一种根据病毒附着在红细胞表面的能力对流感病毒进行滴定的方法。据观察，病毒悬浮液会凝集红细胞，防止红细胞从悬浮液中沉淀出来。

在 50 μL 中稀释病毒的 2 到负 10 时观察到明显的阴性结果。因此，最终滴度为每毫升 10 的 2.1 乘以 4 个 HAU。看完这个视频，你应该对如何通过接种鸡蛋和收集含有病毒的大西洋液体来传播流感病毒有了很好的了解。