Name: 蛋白质的共表达了多方面的好处大肠杆菌 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 48 s
Description: 了解在大肠杆菌中蛋白质共表达的方法，用于研究蛋白质复合物的体内组装。该方法利用相容质粒克服游离亚基溶解度差的问题，高效生产可溶性蛋白复合物。

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特此感谢施普林格（Springer）和爱思唯尔（Elsevier）授予重印图示的许可。

1. 分离 E. coli 共转化子
<ol>
	<li>准备待转化的合适 E. coli 菌株的感受态细胞。取单个菌落接种于 1 ml LB 培养基（胰蛋白胨、酵母提取物、NaCl 浓度分别为 10、5 和 10 g/L）中，在 37 °C、180 rpm 振荡条件下培养。将预培养物按 1:500 比例稀释至 25 ml 新鲜 LB 培养基中，并在 37 °C 下继续培养。</li>
	<li>当菌液处于对数生长期（OD 值为 0.6）时，于 5,000 × g 离心 20 分钟，弃上清，将菌体沉淀用相当于原培养体积一半的冰预冷的 10%（v/v）无菌甘油-水溶液重悬。重复此步骤 4 次，每次重悬体积减半。最后将菌体沉淀用甘油-水溶液重悬，并将菌悬液分装为每份 50 μl。于 -80 °C 保存，可保存长达 6 个月。</li>
	<li>将目标质粒溶解于含 0.5 mM EDTA 的无菌水中。在冰上融化一份电转化感受态细胞，加入适量（2.5–5 ng）的载体质粒。将混合液转移至适合电穿孔的 0.1 cm 比色杯中，施加 1.8 kV 电击。</li>
	<li>立即将电穿孔后的细胞转移至 1 ml SOC 培养基（LB 培养基添加 0.2% w/v 葡萄糖、10 mM MgCl2、2.5 mM KCl）中，在振荡条件下培养 1 小时，然后取 100 μl 菌液涂布于含有适当抗生素的 LB 琼脂平板上。于 37 °C 过夜培养。</li>
	<li>通过在平板上划线分离单菌落，纯化转化子。</li>
	<li>制备初级转化子的感受态细胞，并重复步骤 1.1 至 1.5，以进行后续质粒的转化。</li>
	<li>制备共转化子的甘油保存菌种。挑取单菌落接种于含适当抗生素的 LB 培养基中，37 °C 振荡培养，当菌液达到对数生长期（OD 值为 0.6）时，于 5,000 × g 离心 20 分钟。将菌体沉淀重悬于含 15%（v/v）甘油的 LB-抗生素培养基中，分装后于 –80 °C 保存。</li>
</ol>
2. α 和 ε 亚基的共表达 E. coli DNA聚合酶III
<ol>
	<li>用无菌接种环转移少量相应的菌株甘油菌种（例如， TOP10/pGOOD-ε243 和 TOP10/pGOOD-ε243-θ/pBADα1160，参见 图1) 转移至含有LB培养基和抗生素的培养皿中。让细胞悬液在培养皿上干燥后，划线接种细胞液滴。于37 °C过夜培养。</li>
	<li>使用无菌牙签将单个菌落转移至1 ml含抗生素的LB培养基中，在37 °C下培养8小时。将预培养物按1:500比例接种于新鲜培养基中，在30 °C下培养15小时。</li>
	<li>加入IPTG、阿拉伯糖，或同时加入阿拉伯糖和IPTG，每种终浓度均为1 mM。30 °C孵育2.5小时。收集细胞，将菌体沉淀储存在-20 °C。</li>
	<li>将菌体沉淀置于冰上解冻，并用裂解缓冲液（50 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA, 2.5 mM 二硫苏糖醇, 1 mM 苯甲基磺酰氟 (PMSF)，pH 8）重悬。使用预冷的玻璃匀浆器轻轻匀浆细胞悬液。</li>
	<li>以15 W超声15秒，随后冷却15秒（重复4个循环）。</li>
	<li>在4 °C条件下，以10,000 × g离心总蛋白提取物20分钟，以收集可溶性组分。</li>
	<li>使用SDS-PAGE（12.5%丙烯酰胺）分析各可溶性蛋白提取物的等分试样。为此，将每种可溶性蛋白提取物20 μl转移至含有60 μl H2加入20 μl上样缓冲液（250 mM Tris-HCl pH 6.8，10 mM β-巯基乙醇，10% (w/v) SDS，50% (v/v) 甘油，0.25% (w/v) 溴酚蓝），沸水浴中煮5 min。每份样品上样18 μl，在140 V电压下电泳约1.5小时。</li>
</ol>
3. Deinococcus radiodurans DNA聚合酶III的α亚基与E. coli DNA聚合酶III的ε亚基的共表达
<ol>
	<li>准备一预培养的 E. coli 菌株 TOP10/pBAD-α博士/pGOOD-ε243 接种于 1 ml LB-氨苄青霉素-四环素培养基中，37 °C 培养 8 小时。按 1:1,000 比例转接至新鲜培养基，37 °C 过夜培养。</li>
	<li>将菌液按1:100比例稀释至200 ml新鲜培养基中，37 °C孵育3小时，然后加入终浓度各为1 mM的阿拉伯糖和IPTG诱导表达3小时。收集菌体，将菌体沉淀储存于-20 °C。</li>
	<li>将沉淀重悬于50 mM Tris-HCl pH 8、150 mM NaCl、1 mM EDTA、1 mM PMSF中。按照2.4和2.5步骤所述进行细胞匀浆和裂解。</li>
	<li>立即在10,000 × g离心细胞裂解液20分钟。弃去沉淀。使用配有三层滤纸的布氏漏斗过滤上清液，施加轻柔的真空负压。为避免产生过多泡沫，过滤期间将真空抽滤瓶置于冰上。</li>
	<li>根据 Bradford 法测定蛋白质浓度14.</li>
</ol>
4. 凝胶过滤层析
<ol>
	<li>使用50 mM Tris-HCl、150 mM NaCl、1 mM EDTA（pH 8.0）缓冲液平衡水套式16×70（200）凝胶过滤柱。将可溶性蛋白提取物上样至柱中。为获得最佳分辨率，使用1 ml的上样环。以0.6 ml/min的流速进行层析，全程保持柱温为4 °C。</li>
	<li>收集每管0.9 ml的洗脱组分，并通过SDS-PAGE进行分析。取每个相关组分20 μl转移至含有60 μl H2O和20 μl上样缓冲液（250 mM Tris-HCl pH 6.8、10 mM β-巯基乙醇、10% (w/v) SDS、50% (v/v)甘油、0.25% (w/v)溴酚蓝）的Eppendorf管中，煮沸5分钟。每样取18 μl上样，以140 V电泳约1.5小时。</li>
	<li>在96孔微孔板中测定各组分的3’-5’外切核酸酶活性和DNA聚合酶活性。使用胸苷5'-单磷酸对硝基苯酯（pNP-TMP）作为底物测定外切核酸酶活性15。采用PPX（焦磷酸酶、嘌呤核苷磷酸化酶、黄嘌呤氧化酶）酶偶联法16并以2-(4-碘苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-苯基-2H-四氮唑氯化物（INT）作为电子受体来估算DNA聚合酶活性16。</li>
</ol>
5. 共表达野生型ε亚基群体的突变分析 E. coli DNA聚合酶III及其诱变性εD12A变异体
<ol>
	<li>将含有 pBAD-ε 和 pGOOD1-εD12A11 质粒的单个 E. coli TOP10 菌落转移至 1 ml LB-抗生素培养基中，37 °C 过夜培养。</li>
	<li>将预培养物按 1:250 比例稀释至 3 个含有新鲜培养基（10 ml）的三角瓶中，分别加入适当的诱导剂（阿拉伯糖、IPTG，或阿拉伯糖与 IPTG 各 1 mM），37 °C 培养 8 小时。同时平行制备未诱导的对照培养物。</li>
	<li>取 1 ml 培养物作为等分试样，然后将其按 1:500 比例稀释至含有新鲜培养基（10 ml）的新三角瓶中，根据需要添加相应的诱导剂，37 °C 过夜培养。</li>
	<li>重复步骤 5.2 和 5.3，并收集 1 ml 等分试样。</li>
	<li>测定各培养物中发生的细胞分裂代数。将接种物和培养物进行适当系列稀释后，各取 100 μl 涂布于 LB 平板，37 °C 过夜培养。计数 LB 平板上的菌落数，计算接种物中细胞数的对数值（logI）以及培养结束时培养物中细胞数的对数值（logC）。使用公式：(logC– logI)/0.301 计算分裂代数。</li>
	<li>在 5,000 × g 条件下离心 20 分钟，将菌体沉淀重悬于 1 ml 50 mM Tris-HCl（pH 7.6）、50 mM NaCl 缓冲液中。为通透细胞，加入 2–3 滴氯仿并涡旋振荡 20 秒。</li>
	<li>使用 p-硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷（PNPGluc）作为底物，在 96 孔微孔板中测定各样品的 β-葡萄糖苷酶活性。向每孔加入 100 µl 通透化细胞和 100 µl 底物（H2O 中 16 mg/ml 的储备液），注意避免产生气泡。使用酶标仪配合适当的滤光片，在 420 nm 处测定吸光度。</li>
</ol>

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<li>Ozawa, K., Jergic, S., Park, A. Y., Dixon, N. E., Otting, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+proofreading+exonuclease+subunit+%CE%B5+of+Escherichia+coli+DNA+polymerase+III+is+tethered+to+the+polymerase+subunit+%CE%B1+via+a+flexible+linker%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The proofreading exonuclease subunit ε of Escherichia coli DNA polymerase III is tethered to the polymerase subunit α via a flexible linker.</a> Nucleic Acids Res. 36 (15), 5074-5082 (2008).</li>
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</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

蛋白质可以具有内在无序性，其三级结构不局限于有限数量的构象25这些无序蛋白通常容易发生聚集25，其分离与表征可能是一项具有挑战性的任务。ε亚基 E. coli DNA聚合酶III具有两个不同的结构域26,27即：i）N端结构域，具有3’-5’外切酶活性，并能够结合θ亚基；ii）C端结构域，负责与α（聚合酶）亚基结合。已知ε亚基的C端结构域会导致该蛋白溶解度较差，易于发生聚集。事实上，已有研究证明，缺失C端结构域的截短形式ε-186具有可溶性，且可实现高产量纯化17然而，当需要对ε与α之间的相互作用进行定量研究时（例如， 以确定 KD αε复合物）的纯化需要获得全长的ε蛋白，这意味着生化操作上的困难。在此背景下，蛋白质共表达可提供ε与α结合能力的定性评估。我们已证明，可获得大量αεθ复合物 体内 通过共表达（图1），从而绕过ε亚基溶解度差的问题。值得注意的是，已有文献报道过表达的αεθ复合物的纯化方法28,29共表达策略也...

过表达技术的引入极大地推动了低拷贝数酶的生化研究以及药理活性蛋白（例如，&#160;胰岛素）的工业生产。自这些技术问世以来，人们在提高重组蛋白的产量和质量方面取得了显著进展。此外，多年来已开发出原核生物1,2和真核生物3的过表达系统，为蛋白质生物技术中的“主力”——Escherichia coli（大肠杆菌）——提供了有用的替代方案。特别是，除E. coli以外的表达平台的出现，使得能够生产具有翻译后修饰的重组肽或蛋白质。然而需要指出的是，E. coli目前仍然是重组蛋白生产的首选生物体。这主要归因于以下几个因素：i）存在大量适用于E. coli的过表达系统（表达载体和菌株）1,2；ii）E. coli在多种丰富培养基和合成培养基中具有较短的世代时间以及较高的生物量产率；iii）该微生物在生化和遗传水平上均易于操作；iv）已分离出能够表达毒性蛋白的菌株4；v）已构建出在群体水平上具有均一诱导特性的菌株5,6。此外，最近的研究表明，可设计并构建适用于在E. coli中生产翻译后修饰蛋白的表达系统2。
目前，蛋白质过表达主要用于获取单体或同源寡聚蛋白质，其超量合成可通过将单个基因克隆至合适的质粒中实现。然而，近期研究开始关注构建 E. coli 蛋白质共表达系统，挑战了生产， 体内异源寡聚复合物2有趣的是，早期的蛋白质共表达实验研究了蓝细菌核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶大亚基与小亚基的跨物种组装7,8，以及HIV-1逆转录酶截短型与全长型形式的关联9这些开创性研究证明，蛋白共表达是传统方法的一种强大替代策略。 体外 重组。此外，蛋白质共表达在 大肠杆菌 用于产生带有翻译后修饰的不同蛋白质2以获得含有非天然氨基酸的蛋白质2，并提高过表达膜蛋白的产量2此外，蛋白质共表达作为赋予 E. coli 蛋白质分泌能力正处于积极研究之中2.
蛋白质共表达的两种主要策略 E. coli 可以采用以下两种策略：i）使用单个质粒承载需过表达的不同基因；ii）在单个细胞中使用多个质粒共表达目标蛋白。在第一种情况下，质粒的选择标准与传统单蛋白过表达实验无异，尽管已有专门构建的含有串联启动子/操纵元件的质粒用于共表达10因此，第一种方法相当简单。然而，需要指出的是，利用单个质粒共表达不同蛋白质存在两个主要困难：i）随着所携带基因数量的增加，载体的分子量增大，从而限制了可共表达的蛋白质数量；ii）当多个基因在单一启动子控制下被克隆时，转录极性可能导致远离启动子的基因表达水平降低。在单个细胞中使用双质粒或多质粒系统可缓解这些问题。 E. coli 细胞必须实现所选载体之间的相容性，因此对可用的质粒组合施加了限制。然而，这种第二种共表达策略具有限制载体分子质量并减少极性的优点。我们近期构建了一种蛋白共表达系统，旨在促进基因在共表达质粒之间的穿梭11特别是，我们构建了pGOOD载体系列，其相关特征包括：i）含有p15A复制起点，使pGOOD质粒与含有ColE1复制起点的商用载体具有兼容性例如， pBAD 系列12）；ii) 四环素抗性盒；iii) 存在 lac-衍生的调控元件， 即， 启动子-操纵子（O1）耦合器和 lacIq 基因。通过使用合适的pBAD-pGOOD组合，我们能够过表达其催化核心 E. coli 由三种不同亚基组成的DNA聚合酶III 即， α（5’-3’聚合酶）、ε（3’-5’外切核酸酶）和θ（稳定ε的亚基）13特别是，我们证明了αεθ复合物的共表达严格依赖于向其中添加 E. coli IPTG和阿拉伯糖的培养基，分别诱导来自pGOOD和pBAD的过表达（图1A).
在本报告中，我们阐述了如何通过蛋白共表达有效解决蛋白复合物亚基溶解度差的问题。此外，我们还展示了如何在 体内 可以进行蛋白质互补试验，最后我们报道了利用蛋白质共表达来调节突变频率的方法 E. coli为此，我们使用了适用于说明每种案例研究相关示例的 pGOOD-pBAD 组合。

<table><tbody><tr><td>琼脂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1296</td><td></td></tr><tr><td>氨苄青霉素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9518</td><td></td></tr><tr><td>氯仿</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>288306</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>EDS</td><td></td></tr><tr><td>甘油</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>INT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I8377</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I5502</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>L-阿拉伯糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3256</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2670</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>31434</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7626</td><td></td></tr><tr><td>PNP-葡萄糖苷</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N7006</td><td></td></tr><tr><td>pNP-TMP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T0251</td><td></td></tr><tr><td>四环素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>87128</td><td></td></tr><tr><td>Trizma 碱&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白胨</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>95039</td><td></td></tr><tr><td>酵母提取物</td><td>Fluka</td><td>70161</td><td></td></tr><tr><td>30% 丙烯酰胺溶液</td><td>BioRad</td><td>161-0158</td><td>用于凝胶电泳</td></tr><tr><td>过硫酸铵</td><td>BioRad</td><td>161-0700</td><td>用于凝胶电泳</td></tr><tr><td>甘氨酸</td><td>BioRad</td><td>161-0718</td><td>用于凝胶电泳</td></tr><tr><td>SDS</td><td>BioRad</td><td>161-0302</td><td>用于凝胶电泳</td></tr><tr><td>TEMED</td><td>BioRad</td><td>161-0800</td><td>用于凝胶电泳</td></tr><tr><td>Tris</td><td>BioRad</td><td>161-0719</td><td>用于凝胶电泳</td></tr><tr><td>0.1 cm 比色皿</td><td>BioRad</td><td>1652089</td><td>用于电穿孔</td></tr><tr><td>5415R 离心机</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Allegra 21R 离心机</td><td>Beckman</td><td></td><td></td></tr><tr><td>层析装置 GradiFrac</td><td>Pharmacia Biotech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gene Pulser II 电穿孔仪</td><td>BioRad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microplate Reader 550</td><td>Biorad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MiniProtean 3 电泳槽</td><td>BioRad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>电源</td><td>BioRad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>超声波破碎仪 3000</td><td>Misonix</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

escherichia coli中蛋白共表达的多重优势

The Multifaceted Benefits of Protein Co-expression in Escherichia coli

我们在此报道蛋白复合物的表达 体内 在 大肠杆菌 可能比传统的重组实验更为方便 体外特别是，我们证明了溶解度差的 大肠杆菌 DNA聚合酶III的ε亚基（具有3’-5’外切核酸酶活性）在与α亚基（具有DNA聚合酶活性）和θ亚基（稳定ε亚基）共同表达时，其性能显著提升。我们还表明，蛋白质共表达在 E. coli 可用于高效检测来自不同细菌物种的亚基形成功能性蛋白质复合物的能力。我们确实证明了α亚基 Deinococcus radiodurans DNA聚合酶III可共表达 体内 与ε亚基 E. coli此外，我们报道了利用蛋白质共表达来调节突变频率的方法 大肠杆菌. 通过在控制下表达野生型ε亚基 araBAD 启动子（阿拉伯糖诱导型），并在其控制下共表达同一蛋白的诱变D12A变体 lac 启动子（可被异丙基-硫代-β-D-半乳糖吡喃糖苷，IPTG 诱导），我们能够改变 E. coli 使用适当浓度的诱导剂阿拉伯糖和IPTG测定突变频率。最后，我们讨论蛋白质共表达领域的最新进展及未来面临的挑战 E. coli.

E. coli DNA聚合酶III的ε亚基由243个氨基酸组成，通常溶解性较差17,18，除非删除第187至243位的残基17。然而，我们先前的研究11表明，全长α、ε和θ亚基的共表达能够产生可溶性的DNA聚合酶III催化核心（图1）。具体而言，利用pBAD-pGOOD共表达系统，我们证明了：i）α和ε亚基的过表达可分别通过阿拉伯糖和IPTG独立调控（图1A）；ii）在过表达α、ε和θ的E. coli细胞中，经凝胶过滤分离的可溶性蛋白提取物中可检测到全长ε亚基（图1B）。在此情况下，外切酶活性分布于三个主要峰（图1B，实心圆点），其中以第23组分为中心的峰被证实含有αεθ催化核心（图1C和图1D）。ε亚基在与α和θ亚基结合后稳定性显著提高。此前我们在E. coli中过表达全长ε时，仅在可溶性蛋白提取物中通过Wester...

蛋白质共表达是重组表达的一种有力替代方法 体外 蛋白质复合物，并有助于进行生物化学和遗传学检测 体内。本文报道了蛋白质共表达的应用 大肠杆菌 以获取蛋白质复合物，并调节细胞的突变频率。

Escherichia coli中蛋白共表达的多重优势

我们在此报告，在大肠杆菌中体内表达蛋白质复合物可能比传统的体外重建实验更为便捷……

以下实验的总体目标是在大肠杆菌中共同表达不同的蛋白质，并在体内评估它们的组装情况。该目标通过使用两种相容性质粒 P bad 和 P good 共同转化大肠杆菌 TOP 10 来实现。第二步，将共转化的菌株在 30 摄氏度下培养，然后诱导其过表达目标蛋白质。接下来提取可溶性蛋白质，并进行凝胶过滤，以检测过表达蛋白质之间的相互结合。结果表明，在大肠杆菌中共同表达是体内组装蛋白质复合物的有效工具，且可有效避免游离亚基蛋白溶解度差的问题。共表达是生物化学中一种强大的技术，可实现不同蛋白质在单个细胞中的过表达，从而逆向推进相关研究。人们认识到，单个基因的过表达对于Lopi数量蛋白的研究至关重要。然而，当研究对象为蛋白质复合物时，必须在体外对单个蛋白质进行过表达、分离和重组。这是一种实验强度较大的方法，同时也意味着目标蛋白质复合物的产量低于构成该复合物的各个单独蛋白质的产量。此外，可能会遇到其中一个蛋白质互作分子溶解度较低的问题。该方法有助于回答生物化学领域中的关键问题，例如由多种不同亚基组成的蛋白质复合物的表征。开始实验时，制备 Top10 大肠杆菌菌株的感受态细胞。将单个菌落转移至一毫升 LB 培养基中。在 37 摄氏度、180 RPM 振荡条件下培养试管。将预培养物按 1 比 500 的比例稀释至 25 毫升新鲜 LB 培养基中，并在 37 摄氏度下培养至对数期 OD 值达到 0.6。离心前，将细胞悬液在 5,000 RPM 条件下离心 20 分钟。重悬沉淀物于25毫升10%（体积比体积）的冰上预冷无菌甘油水溶液中，重复此步骤四次，每次重悬后使悬浮液体积降至1.5毫升。接下来，将沉淀重悬于10%甘油中，并将细胞悬液分装为每份50 µL。将分装样品在-80°C条件下保存，可保存长达六个月。为继续实验，将所需质粒溶解于无菌水中（添加0.5 mmol/L EDTA），并将一份电转感受态细胞在冰上解冻。加入2.5至5纳克的载体，并与解冻的细胞混合。将细胞分装至0.1厘米的电转杯中。对细胞施加1.8千伏的电脉冲，然后立即将电穿孔后的细胞转移至1毫升SOC培养基中。将细胞在摇床中孵育1小时，取100 µL等份样品转移至含有LB琼脂和抗生素的培养皿中，于37 °C过夜培养。通过无菌接种环在培养皿上划线分离单菌落，以纯化T。将含有共转化子的少量甘油菌种转移至含有LB培养基和抗生素的培养皿中。将细胞悬液滴加到培养皿上并使其干燥，然后划线接种细胞滴。将培养皿在37摄氏度下培养过夜。培养后，用无菌牙签将单个菌落转移至1毫升含抗生素的LB培养基中。在 37 摄氏度下培养该培养物 8 小时。将预培养物按 1 比 500 的比例稀释至新鲜培养基中，并在 30 摄氏度下培养 15 小时。接着，加入 1 毫摩尔。分别用 Aose 和 IPTG 在 30 摄氏度下孵育培养物两个半小时。收集细胞，并

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科研

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生物学

蛋白质的共表达了多方面的好处<em&gt;大肠杆菌</em

系统性、大规模的合成遗传学（基因-基因或上位性）相互作用筛选可用于研究遗传冗余和通路间的串扰。本文中，我们介绍了一种高通量定量合成遗传阵列筛选技术，称为 eSGA，该技术由我们开发，用于阐明大肠杆菌（Escherichia...

绘制细菌功能网络与通路 大肠杆菌 使用合成遗传阵列

结合质谱技术的标签蛋白亲和纯化（APMS）是一种强大的方法，可用于系统性绘制蛋白质相互作用网络，并研究生物过程的分子机制基础。本文中，我们描述了一种为大肠杆菌（Escherichia...

蛋白质复合物的鉴定 大肠杆菌 使用连续肽亲和纯化与串联质谱联用技术

蛋白质复合物催化细胞内的关键功能。对许多重要复合物进行详细的功能和结构表征需要通过重组表达来实现。MultiBac 是一种杆状病毒/昆虫细胞表达系统，专为表达真核蛋白及其复合物而设计。MultiBac...

欧洲分子生物学实验室的 MultiBac 蛋白复合物生产平台

本五日方案详细说明了从头开始创建和运行一种高效的内源性大肠杆菌（Escherichia...

用于合成生物学的基于 Escherichia coli 的 TX-TL 无细胞表达系统的实施方案

介绍了一种基于绿色荧光蛋白融合技术，用于在大肠杆菌（Escherichia...

基于绿色荧光蛋白的膜蛋白表达筛选 大肠杆菌

本研究描述了一种利用T7系统在单个质粒上共表达多个基因的方法 大肠杆菌 使用 pMGX...

可诱导的T7 RNA聚合酶介导的多基因表达系统，pMGX

合成生物学可通过共翻译插入非经典氨基酸，实现具有前所未有特性的蛋白质的工程化。本文介绍了如何通过选择性压力整合（SPI）在E.

通过非天然氨基酸的选择性压力整合及质谱与荧光蛋白分析技术构建“金色”荧光蛋白

我们开发了一种在植物中共同表达多种嵌合型荧光融合蛋白的新方法，以克服传统方法的困难。该方法利用含有多个功能上相互独立的蛋白表达盒的单个表达质粒，实现蛋白的共表达。...

高效共表达多种嵌合荧光融合蛋白的植物方法

本方案详细说明了在4天或更短时间内制备基于大肠杆菌（E. coli）的细胞提取物并实施体外（in...

大肠杆菌基于细胞的无细胞蛋白质合成：一种稳健、灵活且易于获取的平台技术的操作方案

我们描述了一种方法，用于表征通过在大肠杆菌（E.

通过异源表达对膜转运蛋白进行表征 E. coli 膜泡的制备与生产

本文介绍一种利用一组相容性载体共表达不同标签蛋白的细菌共表达方法，随后结合常规的下拉技术，用于研究无法自行组装的蛋白复合物 体外.

细菌细胞中共表达偶联下拉实验作为高效检测困难蛋白质-蛋白质相互作用的工具

了解在大肠杆菌中蛋白质共表达的方法，用于研究蛋白质复合物的体内组装。该方法利用相容质粒克服游离亚基溶解度差的问题，高效生产可溶性蛋白复合物。

Escherichia coli中蛋白共表达的多重优势

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