Name: 在鼠背耳蜗核的听觉通路的光遗传学刺激直接可视化 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 58 s
Description: 学习在小鼠背侧耳蜗核进行光遗传学刺激的外科手术方法。该方案通过颅骨切开术和小脑抽吸术实现直接可视化，支持病毒介导的基因转移和神经生理学研究，为听觉中枢系统的功能研究提供精确可靠的实验途径。

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基金支持：本工作由 Bertarelli 基金会资助（D.J.L）、MED-EL 资助（D.J.L）以及美国国立卫生研究院基金 DC01089（M.C.B.）支持。

注：所有实验操作均遵循马萨诸塞州眼耳医院和哈佛医学院动物护理与使用委员会的规定，该委员会遵循国家动物护理指南，包括《实验室动物人道护理与使用公共服务政策》、ILAR 指南以及《动物福利法》。&#160;下文列出的实验步骤详述了左侧耳蜗核（DCN）的暴露过程。进行可存活手术时，须使用无菌&#160;器械。
1. 初次开颅及背侧耳蜗核暴露
<ol>
	<li>麻醉
	<ol>
		<li>通过腹腔注射给予8–12周龄、体重18–24 g的小鼠赛拉嗪（20 mg/kg）和氯胺酮（100 mg/kg）进行麻醉。通过监测心率、呼吸频率以及脚趾夹捏回缩反射来确认麻醉效果。在麻醉期间，于眼睛上涂抹兽用眼膏以防止角膜干燥。当小鼠进入充分麻醉状态后，剃除覆盖头皮区域的毛发，以便无遮挡地暴露手术部位。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>手术体位固定
	<ol>
		<li>将小鼠稳妥地置于小型动物立体定位仪中，并用鼻夹固定。</li>
		<li>确保鼻夹松紧适度，既能保证小鼠呼吸通畅，又能完全固定头部。若头部固定不牢，在开颅手术过程中动物可能从头夹中脱落。</li>
		<li>以标准方式放置听觉脑干植入电极，&#160;以便监测心率。呼吸频率应通过直接观察进行监测。需注意，正常心率和呼吸频率会因小鼠年龄不同而有所差异。</li>
		<li>放置体温探针，并将小鼠置于恒温加热毯上以维持正常体温。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>头皮切口及颅骨顶间骨与枕骨的暴露
	<ol>
		<li>在显微镜下，沿中线自耳廓正中间开始做一条垂直皮肤切口，向后延伸至枕骨的尾侧部分。完成中线切口后，将皮肤向两侧牵开。观察覆盖在左侧颅骨后部的肌肉组织。</li>
		<li>使用手术刀或虹膜剪分离附着于左侧顶骨、顶间骨和枕骨表面的肌肉，将其去除。切割肌肉边缘时可能出现少量出血，可用棉签轻压10–15秒以减少出血。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>覆盖耳蜗核区域的开颅
	<ol>
		<li>辨认相关颅骨缝线，包括矢状缝和人字缝（图1，左图）。</li>
		<li>使用咬骨钳在人字缝后方约2 mm、中线左侧的顶间骨区域进行开颅。该区域正上方为耳蜗背核（DCN）。</li>
		<li>开颅后，可见一层覆盖小脑表面的薄层硬脑膜。使用手术刀片将其切除（图1，中图）。 
		注意：硬脑膜切除可能引起少量出血。此步骤旨在减少后续小脑吸除过程中产生的出血，避免血液积聚于脑干表面而影响对DCN的识别。&#160;小鼠总血容量约为1.5 ml，失血量不应超过&#62;15%。若出血量超过此限值，应给予&#160;液体补充治疗。&#160;</li>
		<li>使用棉签清除覆盖在小脑表面的凝血块。可选地，用牙科棉头向小脑表面轻轻滴加生理盐水以清除积血。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>小脑吸除
	<ol>
		<li>使用5 French吸引管，吸除覆盖在DCN上方的左侧小脑最外侧部分，直至DCN清晰可见（图1，右图）。大约去除左侧小脑的1/4至1/3。DCN附近的主要解剖标志是上半规管的壶腹。 
		注意：小脑吸除是本方案的关键步骤。为最大程度减少出血，应尽可能一次性完成吸除操作，避免多次反复吸引。为辅助操作，可将显微镜焦平面调节至预期的耳蜗核（CN）深度，该深度略深于小脑表面。将焦平面设定在CN水平有助于提高可视化效果并获得清晰图像。</li>
		<li>吸除后，可能出现进一步出血、脑脊液（CSF）积聚以及小脑组织对DCN的压迫。可迅速向颅骨缺损处注入0.5 cc无菌生理盐水，以防止血液凝固。&#160;随后可结合使用牙科棉头轻拭与吸引，清理出一条通路以便直接观察DCN。操作中切勿直接接触DCN表面。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 病毒介导的基因转移与手术恢复的压力显微注射法
<ol>
	<li>当 DCN 清除表面的血液和脑脊液并清晰可见后，使用 10 µl Hamilton 注射器在 2 分钟内向 DCN 进行压力微量注射。</li>
	<li>使用显微操作器将针头插入，直至针尖在 DCN 表面下不再可见。</li>
	<li>为获得最佳效果，建议使用 33 或 34 号针头（使用 34 号针头时需配用气密性注射器），并采用浅斜面（如 45°），以尽量减少钝性损伤，并将注射体积局限在 DCN 内；DCN 是一个较薄且表浅的脑干结构（&#60;300 µm 厚）。 
	注意：也可使用其他微量注射装置。理想情况下，注射装置应具备一定柔韧性，以便在需要时可轻微弯曲，直接靶向 DCN。此外，由于小鼠在操作过程中会因呼吸而轻微移动，装置应足够坚固，能够耐受轻微的位移。</li>
</ol>
3. 手术恢复
<ol>
	<li>注射后立即缝合皮肤，并按照标准恢复程序让小鼠恢复。残留的小脑组织和瘢痕组织将填充因小脑抽吸所形成的空腔。需持续监测动物，直至其意识充分恢复，能够维持胸卧位。同时监测心率、呼吸频率以及摄食能力。 
	注意：任何接受手术的动物，在完全恢复之前均不得放回与其他动物共用的笼具中。</li>
	<li>若小鼠在术后开始呈环形行走（&#60;5% 的病例），通常发生在皮肤切口闭合后 2–4 小时&#160;，应立即处死小鼠，因其可能难以正常进食。该副作用很可能源于小脑的抽吸损伤。&#160;动物术后应持续监测疼痛情况，并根据机构标准给予适当的麻醉性镇痛药物以确保动物福利。如出现感染迹象，可能需要使用抗生素。</li>
</ol>
4. 二次开颅术与耳蜗神经核暴露
<ol>
	<li>经过 2-4 周的愈合及病毒介导的基因转导孵育后，对先前注射过的小鼠重新进行麻醉，并重复步骤 1.1–1.5。最佳孵育时间因所转移基因的类型而异。</li>
	<li>使用镊子、手术刀和咬骨钳组合去除颅骨开窗部位的瘢痕组织。</li>
	<li>在观察到颅骨开窗后，辨认出覆盖于小脑下核（DCN）上方的残留小脑组织与瘢痕组织。使用 5 French 吸引器吸除覆盖的小脑/瘢痕组织（方法类似于之前的小脑吸除操作）。</li>
	<li>吸除后，可能会出现进一步出血、脑脊液积聚以及残留的小脑组织碎片。迅速向颅骨开窗内注入生理盐水，以防止血液凝固。结合轻柔的牙科尖头棉签擦拭和吸引操作，清除视野路径，以便直接观察 DCN。</li>
	<li>观察 DCN 表面。由于此时 DCN 已暴露，可开展基于光遗传学的生理学实验。引入光刺激（例如通过光纤，图 2），以启动光遗传学实验。</li>
</ol>
5. 组织学
<ol>
	<li>实验结束后，使用过量的氯胺酮处死小鼠。先用生理盐水灌注小鼠，随后用4%多聚甲醛灌注。</li>
	<li>从颅骨中取出脑干，并在固定液中后固定2小时。将脑干置于30%蔗糖溶液中进行冷冻保护，持续24–48小时。使用标准冷冻切片机将脑干切成60 µm的切片。</li>
</ol>

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<li>Ayling, O., Harrison, T., Boyd, J., Foroshkov, A., Murphy, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+light-based+mapping+of+motor+cortex+by+photoactivation+of+channelrhodopsin-2+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Automated light-based mapping of motor cortex by photoactivation of channelrhodopsin-2 transgenic mice.</a> Nat Methods. 6 (3), 219-224 (2009).</li>
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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文描述了在小鼠模型中直接可视化延髓耳蜗核（DCN）以操控中枢听觉系统的技术。这种直接可视化方法相较于主要的替代方法——立体定位法，具有显著优势。首先，直接可视化耳蜗核能够立即确认脑干靶点位置，而立体定位法则无法提供直接的视觉确认。在需要较长孵育时间的实验中（例如病毒介导的基因转移），如果注射“偏离”目标区域，则可能导致感染效率低下。此外，直接可视化方法适用于较宽年龄范围的动物。类似外科手术方法也可应用于其他动物模型（如大鼠和豚鼠）的存活实验中。
本方案中有几个关键步骤。首先，必须将小鼠正确固定在立体定位仪中。头部的任何移动都会导致开颅困难。其次，开颅位置至关重要。如果开颅位置不准确，将难以甚至无法在吸除小脑后观察到小脑深部核团（DCN）。最后，本方案最关键的步骤是对小脑进行部分定向吸除。吸除小脑有两种技术方法。第一种方法是在吸除过程中持续对小脑施加负压，将其自脑干上方轻轻提起。在此过程中，小脑深部核团可能部分显露于小脑下方，需持续吸引直至核团完全暴露且小脑组织被彻底清除。第二种方法是分层、多次进行小脑的部分吸除，直至小脑深部核团得以显露。若核团仍无法完全看清，可使用牙科尖头镊轻轻...

利用病毒介导的基因转移来逆转听力损失的研究，主要集中于外周听觉系统。1 针对耳蜗，研究人员已探索了多种递送途径，包括渗透压微型泵灌注2、用载体-转基因复合物浸泡的明胶海绵（Gelfoam®）2 或明胶海绵3、直接显微注射4；多种基因转移载体，包括腺相关病毒载体5,6、慢病毒载体7 和阳离子脂质体2；以及基因转移载体在靶组织以外的扩散情况2。最近，已在小鼠耳蜗中引入腺相关病毒（AAV）-1，以治疗因囊泡型谷氨酸转运蛋白-3 缺失所致的耳聋。8 此外，光遗传学在外周听觉系统中的应用也已有近期报道。9
然而，目前仅有少数研究探讨了向中枢听觉系统进行基因转移的方法。脑干的耳蜗背核（DCN）包含听觉通路中的二级神经元。尽管耳蜗核（CN）内的基因转移技术可用于多种研究，但将视蛋白（即光敏感蛋白）基因转移到DCN也可用于实现基于光遗传学的实验技术。通过病毒介导的基因转移将一种视蛋白（如通道视紫红质-2（ChR2））递送至DCN后，DCN的神经元将对光刺激产生敏感性。此前，光遗传学基因转移已在多个脑干区域中尝试应用，包括大鼠的后桥顶核、小鼠的蓝斑核、猴子的上丘以及小鼠的腹侧被盖区。10-14
近期，研究人员已开始探索在耳蜗背核（DCN）中应用光遗传学技术的可能性15,16。由于耳蜗背核（DCN）是人类听觉脑干植入装置的植入部位，因此成为听觉神经假体转化研究中一个极具吸引力的听觉系统研究区域。然而，由于DCN所处位置较深，手术暴露具有较大挑战性。本文所述技术提供了一种经后颅窝入路充分暴露DCN的操作方案，以支持在小鼠模型中进行病毒载体基因转导及基于光遗传学的实验研究。既往研究曾采用立体定位微量注射法将通道视紫红质-2（channelrhodopsin-2）注入DCN16。然而，对于DCN这样位于脑干深处且体积较小的核团，与直接可视化引导下的注射相比，立体定位注射的准确性可能较低。另一种有吸引力的选择是使用在耳蜗核（CN）中特异性表达组织蛋白的转基因小鼠模型，这可避免基因转导的需要。本研究所提供的DCN暴露方案同样适用于转基因小鼠，因为对DCN进行光学刺激仍需直接暴露该核团。本DCN手术暴露技术借鉴了此前在小鼠和大鼠模型中用于听神经和耳蜗核电生理记录的相关操作方案15,17-20。
本方案的总体目标是直接暴露小脑神经核（CN），以实现基因转移技术的应用。更具体而言，该方法适用于急性手术和存活手术，且可在同一动物体内重复进行，以便后续开展神经生理学检测。小脑神经核（DCN）直接暴露方案对于在脑干其他核团中开展基于光遗传学及病毒介导的基因转移实验具有重要借鉴意义。

<table><tbody><tr><td>立体定位仪</td><td>Stoelting</td><td>51500</td><td></td></tr><tr><td>恒温毯</td><td>Harvard</td><td>507214</td><td></td></tr><tr><td>手术刀片 #11</td><td>Fine Surgical Tools</td><td>10011-00</td><td></td></tr><tr><td>虹膜剪</td><td>Fine Surgical Tools</td><td>14084-08</td><td></td></tr><tr><td>5 法式吸引管</td><td>Symmetry Surgical</td><td>2777914</td><td></td></tr><tr><td>牙科钻头</td><td>Henry Schein</td><td>100-8170</td><td></td></tr><tr><td>骨钳</td><td>Fine Surgical Tools</td><td>16020-14</td><td></td></tr><tr><td>10 &amp;micro;l Hamilton 注射器</td><td>Hamilton&amp;nbsp;</td><td>7633-01</td><td></td></tr><tr><td>34 号针头</td><td>Hamilton&amp;nbsp;</td><td>207434</td><td></td></tr><tr><td>咬骨钳</td><td>Fine Surgical Tools</td><td>16021-14</td><td></td></tr></tbody></table>

直接可视化小鼠背侧耳蜗核以实现听觉通路的光遗传学刺激

Direct Visualization of the Murine Dorsal Cochlear Nucleus for Optogenetic Stimulation of the Auditory Pathway

关于利用病毒介导的基因转移来阻止或逆转听力损失的研究，主要集中于外周听觉系统。针对中枢听觉系统进行基因转移的研究较少。位于脑干的耳蜗腹后核（DCN）包含听觉通路中的二级神经元，是实施基因转移的潜在靶点。本方案展示了一种通过颅后窝入路直接且充分暴露小鼠DCN的技术。该方法适用于急性实验或存活手术。在直接观察到DCN后，可开展多种实验，包括将视蛋白注入耳蜗核，并通过连接蓝光激光器的光纤进行后续光刺激。&#160;其他神经生理学实验，例如电刺激和神经示踪剂注射，也可行之有效。&#160;该方法所能实现的视野暴露程度与刺激持续时间，使其适用于广泛的实验研究。

小脑部分抽吸法显示可进入耳蜗核
去除覆盖颅骨的皮肤和肌肉后，颅骨表面的解剖标志（如冠状缝和人字缝）可显示开颅部位的大致位置。使用咬骨钳进行开颅后，可观察到小脑。小心吸除小脑的一小部分后，即可观察到脑神经（CN），随后可对其进行注射（图1）。
利用蓝光激光刺激进行耳蜗核次级暴露
在初次暴露DCN、进行视蛋白基因转导并经过孵育期后，可使用蓝光激光刺激DCN。暴露DCN表面以进行光刺激的二次开颅手术，其技术方法与初次开颅手术类似（补充视频1）。DCN是一种厚度小于300 µm的表层结构。实验用小鼠标本在术后可保持活性长达6小时。
<img alt="手术过程中颅骨切开及背侧耳蜗核暴露的步骤示意图，解剖学研究。" fo:content-width="7in" src="/files...

本实验方案的目的是概述一种手术方法，以在小鼠模型中直接进入背侧耳蜗核。

利用病毒介导的基因转移技术来阻止或逆转听力损失的研究，主要局限于外周听觉系统。

本实验的总体目标是通过手术暴露小鼠模型的耳蜗核，以开展基于光遗传学的实验研究。首先，需对小鼠进行开颅术前准备，并将覆盖在颅顶外侧的皮肤、软组织和肌肉向侧方牵开。第二步，在左侧顶间骨进行开颅，位置约为矢状缝后方（lambda缝）前约2毫米处。该区域覆盖耳蜗核。接下来，使用五法式吸引管吸除覆盖在DCN上方的左侧小脑最外侧部分。结果显示DCN视野清晰无遮挡。与立体定向引导等辅助方法相比，该技术的主要优势在于能够直接可视化耳蜗核，并将神经刺激器（如光源或电极阵列）放置在脑干表面。该方法有助于我们解答光遗传学和听觉研究领域中的关键问题。通过基因转移，无需假体即可实现以足够的空间和时间分辨率用光刺激听觉脑干。通过腹腔注射氯胺酮和赛拉嗪麻醉小鼠后，检查其脚趾夹捏回缩反射，并监测心率和呼吸频率以确认麻醉效果。随后，在双眼涂抹兽医专用眼膏，防止角膜干燥。接着，剃除覆盖在头皮区域的毛发，以充分暴露手术部位，确保无遮挡。随后，将小鼠置于小型动物立体定位仪中。调整鼻夹，使其松紧适度，既能保证小鼠呼吸顺畅，又能完全固定头部。在显微镜下，从耳廓正中间的中线处开始，沿皮肤做一垂直切口，一直延伸至枕骨的颅底部分。然后将皮肤向侧方牵开。使用手术刀或虹膜剪去除覆盖在颅骨左侧顶骨、间顶骨和枕骨上的肌肉组织。同时，用棉签轻轻按压10至15秒，以尽量减少出血。接下来，确定矢状缝和人字缝的位置。使用一对Ron宝石刀，在人字缝线旁侧约两毫米处的左侧顶骨上进行开颅手术。该区域位于开颅术后背侧小脑核（DCN）的上方。应仔细观察覆盖在小脑表面的一层薄脑膜，并使用手术刀片小心将其去除。使用棉签清除凝固的血液，或轻轻将生理盐水滴在小脑表面以冲走血液。然后使用一根5 French的吸引管，吸除左侧小脑最外侧覆盖耳蜗核（DCN）的区域，以协助暴露。在吸引过程中，将显微镜的焦平面调节至耳蜗核预期深度的位置，以改善视野并确保图像清晰。切除左侧小脑约四分之一至三分之一的部分。与耳蜗背核（DCN）相邻的主要解剖标志是上半规管的弓形凸起（AM）。在吸除操作后，若出现进一步出血、脑脊液积聚以及小脑对DCN的压迫，应迅速将生理盐水注入开颅孔，以防止血液凝固。采用牙科棉签轻柔擦拭与吸引相结合的方式，清除路径上的阻碍，以便直接观察DCN。当DCN清晰可见且无血液和脑脊液覆盖时，使用5微升气密型Hamilton注射器向其内进行微量压力注射。采用34号带有浅斜面的针头，以尽量减少钝性损伤，并将注射体积局限在DCN内。然后通过显微操作仪缓慢插入针头，直至针尖在DCN表面下不可见为止。开始注射1.5 µL的载体。注射完成后，缓慢撤出针头，随后缝合皮肤，并按照标准恢复程序让小鼠恢复。在愈合及病毒介导的基因转移孵育2至4周后，重新麻醉已注射载体的小鼠，然后清除颅骨开窗部位的瘢痕组织。随后，辨认出覆盖在小脑深部核团（DCN）上方的残余小脑组织与瘢痕组织组合。使用五法式吸管吸除覆盖的残余小脑及瘢痕组织。吸除后。迅速将生理盐水注入颅骨开窗处。为防止血液凝结，使用轻柔的牙科尖头棉签轻拭并结合吸引清除视野，以便直接观察DCN。此时DCN已可进行基于光遗传学的生理学实验，图中显示将激光光纤直接放置于DCN表面，可在感染了视蛋白的DCN表面施加蓝光脉冲序列，从而诱发光驱动的听觉脑干反应。使用显微操作器，将连接至蓝光激光器的光纤直接放置在耳蜗核表面并开启激光。在此过程中，我们可在耳蜗核表面观察到脉冲式蓝光刺激。完成该操作后，可进一步实施其他方法，例如对核团进行电刺激，从而能够直接比较声学诱发出的神经反应、电刺激诱发出的神经反应以及光刺激诱发出的神经反应。观看本视频后，您应能够充分了解如何准备并实施开颅术和小脑吸除术，最终实现对耳蜗核的直接观察和暴露。

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在鼠背耳蜗核的听觉通路的光遗传学刺激直接可视化

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选择性病毒感染转导成年出生的嗅觉神经元以实现长期研究 体内 光遗传学刺激

来源：Kozin, E. D., 等．用于听觉通路光遗传学刺激的小鼠背侧耳蜗核直接可视化．J. Vis. Exp.

利用病毒介导的基因转移技术向小鼠背侧耳蜗核导入基因以实现光诱导听觉刺激

本视频展示了在实验室环境中制备楔形脑片的过程。使用振动切片机，从小鼠脑组织中制备出不同厚度的楔形切片。该切片在一端较厚，包含听觉神经根，而与听觉相关的神经元则位于较薄的一端。...

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本视频演示了一种在小鼠脑片切片中刺激听觉神经根并记录内侧耳蜗橄榄核神经元突触后电流的实验方案。...

小鼠脑楔形切片中听神经根刺激与突触后电流记录

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光遗传学鉴定皮层抑制性中间神经元的体内单细胞记录指南

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体外楔形脑片制备以模拟体内神经元环路连接

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在体 无线光遗传学控制精细运动行为

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通过整合层状多通道电极、光遗传学与微阵列皮层电图在啮齿类动物中进行皮层处理的多尺度研究

学习在小鼠背侧耳蜗核进行光遗传学刺激的外科手术方法。该方案通过颅骨切开术和小脑抽吸术实现直接可视化，支持病毒介导的基因转移和神经生理学研究，为听觉中枢系统的功能研究提供精确可靠的实验途径。

直接可视化小鼠背侧耳蜗核以实现听觉通路的光遗传学刺激

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