Name: 一个体外模型在乳腺癌研究激素的作用 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 31 s
Description: 学习一种离体模型用于研究人类乳腺组织中激素作用的方法，该模型通过机械分离和胶原酶消化保留组织结构与细胞间相互作用，适用于乳腺癌及内分泌学研究。

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作者感谢洛桑大学医院的 M. Fiche 提供乳房成形术照片，感谢洛桑联邦理工学院生命科学学院瑞士实验癌症研究所国家能力研究中心的 M. Wirth 和 A. Ayyanan 提供技术支持，以及曼彻斯特大学的 R. Clarke 提供的宝贵意见。本研究工作获得了以下资助：SNF3100A0-112090、Oncosuisse 531817，以及创新药物计划联合行动计划（Innovative Medicines Initiative Joint Undertaking）第 115188 号赠款协议的支持，该计划的资源由欧洲联盟第七个框架计划（FP7/2007-2013）的财政支持以及欧洲制药工业协会联合会成员公司的实物贡献共同组成。创新药物计划的网站地址为 <a href="http://www.imi.europa.eu/" target="_blank">http://www.imi.europa.eu/</a>。

一般注意事项：提前制定伦理方案，准备患者问卷，并安排临床人员培训。在使用缩乳手术获取的组织材料前，需获得相关授权，并确保患者知情同意。组织可能具有传染性，应相应地进行处理。本方案已获得ISREC（瑞士实验癌症研究所）伦理委员会批准。
1. 组织回收、处理与生物样本库
为确保生物样本库的样本质量，在样本运送至实验室之前，医院需完成多个步骤。
在医院：
<ol>
	<li>在无菌条件下获取乳房缩小整形手术中的人类乳腺组织，如需要，同时采集血液样本。组织需由病理学家进行检查，取样以排除恶性病变的存在。</li>
	<li>将乳腺组织置于超净台内的无菌操作板上，准备好已通过蒸汽灭菌器灭菌的剪刀、手术刀和镊子。使用手术刀在乳腺组织的不同部位做深部切口以将其打开。在人类乳腺组织中，寻找由导管和小叶组成的白色条索状结构，这些结构嵌于黄色的脂肪组织中。 
	注意：白色实质组织与黄色脂肪组织的比例因人而异；通常年轻女性含有更多的上皮组织。</li>
	<li>用镊子夹取白色组织碎片，并用剪刀小心地将其从脂肪组织中分离。避免夹取血管组织。</li>
	<li>用磷酸盐缓冲液（PBS）pH 7.2冲洗组织碎片以去除血液。将组织转移至含有F12培养基（Dulbecco改良Eagle培养基F12）的250 ml塑料瓶中，培养基不含酚红，并添加2%青霉素/链霉素（含5,000单位/ml青霉素和5,000 g/ml链霉素）以及1%抗生素/两性霉素B（含10,000单位/ml青霉素、10,000 µg/ml链霉素和25 µg/ml两性霉素B）。将组织保存在该培养基中，用于运输至实验室。</li>
	<li>将组织切成直径为3–5 mm的碎片，用于RNA和蛋白质提取，并用预冷（干冰）的异戊烷快速冷冻后装入冻存管。随后转移至干冰盒中运往实验室。</li>
	<li>将直径为3–5 mm的组织碎片放入模具中，覆盖一层最佳切割温度（OCT）包埋剂，然后将模具置于装有低温异戊烷的盒子的平底上。待组织完全冻结后，将模具转移至干冰盒中。</li>
	<li>将另外5块直径为3–5 mm的组织分别用4%多聚甲醛（PFA）和4%甲醛（FA）在PBS中于室温下固定，以备后续组织学分析。建议使用两种不同的固定剂，因为某些抗体在其中一种固定条件下效果更佳。</li>
</ol>
在实验室中：
<ol start="8">
	<li>记录所有关于缩乳手术的信息，包括手术日期以及样本是否来源于左乳或右乳。</li>
	<li>将冷冻样本置于 -80°C 保存，并在固定 2 小时后将固定组织转移至组织学包埋盒中。随后将其置于 PBS 或 70% 乙醇中，于 4 °C 过夜保存。次日，将组织学包埋盒送至组织学实验室进行石蜡包埋。</li>
</ol>
2. 组织消化与激素刺激

<ol>
	<li>将含有组织样本的瓶子转移至P2级细胞培养室的超净工作台中。将组织块置于无菌切板（29 × 19 cm）上，用镊子夹住组织，用手术刀刮除乳腺实质（白色部分）上残留的脂肪和血管。将白色组织放入盛有PBS的10 cm培养皿中。</li>
	<li>在去除所有组织块上的脂肪成分并按照实验室安全规定处理后，将含有上皮组织的白色部分重新放回切板上。使用相对切割的手术刀将组织切成直径不超过2 mm的小块。</li>
	<li>将切碎的组织放入适当大小的离心管中：分别将最多1 ml、2.5 ml和10 ml的组织放入5 ml、15 ml或50 ml离心管中。通常，5 ml离心管中的组织量足以用于石蜡包埋和激素刺激实验，15 ml离心管中的组织量适用于荧光激活细胞分选（FACS），更大的离心管则用于分装冷冻保存。</li>
	<li>配制消化主混合液，包含基础培养基（无酚红的DMEM/F12）、1%青霉素/链霉素/两性霉素B以及胶原酶A（Clostridium histolyticum来源的梭菌肽酶A）。根据消化时间调整胶原酶的用量。
	<ol>
		<li>对于12、24和36小时的孵育，胶原酶的终浓度分别为1.5 mg/ml、1.0 mg/ml和0.5 mg/ml。加入的消化主混合液体积应为待消化组织体积的最多4倍，以确保充分振荡和通气。 
		注意：根据实验设计和激素刺激持续时间，可在酶消化步骤及微结构恢复期间或之后添加激素。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在实验组样本中加入所需浓度的激素，在对照组中加入等量的溶剂。若使用17-β-雌二醇和醋酸甲羟孕酮（R5020）进行刺激，终浓度均为20 nM。 
	注意：R5020是一种合成的孕酮受体激动剂，在培养基中比天然孕酮更稳定。
	<ol>
		<li>将离心管置于37 °C、40 rpm的摇床培养箱中过夜（O/N）。在将样本放入摇床前，需充分重悬，以确保所有组织均匀分布于离心管内。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>由于消化过程至少需要12小时（过夜），对于激素刺激时间少于12小时的实验，应在微结构恢复后添加激素（详见步骤3）。在重悬微结构时加入激素，并将悬液接种至超低吸附培养板中。在无生长因子的培养基中，组织微结构可在超低吸附培养板中维持培养长达7天，细胞存活率约为70%。</li>
	<li>用于RNA和蛋白质分析时，以400 × g离心5分钟收集组织微结构，并在离心管中迅速冷冻保存。</li>
</ol>
3. 组织微结构的回收
<ol>
	<li>将离心管在 400 x g 条件下离心 5 分钟。吸除离心管顶部的脂肪层，并将剩余的富含成纤维细胞的水相上清液转移至新的离心管中，在 1,250 x g 条件下离心 5 分钟。 
	注意：由于乳腺组织微结构具有很强的黏性，在后续所有步骤中，应通过轻轻振荡离心管来重悬沉淀物。不建议使用移液操作，以免造成样本损失。</li>
	<li>将富含微结构以及来自水相上清液的成纤维细胞的沉淀物重悬于 PBS 缓冲液（含 2% 胎牛血清，FCS）中。随后将两根离心管均在 1,250 x g 条件下离心 5 分钟，弃去上清液。</li>
	<li>将沉淀物重悬于 3–5 ml 红细胞裂解缓冲液中，并转移至洁净的离心管中。室温孵育 5 分钟。</li>
	<li>加入 2 倍体积的 PBS 缓冲液（含 2% FCS），在 1,250 x g 条件下离心 5 分钟。用 PBS 缓冲液（含 2% FCS）洗涤沉淀物，并在 1,250 x g 条件下离心 5 分钟。重复此步骤两次。</li>
</ol>
4. 流式细胞术样品制备
<ol>
	<li>向沉淀物中加入 1 - 2 ml 0.25% 胰蛋白酶，用 1,000 µl 移液器轻轻吹打 2 分钟，以解离细胞。</li>
	<li>加入 9 ml 含 2% FCS 的 PBS 终止胰蛋白酶活性。在 450 × g 条件下离心 5 分钟，弃上清，将沉淀重悬于 10 ml 含 2% FCS 的 PBS 中。</li>
	<li>将细胞悬液转移至置于 50 ml 离心管上方的 40 µm 细胞滤筛中，以制备单细胞悬液。若滤膜上方残留少量细胞悬液，可用移液器从滤筛另一侧吸取，使其穿过滤膜，并将这部分液体加入已过滤的微结构中。</li>
	<li>使用抗 CD45、抗 FAP 和抗 CD31 抗体混合物，从微结构中分离免疫细胞、成纤维细胞和内皮细胞，随后根据上皮细胞广谱标记物 EpCAM 和 CD10，通过 FACS 分选以分别分离管腔细胞和基底细胞10。</li>
</ol>
5. 组织学样品
<ol>
	<li>按照上述方法对机械和酶消化后的材料进行洗涤后，将来自1.5 ml起始材料的沉淀用1 ml含4%多聚甲醛（PFA）的PBS在室温下固定30分钟。</li>
	<li>以1,250 × g离心5分钟，并用1–2 ml PBS洗涤两次。</li>
	<li>以16,000 × g离心10分钟。在此期间，配制1%通用型琼脂糖溶于Tris-乙酸-EDTA（TAE）缓冲液中，并将溶液放入微波炉加热至沸腾。
	<ol>
		<li>将溶液从微波炉中取出，轻轻旋转烧瓶以混匀溶液并重新悬浮可能残留的琼脂糖颗粒。将琼脂糖溶液冷却至50 °C，然后取1 ml倒入尺寸为31 × 23 × 13.5 mm的石蜡底模中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>弃去上清液，用平头刮勺将沉淀物转移至已凝固的琼脂糖层（1–3 mm）上方，并用一层额外的琼脂糖（40 °C）覆盖所有样品。</li>
	<li>琼脂糖通常在5分钟内凝固，凝固后将琼脂糖块放入组织学包埋盒中用于石蜡包埋。同时，在包埋盒内放置一张白色办公用纸，用铅笔小字注明缩乳手术编号、实验条件和日期；该书写方式可耐受后续所有处理步骤。</li>
	<li>将包埋盒置于PBS中过夜，或于周末期间置于70%乙醇中，4 °C保存。我们未观察到两种保存液之间存在明显差异。随后将组织学包埋盒送至组织学实验室进行石蜡包埋。</li>
</ol>
6. 冷冻微结构（未来培养）
<ol>
	<li>用含有10%二甲基亚砜（DMSO）的胎牛血清（FCS）冷冻保存液重悬组织微结构，并将1 ml分装至冻存管中。获得的冻存管数量取决于乳房缩小成形术所获取的原代组织材料量。</li>
	<li>使用程序降温仪按照以下程序冷冻含有组织微结构的冻存管：在4 °C停留5分钟，以6 °C/min的速率降温至-7 °C，再以6 °C/min的速率降温至-12 °C，停留10分钟，随后以6 °C/min的速率降温至-40 °C，再以6 °C/min的速率降温至-80 °C。然后将冻存管转移至-80°C超低温冰箱中。</li>
	<li>次日，将冻存管从-80°C超低温冰箱转移至液氮罐中进行长期保存。</li>
</ol>

<ol><li>Beral, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breast+cancer+and+hormone-replacement+therapy+in+the+Million+Women+Study%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Breast cancer and hormone-replacement therapy in the Million Women Study.</a> Lancet. 362 (9382), 419-427 (2003).</li>
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<li>Tanos, T., Rojo, L. J., Echeverria, P., Brisken, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ER+and+PR+signaling+nodes+during+mammary+gland+development%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">ER and PR signaling nodes during mammary gland development.</a> Breast Cancer Res. 14 (4), 210(2012).</li>
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<li>Brisken, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progesterone+signalling+in+breast+cancer%3A+a+neglected+hormone+coming+into+the+limelight%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Progesterone signalling in breast cancer: a neglected hormone coming into the limelight.</a> Nat Rev Cancer. 13 (6), 385-396 (2013).</li>
<li>Xu, R., Boudreau, A., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+architecture+and+function%3A+dynamic+reciprocity+via+extra-+and+intra-cellular+matrices%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Metastasis+Rev%22%5BJournal%5D)">Tissue architecture and function: dynamic reciprocity via extra- and intra-cellular matrices.</a> Cancer Metastasis Rev. 28 (1-2), 167-176 (2009).</li>
<li>Tanos, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progesterone%2FRANKL+is+a+major+regulatory+axis+in+the+human+breast%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Progesterone/RANKL is a major regulatory axis in the human breast.</a> Sci Transl Med. 5 (182), 182ra155(2013).</li>
<li>Yalcin-Ozuysal, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antagonistic+roles+of+Notch+and+p63+in+controlling+mammary+epithelial+cell+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">Antagonistic roles of Notch and p63 in controlling mammary epithelial cell fate.</a> Cell Death Differ. 17 (10), 1600-1610 (2010).</li>
<li>Hines, W. C., Su, Y., Kuhn, I., Polyak, K., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sorting+out+the+FACS%3A+a+devil+in+the+details%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Sorting out the FACS: a devil in the details.</a> Cell Rep. 6 (5), 779-781 (2014).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文所述的ex vivo培养方法可获得包含完整导管和小叶的乳腺组织微结构，同时保留了正常存在于女性人类乳腺中的其他细胞类型。在处理通常来自乳房缩小成形术获取的人类乳腺组织时，通过去除脂肪组织、对基质进行机械和酶消化，以及裂解红细胞，可富集乳管片段和终末导管小叶单位。在适当的浓度和时间下进行温和的酶消化，对于确保组织微结构保持完整、保留多种细胞类型并最大程度地维持其细胞外基质至关重要。此外，组织一旦从患者体内取出，应尽快进行处理。不同患者的样本差异较大，当组织胶原含量特别高时，可能需要延长机械和酶消化时间，和/或添加额外的酶。
尽管微结构在长达6天内仍能保持90%的存活率，但该模型在长期激素刺激方面存在局限性。由于不同细胞类型的半衰期各不相同，细胞组成可能会随着时间推移而发生变化。虽然组织微结构能够保留浸润的免疫细胞，但由于组织已脱离机体循环系统，这些细胞无法得到补充。此外，由于患者间存在差异，需要分析大量样本，因此必须建立与提供手术标本的临床合作伙伴之间的稳定流程。组织微结构可被冷冻以供后续使用。然而，冷冻和解冻在多大程度上影响细胞活力（可能对不同细胞类型产生差异...

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Marie Shamseddin
instead of:
Marie Shamsheddin

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Erratum: An Ex Vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

关于乳腺癌突变图谱的信息正在迅速增加。相比之下，影响乳腺癌发生发展的系统性因素受到的关注较少。生殖激素暴露对疾病进展具有重大影响1-3。然而，生殖激素作用于人类乳腺的机制仍不清楚。利用基因工程小鼠模型的研究表明，这些机制涉及通过多个下游效应分子介导的细胞内在信号和旁分泌信号通路4。
关于激素在人类乳腺中作用机制的知识有限，主要归因于缺乏合适的模型。目前对雌激素受体（ER）和孕激素受体（PR）信号传导机制的研究大多使用激素受体阳性的乳腺癌细胞系，如 MCF-7 和 T47D。这些细胞系来源于已接受过多种治疗的晚期乳腺癌患者的胸腔积液。5. 此类简单模型中发现结果的生物学相关性 体外 人类乳腺模型的可靠性存疑，且在这些模型中鉴定出的靶基因 体外 模型与在动物模型中鉴定出的靶基因有所不同6当原代人乳腺上皮细胞被培养时 体外 它们往往失去激素受体表达，从而丧失激素应答能力7,8.&#160; 该问题可通过使用Matrigel的复杂3D方法加以克服。通过该方法，C. Clarke及其同事成功建立了能够维持激素受体表达，并对孕酮刺激产生增殖反应的乳腺上皮细胞9然而，两个重要的 体内 孕酮受体靶基因 Wnt-4 和 RANKL在此系统中，黄体酮刺激并未诱导其表达9此方法最近被进一步采用 体外 激素预处理及RANKL诱导完成10需要注意的是，Matrigel 的活性具有批次依赖性，价格昂贵，且要求实验设计仅适用于少量细胞。
根据以下发现： 体内 ER和PR信号传导主要由旁分泌相互作用介导11我们提出，细胞间的相互作用需要保持完整。另一个重要因素是在组织被解离为单细胞过程中会丧失的 体外 培养中上皮细胞与细胞外基质的相互作用至关重要；这些相互作用对上皮细胞分化具有关键作用，其破坏在肿瘤发生中具有重要意义12.&#160; 考虑到这一点，我们建立了一种从新鲜的手术废弃组织中分离乳腺组织微结构的方法13乳腺实质由内层的腔面细胞和外层的肌上皮细胞构成的双层上皮组成，将其从脂肪组织中分离后，进行机械和酶解离。经过洗涤和离心后，获得保留了与多种间质细胞密切相互作用的乳腺导管片段。这些组织微结构仍具有激素反应性。该模型已在临床标本中得到验证13因此，本实验方法有助于在具有生物学和临床相关性的背景下研究激素在乳腺中的作用。

<table><tbody><tr><td>微升离心机</td><td>Heraeus Biofuge Fresco</td><td>75005521</td><td></td></tr><tr><td>5810R 离心机</td><td>Eppendorf</td><td>5810 000.327</td><td></td></tr><tr><td>冻存盒</td><td>Nalgene&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>5100-0001</td><td></td></tr><tr><td>程序降温冷冻仪 EF600 Grant</td><td>Asymptote&amp;nbsp;</td><td>EF600</td><td></td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 培养箱</td><td>Hera Cell Heraeus</td><td>51022391</td><td></td></tr><tr><td>滚轴混合器 SRT9D</td><td>Sturt</td><td>SRT9D</td><td></td></tr><tr><td>组织学包埋盒</td><td>Medizintechnik</td><td>81-0021-00</td><td></td></tr><tr><td>细胞筛</td><td>Falcon</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>斯特莱外科刀片&amp;nbsp;</td><td>Aesculap</td><td>BB536&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>手术刀</td><td>Aesculap</td><td>BB084R</td><td></td></tr><tr><td>镊子</td><td>Aesculap</td><td>BD047R</td><td></td></tr><tr><td>剪刀</td><td>Aesculap</td><td>BC374R</td><td></td></tr><tr><td>石蜡底座模具</td><td>SAKURA</td><td>4166</td><td></td></tr><tr><td>最佳切割温度（OCT）冷冻包埋剂</td><td>Thermoscientific</td><td>6769006</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>抗生素/抗真菌剂</td><td>Life Technologies</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>DMEM F/12</td><td>Life Technologies</td><td>11039-021</td><td>预热（37 &amp;deg;C）</td></tr><tr><td>胶原酶</td><td>Roche</td><td>11 088 793 001</td><td>预热（37 &amp;deg;C）</td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Life Technologies</td><td>10270</td><td>可用新生小牛血清替代</td></tr><tr><td>红细胞裂解缓冲液</td><td>Sigma</td><td>R7757</td><td></td></tr><tr><td>二甲基亚砜（DMSO）</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>15400-054</td><td></td></tr><tr><td>琼脂糖</td><td>Invitrogen</td><td>16500-500</td><td></td></tr><tr><td>甲醛</td><td>Sigma</td><td>F1635</td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>Roth</td><td>335</td><td></td></tr><tr><td>异戊烷</td><td>Sigma</td><td>M32631</td><td></td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Merck</td><td>1009831000</td><td></td></tr><tr><td>冻存管（5.0 ml）</td><td>VWR, International</td><td>479-0820</td><td></td></tr><tr><td>超低吸附培养皿</td><td>Corning, NY 14831</td><td>3471</td><td></td></tr></tbody></table>

一种用于研究激素在人类乳腺中作用的ex vivo模型

An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

人类乳腺中激素作用的研究因缺乏适当的模型系统而受到阻碍。 体外 培养过程中，原代乳腺上皮细胞 tends to lose 激素受体表达。常用的激素受体阳性乳腺癌细胞系对研究的 relevance 有限 体内 情况。在此，我们描述一种 离体 用于研究激素在人类乳腺中作用的模型。通过机械法和酶解法处理外科手术废弃的人类乳腺组织样本（如乳房缩小成形术或乳房切除术标本），获得包含导管、小叶及多种间质细胞类型的组织片段。这些组织微结构在不含生长因子的基础培养基中可维持数天，保持细胞间连接、组织架构以及对激素的响应能力。组织样本可直接用于RNA和蛋白质提取、组织学分析，或保存于冻存液中。荧光激活细胞分选（FACS）可用于富集特定细胞群体。本方案为利用高度复杂且多样化的临床人类组织样本开展转化医学研究提供了一种简便、标准化的方法。

为了研究雌激素和孕激素的作用，并更好地理解它们在人类乳腺中的分子功能，我们在获得患者知情同意后，收集接受乳房缩小成形术患者的乳腺新鲜组织样本（图1）。我们同时获取患者的医疗史和生殖史，以及血液样本，以测定手术时的血清孕激素水平。来自新鲜乳房缩小成形术的组织通过机械和酶解方法进行解离。所获得的组织微结构包含具有乳腺组织来源特征的导管和小叶（图2A）。对琼脂糖和石蜡包埋的组织微结构进行免疫组织化学分析，使用肌上皮标记物ΔNp63染色（图2B），结果显示这些微结构不仅保留了正常乳腺组织的形态学特征，也保留了细胞群体的分子表达谱。
为评估激素反应，将组织微结构分别用合成的孕酮受体激动剂 promegestone（R5020）或乙醇对照处理。为了富集激素受体阳性的腔细胞，根据上皮细胞标记物（EpCAM）和肌上皮细胞标记物（CALLA；图 3A），在使用抗 CD31、抗 FAP 和抗 CD45 抗体混合物去除内皮细胞、成纤维细胞和免疫细胞后，进行流式细胞术分选...

我们开发了一种新型 离体 用于研究激素在人类乳腺中作用的模型。该模型基于从手术获取的乳腺组织标本中分离的组织微结构，可保留组织架构、细胞间相互作用及旁分泌信号传导。

人类乳腺中激素作用的研究因缺乏适当的模型系统而受到阻碍。原代乳腺上皮细胞在体外培养时……

本实验的总体目标是提供一种维持组织结构、细胞间相互作用以及激素反应性的离体人乳腺模型，用于研究激素的作用机制。该模型基于人乳腺组织微结构，通过将由导管和小叶组成的乳腺实质从脂肪性乳腺间质中分离制备而成。间质除了含有脂肪细胞外，还包含成纤维细胞、免疫细胞和内皮细胞。一旦将实质组织从脂肪中分离出来，便使用相对的手术刀将其机械解离成针尖大小的组织块。随后，组织块在胶原酶作用下进行酶消化；如有需要，可在该步骤中加入激素刺激。然后通过离心回收组织微结构，并去除残留的脂肪组织、成纤维细胞富集组分以及红细胞。经过恢复处理后，剩余消化乳腺组织的悬液富含包含腔细胞和肌上皮细胞及其周围的基底膜、成纤维细胞、内皮细胞以及免疫细胞的组织微结构。最终，通过体外培养来评估微结构的形态。采用荧光激活细胞分选技术分离乳腺细胞亚群，并通过蛋白质和转录组分析开展激素反应性研究。激素调控乳腺发育，并在乳腺肿瘤发生中起重要作用。激素信号通路的研究主要集中于乳腺癌、组织培养中的细胞系以及塑料培养皿中的疾病模型。然而，当原代乳腺上皮细胞在体外培养时，它们会失去激素受体的表达。目前，我们从手术废弃组织中获得的组织微结构仍具有激素响应性，且患者样本反映了个体间的差异性。由于人类乳腺组织结构复杂，且组织消化步骤及从异质性组织中获取微结构的过程较为繁琐，因此本方法的可视化演示尤为重要。胶原蛋白浓度和消化时间至关重要，需严格控制以避免部分消化或过度消化。该离体模型有助于我们理解生殖激素如何作用于人类乳腺，以及其通过何种机制影响癌症的发生与发展。首先，将含有组织样本的瓶子转移至生物安全二级实验室的超净工作台内，在无菌切板上进行操作。用镊子夹住组织，用手术刀将乳腺实质上残留的脂肪和血管刮除。将白色组织置于含磷酸盐缓冲液（PBS）的10厘米细胞培养皿中。在将所有组织块的脂肪组织去除并按照实验室安全规定处理后，将含有上皮组织的白色部分重新放回 chopping board（切板）上，用两把相对的手术刀将组织切成直径小于2毫米的小块。将切碎的材料放入大小合适的管中，用于石蜡包埋和激素刺激。每管加入1毫升材料，使用5毫升离心管。进行荧光激活细胞分选（FACS）时，每管加入2.5毫升材料，使用15毫升离心管。若需冷冻分装，取10毫升剪碎的组织材料放入50毫升离心管中，然后加入消化液。主混合液中应含有胶原酶A，其体积最多可为待消化材料体积的四倍，以确保充分的振荡和通气。接下来，加入所需浓度的激素以进行17β-雌二醇和孕酮刺激，终浓度为20纳摩尔。对照组仅加入等量溶剂，充分振荡或混匀样品，确保所有物质在离心管中均匀分布。然后将试管置于37摄氏度、40 RPM条件下，在培养箱内的滚轴混合器上过夜。消化过程至少持续12小时，以回收组织。微结构首先以400 ×g离心5分钟。吸出离心管顶部的脂肪后，将剩余的富含成纤维细胞的水相上清液转移

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