使用膜片钳技术在暗适应小鼠视网膜切片制备中记录神经元的光诱发突触后反应

本实验的总体目标是从暗适应的视网膜神经元中获得光反应记录。首先取小鼠眼球，第二步是分离视网膜并将其切割以制备组织切片。

接下来，将视网膜制备样本安装到显微镜下进行观察，以找到用于膜片钳记录的目标细胞。建立全细胞膜片钳构型后，在细胞附近施加光刺激。最后，可通过采集软件观察到同步的电生理反应。

与KRC成像等现有方法相比，该技术的主要优势在于记录灵敏度高，并且可以对记录细胞进行形态学鉴定。通常，初次接触该方法的研究者会遇到困难，因为在完全黑暗环境中操作对于不习惯此种条件的人员而言可能具有挑战性且容易迷失方向。开始实验前，应将解剖工具和转移移液管放置在解剖显微镜附近。

工作区域将被妥善组织，以便在黑暗中也能轻松取用每种工具。准备就绪后，Dawn 使用红外观察仪在暗环境中进行操作。安乐死后，迅速摘除眼球并将其置于盛有冷解剖液的培养皿中，将培养皿放在暗盒内，并在显微镜下操作。

将眼球转移至含有冷解剖液的培养皿中，持续通入氧气。为去除角膜和晶状体，用镊子夹住眼球另一端的视神经以固定眼球，防止其移动，然后使用显微外科刀在角膜顶部做一切口。

使用手术剪延长切口，并取出角膜，保留其周围部分巩膜。接着用精细镊子夹住晶状体，缓慢将其拉出。制成眼杯后，用小型移液管将冰冷的含氧解剖液轻轻倒入眼杯中。

操作需迅速，以保持视网膜的形态，并使用轻柔压力辨认视网膜的背侧与腹侧。使用红外观察仪识别穿过视网膜眼杯的分界线，该线经过视神经乳头附近。此分界线主要穿过视神经的腹侧，而包含视神经的一侧为背侧。

根据实验需要，在腹侧或背侧进行切口。此切口用于标记不需要的一侧，并在后续操作中作为有用的标记。接下来，用超细镊子轻轻去除玻璃体，注意不要触碰视网膜。

玻璃体主要附着在眼杯的底部和外缘。由于玻璃体可能与眼杯紧密粘连，操作时应轻柔以避免视网膜脱离。持续牵拉直至无张力感为止。

视网膜分离后，抓住巩膜并轻轻剥离视网膜。使用镊子的背面修剪视网膜，并将不需要的一半丢弃至同一塑料培养皿中。将剩余的视网膜每片再切成两块。

剪去边缘以制备视网膜组织块，并修剪折叠的边缘。接着，使用大号移液管将视网膜组织块转移至玻片上。用小移液管吸除多余溶液，并用一片滤纸压平组织块。

使用小型移液管将一小片滤膜轻轻放置在组织上。在滤膜上滴加一滴解剖液。等待约15秒，使溶液充分扩散并将视网膜组织黏附在滤膜上。

粘附后，继续在滤膜下方及周围倒入更多冰冷的解剖液，直至膜漂浮起来。接着，将滤膜放入切片室中，并用解剖液覆盖。操作需迅速，确保膜不干燥，使用切片机将视网膜组织切成片状。

将带有润滑轨道的塑料盖玻片放入切片室中。将视网膜切片转移至润滑轨道上方，并将切片旋转90度，使横切面可见。在用润滑剂覆盖滤纸边缘之前，先将滤膜压紧到盖玻片上。

将切片固定在塑料盖玻片上后，将其转移至33毫米的塑料培养皿中。用煤油解剖液浸没样本，并将每个培养皿置于持续充氧的避光盒中保存。用于膜片钳记录。

用aims培养基预处理灌流管，使管内所有气泡排出。使用玻璃电极拉制仪制备记录电极后，用灌注液填充电极尖端。随后，使用微量移液管填充器将移液管约三分之一处填充溶液，填充后，将每根移液管存放于湿润的移液管盒中。

接下来，开启用于膜片钳记录的设备，包括计算机、放大器、CCD相机以及在暗条件下工作的显微镜。借助红外成像仪将视网膜切片样本放置在显微镜载物台上。固定样本后，开始持续灌流。

将灌注温度设置为 33 至 37 摄氏度。使用 CCD 相机观察切片表面。聚焦于目标位置。

在目标细胞类型所在的位置，选择一个形态健康的细胞进行膜片钳记录。一旦确定了健康的细胞，将记录电极置于电极夹持器中，并将电极推进至脑片制备物。当电极接近脑片制备物时，用显微镜找到电极尖端。

在显微镜下观察到移液枪头后，将枪头向下移动至目标细胞。接着，设置放大器并在皮安放大器处调节移液枪头，每纳安培5伏。

施加约五毫伏、约10赫兹的持续电脉冲，并检测移液管电阻。对于大多数视网膜神经元而言，理想的电阻范围为5至12兆欧。

准备就绪后，使用吹嘴或注射器吹出内部溶液，直至移液管尖端到达目标细胞表面。当正压在细胞表面形成微小凹陷时，轻微推进移液管尖端并停止吹出。如果移液管电阻持续增加，保持位置不动并监测电阻，直至其超过1 GΩ。

如果阻抗未自发增加，则轻轻施加负压，直至形成吉欧封接。形成吉欧封接后，将钳制电位调整至负70毫伏，然后间歇施加负压，以破裂移液管尖端内部的细胞膜。当全细胞构型建立后，移液管阻抗通常介于500兆欧姆至1吉欧姆之间，且可观察到电容电流。

记录从负80到40毫伏的电流-电压关系。根据细胞类型的不同，会激活不同类型的电压门控通道。最后，记录光诱发的突触电流或电压。

在10倍镜下观察该切片制备，可见光感受器和节细胞均未从滤纸上脱落。当使用60倍物镜观察此制备时，各细胞层均清晰可辨。视网膜神经元在阶跃光照刺激下可诱发出光诱发的兴奋性突触后电位。

峰电位的幅度和衰减时间因细胞类型和亚型而异。在生理记录完成后，通过硫标记揭示了细胞类型及其形态学亚型。该技术为视网膜研究领域的科学家们研究自然视觉信号传递的功能以及突触机制的作用奠定了基础。