直接可视化小鼠背侧耳蜗核以实现听觉通路的光遗传学刺激

本实验的总体目标是通过手术暴露小鼠模型的耳蜗核，以开展基于光遗传学的实验研究。首先，需对小鼠进行开颅术前准备，并将覆盖在头颅侧面的皮肤、软组织和肌肉向外侧牵开。第二步，在左侧顶间骨进行开颅，位置大约位于矢状缝后方两毫米处。

该区域覆盖耳蜗核。接下来，使用五法式吸引管吸除覆盖在DCN上方的左侧小脑最外侧部分。结果显示DCN视野清晰无遮挡。

与立体定向引导等辅助方法相比，该技术的主要优势在于能够直接可视化耳蜗核，并可将神经刺激器（如光源或电极阵列）放置于脑干表面。该方法有助于我们解答光遗传学与听觉研究领域的关键科学问题。无需假体装置，基因转导即可实现以足够空间与时间分辨率的光刺激听觉脑干。

通过腹腔注射氯胺酮和赛拉嗪麻醉小鼠后，检查其脚趾夹捏回缩反射，并监测心率和呼吸频率以确认麻醉效果。然后在双眼涂抹兽医用眼膏，防止角膜干燥。接着，剃除覆盖在头皮上的毛发，以充分暴露手术区域。

此后，将小鼠置于小型动物立体定位仪中。调整鼻夹，使其松紧适度，既能保证小鼠呼吸顺畅，又能完全固定小鼠头部。在显微镜下，从耳廓之间中线处开始，沿皮肤做一垂直切口，并延伸至枕骨结节部位。

然后将皮肤向侧方牵开。使用手术刀或虹膜剪去除覆盖在颅骨左侧顶骨、间顶骨和枕骨上的肌肉组织。同时，用棉签轻轻按压10至15秒，以尽量减少出血。

接下来，确定矢状缝和人字缝的位置。使用一对Ron宝石刀，在人字缝线旁侧约两毫米处的左侧顶骨上进行开颅。

该区域位于开颅术后耳蜗核（DCN）的上方。应仔细观察覆盖在小脑表面的一层薄薄的硬脑膜，并使用手术刀片小心将其去除。用棉签清除凝固的血液，或轻轻滴加生理盐水冲洗小脑表面以清除血液。

然后使用一根5 French的吸引管，吸除左侧小脑最外侧覆盖耳蜗核（DCN）的区域，以协助操作。在吸引过程中，将显微镜的焦平面调节至耳蜗核预期深度，以改善视野并确保图像清晰。切除左侧小脑约四分之一至三分之一的部分。

与耳蜗背核（DCN）相邻的主要解剖标志是上半规管的弓形凸起（AM）。在吸除操作后，若出现进一步出血、脑脊液积聚以及小脑对DCN的压迫，应迅速将生理盐水注入开颅孔，以防止血液凝固。采用牙科棉签轻柔擦拭与吸引相结合的方式，清除路径上的阻碍，以便直接观察DCN。

当DCN清晰可见且无血液和脑脊液覆盖时，使用5微升气密型Hamilton注射器向其内进行微量压力注射。采用34号带有浅斜面的针头，以尽量减少钝性损伤，并将注射体积局限在DCN内。然后通过显微操作仪缓慢插入针头，直至针尖在DCN表面下不可见为止。

开始注射1.5 µL的载体。注射完成后，缓慢撤出针头，随后缝合皮肤，并按照标准恢复程序让小鼠恢复。在愈合及病毒介导的基因转导孵育2至4周后，重新麻醉已注射载体的小鼠，然后清除颅骨开孔部位上方的瘢痕组织。

随后，辨认出覆盖在小脑深部核团（DCN）上方的残余小脑组织与瘢痕组织组合。使用五法式吸引器吸除覆盖的残余小脑及瘢痕组织。完成吸引后。

迅速将生理盐水注入颅骨开窗区域。为防止血液凝结，使用轻柔的牙科尖头棉签轻拭并结合吸引清除术野，以实现对小脑下核（DCN）的直接可视化。现在可对DCN进行基于光遗传学的生理学实验，图中显示将激光光纤直接放置在DCN表面，从而实现对表达光敏蛋白的DCN神经元进行光学刺激。在感染了光敏蛋白的DCN表面给予蓝光脉冲序列，可诱发光驱动的听觉脑干反应。

使用显微操作器，将连接至蓝光激光器的光纤直接放置在耳蜗核表面并开启。在此我们可以观察到耳蜗核表面的脉冲蓝光刺激。完成该操作后，可进一步实施其他方法，例如对核团进行电刺激，从而能够直接比较声刺激诱发的神经反应、电刺激诱发的神经反应以及光刺激诱发的神经反应。

观看本视频后，您应能够充分了解如何准备并实施开颅术及小脑吸除术，最终实现对耳蜗核的直接观察与暴露。