Name: 心肌顿抑相关的小鼠离体心脏模型心脏停搏 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: 了解小鼠离体心脏缺血性停搏后心肌顿抑的评估方法。该技术通过逆行灌注和左心室球囊插入监测心功能恢复，为缺血性心脏病研究提供重要见解。

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注：所有实验程序均已通过Lifespan机构动物护理和使用委员会批准，并且所有动物饲养和实验操作均依照美国国家研究委员会《实验动物护理与使用指南》10 进行。
1. 球囊制作与左心室压力监测电路
<ol>
	<li>根据 Miller et al.11 的方法构建左心室（LV）球囊。在装有搅拌子的烧杯中，混合 9.5 ml 蒸馏水、14.2 ml 浅色玉米糖浆和 33.8 g 蔗糖，置于加热板上加热并搅拌，直至糖完全溶解。继续加热溶液至温度达到约 150 ºC。 
	注：构建左心室球囊的方法有多种，包括对安全套尖端进行改造以及使用保鲜膜构建9,12。我们发现上述方法相对容易制备出无泄漏的球囊；然而，保鲜膜球囊的优势在于其频率-响应关系已有先前的表征研究支持9。</li>
	<li>将干燥的意大利面折成约 5 cm 长的小段，将每段的一端约 1 cm 深度浸入糖溶液中，然后缓慢取出。</li>
	<li>将意大利面干燥的一端插入聚苯乙烯泡沫块中，并悬置，使糖液滴落并形成泪滴状模具。在干燥器中放置过夜，使模具硬化。</li>
	<li>次日，将模具浸入硅胶分散凝胶中。将意大利面条重新插入聚苯乙烯泡沫块中，放入 37 ºC 烤箱中干燥 2 小时或直至完全干燥。重复此步骤一次，以确保涂覆两层硅胶。</li>
	<li>干燥后，将模具置于水中数小时，以帮助将球囊从模具上剥离。将制备好的球囊储存于 0.02% 叠氮化钠溶液中。</li>
	<li>使用 23 G 血液采集套件，通过剪切针头制成钝头并在线状针体上刻出凹槽，从而定制化制备球囊导管。</li>
	<li>将导管连接至压力换能器，并在保持导管和导管完全浸没于水中的条件下用水冲洗，防止空气进入系统。将已注水的球囊套在导管上，并使用 2-0 丝线将其牢固结扎固定。通过检测其维持压力的能力（约 100 mmHg 至少 1 小时）来测试球囊性能。</li>
</ol>
2. 离体心脏灌注系统的准备
<ol>
	<li>首先清洗并预热系统。开启已连接至Langendorff装置的37 ºC恒温水浴循环器，并用蒸馏水填充缓冲液储液罐。将新的玻璃纤维滤膜连接至流入装置的管路，并启动泵以冲洗整个系统。在准备期间，使用温度探针监测Langendorff装置模块排出的水温，以确保水浴温度设置准确。同时，开启制冷循环泵并设定为20 ºC，用于心脏停搏期间的心脏保护。</li>
	<li>在此期间配制以下溶液。配制1 L心脏停搏液（110 mM NaCl、16 mM KCl、16 mM MgCl2、1.5 mM CaCl2、10 mM NaHCO3），并进行过滤。另配制2 L KHB溶液（118 mM NaCl、4.8 mM KCl、1.2 mM KH2PO4、1.7 mM MgSO4、2 mM Na-丙酮酸盐、6 mM葡萄糖、24.9 mM NaHCO3（用CO2预先充气）、1.4 mM CaCl2（最后加入））。溶解后，使用5 µm玻璃砂芯漏斗过滤，去除沉淀物并收集至烧瓶中。取部分溶液置于冰上小皿中，供手术及心脏分离时使用。</li>
	<li>使用95% O2/5% CO2混合气体对灌注液（KHB）预充氧至少30分钟。用KHB灌注Langendorff系统，以清除系统及缓冲液储液罐中残留的水分。对于小鼠，初始泵速设定为约2.0 ml/min。在灌注套管附近放置2-0和4-0丝线缝合线。运行泵直至管路和装置完全充满灌注液，并确保除泡器内已充满灌注液。 
	注意：为实现长时间稳定灌注，强烈建议在灌注回路中安装一个在线玻璃纤维滤膜（约1 µm），以捕获可能在心脏内形成血栓的沉淀物</li>
</ol>
3. 小鼠手术
3.1）小鼠麻醉与操作
<ol>
	<li>准备注射器，内含麻醉剂混合物，剂量为每千克体重80 mg的氯胺酮和5 mg/ml的赛拉嗪，并加入无菌0.9%氯化钠溶液，使总体积达到0.2 ml。腹腔注射肝素（50 µl，1,000 U/ml溶液）。</li>
	<li>将小鼠放回转运容器中（约10–20分钟），等待其意识丧失，期间肝素发挥作用。定期进行足趾夹捏以监测疼痛反射。</li>
</ol>
3.2）取出心脏
<ol>
	<li>当小鼠完全失去意识且对脚趾夹捏无反应时，使用大头针或25 G注射器针头穿过四肢将其固定在合适的手术台上。进行胸廓切开术以暴露心脏。在胸骨下方稍作切口，并向小鼠两侧延伸切口，注意避开膈肌。</li>
	<li>迅速剪开膈肌，然后快速沿肋骨两侧向上剪开。将肋骨框架像蚌壳一样翻起，暴露胸腔。轻轻握住心脏，将剪刀置于其下方，完整取出心脏。 
	注意：一旦心脏暴露于胸腔且肺部失去功能，必须迅速将其取出。</li>
</ol>
3.3）清洗心脏
<ol>
	<li>将心脏放入盛有冰冻KHB的培养皿中，并剪除附着的任何大块肺组织。用镊子夹起心脏并找到主动脉。轻轻挤压心脏，观察是否有血液流出，此处即为主动脉的开口端。用尖头镊子夹住主动脉的开口端以固定心脏。</li>
</ol>
4. 心脏安装、开始灌注及球囊放置
4.1）心脏的安装与插管
<ol>
	<li>在将心脏运送到朗格多夫装置之前，打开泵并确保灌注压力较低（约20 mmHg）。用镊子夹住主动脉靠近套管的位置。使用另一把尖头镊子小心地打开主动脉，并将心脏沿套管向上滑动。用一把镊子固定心脏位置，然后使用带有软边的夹子暂时将其固定在套管上。 
	注意：迅速将心脏安装到灌注套管上对于获得良好的制备至关重要。随着操作经验的积累，从打开胸腔到完成心脏安装的整个过程应在1至2分钟内完成。</li>
	<li>使用4-0丝线将主动脉在夹子正下方牢固地结扎于套管上，以启动灌注。确保打结时丝线同时环绕金属主动脉套管，以防止在收紧结时将主动脉闭合。当第一道结牢固固定后，移除夹子。</li>
	<li>使用额外的丝线将主动脉牢固地绑紧在套管上，确保结扎位置位于任何从主动脉发出的分支血管的远端。这些分支通常可通过灌注液从主动脉泄漏或喷出而被识别。 
	注意：在灌注初期，血液应被冲洗出心脏，整个心脏应呈现柔和的粉红色。若出现无法冲洗掉的深色变色区域，提示存在缺血区，可能由空气栓塞或血栓引起，此类心脏不应使用。</li>
</ol>
4.2）建立灌注和左心室压力（LVP）测量
<ol>
	<li>缓慢增加灌注压力并提高泵速，直至灌注压力达到70 mmHg。 
	注意：小鼠灌注的标准灌注压通常为70–90 mmHg，但在同一实验中，不同动物之间的灌注压必须保持恒定。</li>
	<li>清洁剩余组织（肺、甲状腺） 等等。) 可能仍附着在心脏上。使用剪刀剪除左心房，以在左心室上创建一个开口。</li>
	<li>将球囊置于支架上并放气。将球囊导管置于主动脉导管附近，正对左心室开口处。在固定心脏位置以防止主动脉撕裂的同时，小心地将球囊向下插入左心室。</li>
	<li>气囊就位后，缓慢开始充气，直至左心室舒张末期压力（LVEDP）达到约8 mmHg。将温度探针贴紧心脏底部，以测量流出液的温度。</li>
</ol>
4.3）基础测量
<ol>
	<li>将心脏密封于带水套的灌注室中。在此期间，持续用KHB灌注心脏，并确保温度持续上升。监测温度并相应调节水浴，直至温度达到约~37 ºC。 
	注意：在灌注初期监测温度至关重要，因为冠状动脉流量以及随之而来的温度可能因心脏个体差异而有所不同。通过置于心尖处的温度探针监测流出液灌注液的温度，以评估心肌所需温度。此外，与其他Langendorff灌注方案相比，心脏在灌注或停搏期间不浸没于CP或KHB中，这主要是为了快速调节温度，并在无扩散限制的情况下高效递送CP。</li>
	<li>使用连接至相应传感器的数据采集系统开始连续记录功能参数，包括灌注压、左心室压（连接至左心室压球囊的压力传感器）、温度以及电生理参数（如配备，包括心电图、动作电位图）。当流出液KHB温度在至少15分钟内维持在~37 ºC且心脏功能参数稳定时，记录基线测量时间。 
	注意：每颗心脏均需应用纳入/排除标准。基线时左心室发展压（LVDP）&#60;60 mmHg的心脏应排除于分析之外。此外，冠状动脉流量&#62;4.5 ml/min，或无法在基线维持灌注压，通常提示主动脉存在渗漏或撕裂。任何存在明显缺血区域（可通过视觉确认，即&#160;血块）或表现出与缺血相关的心功能下降（即左心室舒张末期压升高、严重心律失常）的心脏也应排除于分析之外。</li>
	<li>通过在量筒中收集冠状动脉流出液1分钟来测量冠状动脉流量。关闭灌注室，使温度和功能恢复至基线水平。或者，可在压力释放回路后的灌注管路中放置流量探针，连续测量冠状动脉流量。</li>
</ol>
5. 启动心脏停搏
<ol>
	<li>将100 ml冷停跳液缓冲液放入另一个储液器中，并将KHB储液器的导管转移至停跳液储液器。</li>
	<li>拆下水套式外壳和灌注加温管路，将其从温水浴中分离，并使用管路快速接头连接至制冷循环器。采用独立的加热和冷却循环器，以实现心脏及灌注液温度的快速变化。</li>
	<li>跟随切换过程中进入管路的气泡，当气泡接近离体心脏时，开始计算停搏液灌注时间。停搏液灌注持续2分钟。首次剂量灌注结束后停止泵送。确保心脏在舒张期停搏，并接近目标停搏液温度。 
	注意：必须使用足够有效的气泡捕获装置，以避免心脏内发生空气栓塞。 alternatively，可通过一个三通阀切换两个储液器的输送系统，该装置易于构建；然而，我们发现，在更换储液器之间的插管时会引入少量气泡，利用追踪该气泡的方法来确定CP溶液的输送时间，是一种简便的方式，尤其适用于不同实验间可能存在泵速差异的情况。即， 由于小鼠/大鼠、灌注压力、滤器阻力 等等.)</li>
	<li>将心脏置于心肌停搏液中，在约 20 ºC 下保存 2 小时。在心肌停搏期间，每半小时重新启动泵 1 分钟&#160;因此给予另一剂。 
	注意：每隔30分钟间歇性给予环磷酰胺（CP）会导致心脏功能受损，但不引起组织坏死。延长CP给药间隔时间（即， &#62;45分钟）可能导致坏死和缺血性挛缩，更适合用于模拟与未受保护的缺血相关的坏死性损伤。</li>
</ol>
6. 再灌注
<ol>
	<li>在心脏停搏（CP）结束时，将储液器套管移回含氧的KHB溶液中。连接温度控制电路至加热循环器，并启动泵以开始再灌注。此时，心脏停搏液被冲洗出，观察到温度上升，心脏在再灌注2-4分钟后重新开始搏动。心脏起搏初期，搏动较慢且常呈心律不齐。 
	注意：舒张期左心室压（LVP）通常不会显著升高（即， ≤10 mmHg的升高），这在单纯的缺血模型中较为典型。心律失常可能持续至再灌注阶段，有时需要对心脏进行除颤。可通过使用刺激器（设置为较高电压，约10–50 V）并将其电极置于心脏的基底部与心尖部来实现。</li>
	<li>让心脏再灌注30分钟，在此期间根据需要测量冠状血流。通过使用量筒收集流出液30-60秒来测定冠状血流。</li>
</ol>
7. 收集组织
<ol>
	<li>放气并移除左心室内的球囊。将心脏从插管上取下并称重。在初步实验中，应至少取一个心脏横切面进行TTC染色，以评估坏死情况，确保心脏无任何坏死性损伤。</li>
	<li>收集心脏切片用于显微镜研究、湿重/干重测定， 等等。 将剩余或完整的心脏迅速放入液氮中冷冻。将冷冻后的心脏储存在-80 ºC冰箱中。 
	注意：用于高能磷酸化合物的测量（即，&#160;ATP、磷酸肌酸），应立即冷冻心脏。</li>
</ol>

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<li>Clements, R. T., Cordeiro, B., Feng, J., Bianchi, C., Sellke, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rottlerin+increases+cardiac+contractile+performance+and+coronary+perfusion+through+BKCa%2B%2B+channel+activation+after+cold+cardioplegic+arrest+in+isolated+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Rottlerin increases cardiac contractile performance and coronary perfusion through BKCa++ channel activation after cold cardioplegic arrest in isolated hearts.</a> Circulation. 124 (11 Suppl), S55-S61 (2011).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

上述方案详细描述了评估与心脏停搏相关的全心缺血所继发的心肌顿抑的方法。在我们的实验条件下，该方案在再灌注30分钟时点可导致心脏功能（左心室发展压LVDP、±dP/dt）约下降40%，而心率变化较小。当心脏恢复灌注并复温时，所有心脏功能参数在初始时间点均下降，心率显著降低，随后在20至30分钟之间趋于稳定。由于充血反应，冠状动脉血流在早期再灌注期间通常显著增加，之后在再灌注30分钟后下降至比对照水平低约20–30%的水平。
需要牢记的是，心肌顿抑按定义应使心脏免于细胞死亡和坏死，而这正是单纯缺血/心肌梗死（MI）模型的特征即， &#62;20分钟无灌注区域缺血）。初步研究应评估组织学以确保无坏死性损伤。此外，尽管心肌顿抑按定义应在长时间再灌注（数小时至数天）后恢复正常功能，但由于该方案的限制，可能无法观察到功能的完全恢复 离体 Langendorff灌流会导致对照组灌流心脏的心功能随时间下降。然而，在无细胞死亡或坏死的情况下，心功能急性恢复程度的变化可作为心肌顿抑严重程度的指标。本方案与经典的无血流缺血方案主要区别在于采用了心肌保护策略，即高钾停搏...

心肌顿抑是指尽管在短暂缺血或在心脏保护条件下经历较长时间缺血损伤后血流已恢复，心肌收缩功能仍出现可逆性降低的现象1,2,3,4,5该方法专门用于模拟临床上相关的缺血性损伤，此类损伤可导致心肌收缩功能出现可逆性障碍。即， 与使用心脏停搏液的心脏手术相关的缺血性损伤、短暂缺血发作、心绞痛 等等。）。与严重缺血研究（心肌梗死、坏死）不同，本方案旨在评估心肌功能恢复和心脏保护作用，而不造成组织损伤、重构及细胞死亡。本文的大部分内容介绍了一种标准的心脏停跳液停搏方案，其操作要素类似于在低温和间歇性灌注心脏停跳液条件下进行的心脏外科手术。
大多数心脏手术期间的心肌保护依赖于心脏停跳液和体外循环。尽管心脏停跳液（CP）溶液和使用策略存在广泛差异（血液、晶体、低温、温血） 等等。最常见的成分包括：1）高钾血症和/或其它使心脏停搏于舒张期的策略，从而减少心肌收缩所导致的能量消耗；2）低温以减缓代谢速率，帮助在停搏期间维持ATP及其他能量储备。目前的心肌保护液可有效保护心脏，抵御原本可能致命的缺血性损伤。然而，手术期间针对缺血性损伤的心肌保护策略并非完美，由此引起的轻度缺血性损伤可能导致可逆性心肌收缩功能障碍（心肌顿抑）、酸中毒、心肌细胞损伤以及血管效应，包括冠状动脉灌注减少和血管痉挛。
本方案与评估心肌梗死和严重缺血的标准离体心脏缺血模型不同，它用于评估较轻度的缺血性损伤，这类损伤可导致短暂缺血或与心脏停搏相关的缺血事件后心脏功能受损。（有关Langendorff灌注技术及缺血/再灌注研究的综述，参见6–8）。关于小鼠离体灌注心脏实验参数的一般指南和详细分析，请参阅Sutherland et al. 20039。本文所述技术详细介绍了在小鼠心脏中可靠诱导顿抑效应所需的设备、试剂、步骤、策略及操作要点。若将该技术应用于大鼠，需进行少量修改。
小鼠心脏短暂分离后，用生理学克雷布斯-亨塞莱特缓冲液（KHB）进行约30分钟的朗根多夫（Langendorff）灌注，随后通过输注高钾低温停跳液诱导心脏冷保护性停搏。停搏后，在心脏复温及用KHB再灌注过程中监测心功能恢复情况。通过评估心肌收缩功能恢复程度的变化，可用来评价心肌保护药物及不同心肌保护策略的效果。

<table><tbody><tr><td>心脏停搏液（St Thomas II）</td><td></td><td></td><td>符号 / 浓度（mM）</td></tr><tr><td>氯化钠</td><td></td><td></td><td>NaCl; 110</td></tr><tr><td>氯化钾</td><td></td><td></td><td>KCl; 16</td></tr><tr><td>氯化钙</td><td></td><td></td><td>CaCL2; 1.5</td></tr><tr><td>氯化镁</td><td></td><td></td><td>MgCL2; 16</td></tr><tr><td>碳酸氢钠</td><td></td><td></td><td>NaHCO3; 10</td></tr><tr><td>Krebs-Heinslet 缓冲液</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>氯化钠</td><td></td><td></td><td>NaCl; 118</td></tr><tr><td>氯化钾</td><td></td><td></td><td>KCl; 4.8</td></tr><tr><td>硫酸镁</td><td></td><td></td><td>MgSO4; 1.7</td></tr><tr><td>碳酸氢钠</td><td></td><td></td><td>NaHCO3; 24.9</td></tr><tr><td>磷酸二氢钾（单碱式）</td><td></td><td></td><td>KH2PO4; 1.2</td></tr><tr><td>氯化钙</td><td></td><td></td><td>CaCL2; 1.4</td></tr><tr><td>丙酮酸钠</td><td></td><td></td><td>Na pyruvate; 2</td></tr><tr><td>葡萄糖</td><td></td><td></td><td>C6H12O6; 6</td></tr><tr><td>球囊试剂</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>玉米糖浆</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>意大利面</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>硅胶分散凝胶</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>泡沫塑料块</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>实验室烘箱/培养箱（50°C）</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Langendorff 灌流设备</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>离体灌流心脏系统（IH-SR（Hugo-Sachs）或等效设备）</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>数据采集系统（DSI、ADinstruments 或等效设备）</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>加热循环水浴</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>冷却循环水浴</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>可提供 2–30 mL/min 流速的灌流泵</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>串联灌流滤器 — 1 µm 玻璃纤维</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>左心室压（LVP）和灌流压用压力传感器及放大器</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>小型量筒（约 10 mL）</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>小型温度探头和温度计（Werner 或等效设备）</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>灌流储液瓶（1 L）</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>心脏停搏液储液瓶（约 200 mL）</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>气体鼓泡器</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>95/5 氧气/二氧化碳混合气</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>手术器械与试剂</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Metzenbaum 和 Potz 手术剪</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>两把 Dumont 5 号镊子</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>氯胺酮</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>赛拉嗪</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>肝素</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>带软质夹面的小型夹子用于夹持主动脉（例如末端包裹胶带的终端夹）</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>丝线 2-0 和 4-0 缝合线</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

与心脏停搏相关的鼠类离体心脏心肌顿抑模型

Murine Isolated Heart Model of Myocardial Stunning Associated with Cardioplegic Arrest

以下方案可用于评估中度缺血损伤后的心脏功能障碍或心肌顿抑。该技术适用于模拟与多种临床相关现象相关的缺血性损伤，包括伴随心脏停搏液诱导的心脏停搏和体外循环的心脏手术、非体外循环冠状动脉旁路移植术（off-pump CABG）、心脏移植、心绞痛以及短暂性缺血等。 等等该方案介绍了一种在啮齿类动物心脏中建立低温高钾停跳与再灌注模型的通用方法，重点在于心肌收缩功能的测定。简言之，将小鼠心脏以Langendorff模式进行灌注，并置入心室内球囊，记录基础状态下的心脏功能参数。在心脏功能稳定后，短暂灌注具有心肌保护作用的低温停跳液，以诱导舒张期停搏。停跳液在2小时内间歇性灌注。随后恢复灌注并使心脏复温至正常体温，持续监测心肌功能的恢复情况。采用本方案可稳定诱导啮齿类动物心脏收缩功能抑制，且不引起明显的心肌组织损伤。

图1展示了一次小鼠实验的典型结果。左心室压力（LVP，红线）、dP/dt（绿线）和温度（紫线）持续记录约3小时。字母表示：a - 基线测量，b、c、d、e - 心脏停搏液的灌注，f - 再灌注开始，g、h、i、j - 再灌注期间冠状动脉血流的测量。注意，再灌注时左心室发展压（LVDP）和dP/dt较基线水平下降。图1B展示了图A中约2秒时间内的数据。可见LVP和dP/dt的下降趋势与图A相似，心率（HR）略有降低，左心室舒张末期压力（LVEDP）略有升高。通常在再灌注30分钟后，心脏功能下降约40%，如图1C所示的左心室发展压（LVDP）所示。
<img alt="心脏停搏实验结果；左心室压、dP/dt、温度曲线；压力与心肌功能。" src="/files/ftp_upload/52433/52433fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="...

本方案旨在评估啮齿类动物在缺血性心脏停搏后的心肌顿抑情况。

以下方案可用于评估中度缺血性损伤后的心脏功能障碍或心肌顿抑。该技术适用于……

本实验的总体目标是评估在啮齿类动物发生缺血性心脏停搏后出现的心肌顿抑现象。首先，对成年小鼠取出的心脏进行逆向灌注。第二步，将一个球囊插入心脏的左心室，并记录基线对照数据。随后开始适当时间的低温心脏停搏，并继以再灌注期。最终，该技术可用于监测心肌缺血损伤后心肌功能恢复过程中发生的变化。尽管该方法可为小鼠轻度缺血性损伤相关的心肌顿抑提供研究依据，也可应用于其他哺乳动物，如大鼠，以及两种重度缺血-再灌注损伤模型。通常，初次接触该方法的研究人员可能会遇到困难，因为快速插管心脏具有挑战性，而这是获得稳定且可重复样本的必要条件。为取出心脏，需进行开胸手术。第一步是在胸骨下方紧邻处切开一个小孔，并将切口向小鼠两侧延伸。然后迅速剪下膈肌，并快速沿肋骨边缘向上剪开。将肋骨像蚌壳一样向后翻起，暴露胸腔。接着轻轻抓住心脏，将剪刀置于其下方，完整取出该器官。将心脏放入盛有冰冻克雷布斯-亨泽尔亮氏缓冲液（KHB）的培养皿中，去除所有大块的肺组织。然后轻轻挤压心脏，出现血液的位置即表示主动脉的开放端。在连接心脏之前，启动泵并确认灌注压力约为20毫米汞柱。然后用精细镊子夹住主动脉的开放端，用另一把精细镊子将心脏沿灌注系统的套管向上滑动，固定好心脏位置。使用带有软边的夹子将主动脉暂时固定在套管上。接下来，使用4-0丝线缝合将主动脉固定在夹子正下方的插管上。注意将结扎线也绕过插管，以防止在收紧结时导致主动脉闭塞。当结扎线牢固就位后，移除夹子，并使用额外的丝线缝合将主动脉牢固地固定在插管上。在主动脉上任何正在渗漏或喷出灌注液的血管分支下方打结结扎。在灌注初期，血液应从心脏中冲洗出来，整个器官应变为柔和的粉红色。当套管固定后，缓慢增加灌注压力和泵速，直至灌注压力达到70毫米汞柱。去除仍附着在心脏上的任何残留组织。然后剪除左心房，以在左心室上形成一个开口。现在将球囊放置到支架上并使其处于放气状态。接着将球囊导管置于主动脉导管附近，正对左心室的开口处，同时固定心脏防止主动脉撕裂，小心地将球囊向下插入左心室内。球囊就位后，缓慢开始充盈球囊，直至左心室舒张末期压力达到约8毫米汞柱。然后将温度探针置于心脏底部，以测量流出液的温度。进行基础测量时，将心脏密封于设定为37摄氏度的水套灌流室中，并持续用KHB溶液灌流。然后使用适当的数据采集系统开始持续记录所需的功能测量指标。当流出液温度达到约37摄氏度并维持至少15分钟，且心脏功能参数稳定后，记录基线测量的时间。随后通过收集冠状静脉流出液并使用量筒测量冠状血流流量。一分钟后，关闭腔室，使温度和功能恢复至基线水平。为立即启动停搏，向第二个储液器中加入100毫升冷心脏停搏液（CP缓冲液），并将KHB储液器的套管转移至CP储液器。使用快速管路断开装置，将水套式 housing 和灌注加温回路从温水浴转移至制冷循环仪，并注意观察切换过程中进入灌注管路的气泡。当灌注液进

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