电场诱导释放与检测法（EFIRM）对外泌体生物标志物的检测

本实验的总体目标是从生物流体中高效提取外泌体，释放外泌体内容物，并快速分析其内容物。该过程首先利用带有靶向外泌体标志物抗体的磁性微粒从生物流体中提取外泌体，然后将提取的外泌体加载到电极表面。接着，通过电场裂解外泌体，使外泌体内容物与电极表面的探针发生杂交。

同时将报告分子杂交到该系统中。最后一步是在电极表面添加底物溶液，然后通过测量电流获得读数。最终，通过电化学电流测量来显示外泌体样本中核酸或蛋白质的含量。

与现有方法（如超速离心法和赖氨酸缓冲液法）相比，该技术的主要优势在于它是一种简单快速的外泌体内容物提取与检测方法。我们对该技术感到非常兴奋，因为这是首次利用efim技术获取器官在疾病状态或正常状态下通过血管系统释放、并进入口腔的信息。该技术使我们能够捕获这些信息，并以灵活的方式同步释放并检测其中的分子成分。

这种疾病鉴别信息通常对刚接触该方法的用户具有挑战性，因为如果不谨慎操作，磁性微粒的使用可能较为困难。此外，电化学方法在生物样本分析中的应用对某些人而言可能是一种全新的范式。该方法的可视化演示至关重要，因为磁性微粒的操作和电极加载过程较难掌握。在处理磁性微粒并将其加载到电极上时，必须格外小心。

开始重悬时，取含有10微克/毫升链霉亲和素包被的磁性微粒的储存液，加入5微升。将该溶液加入含有495微升PBS的微量离心管中以洗涤微珠。首先，将离心管置于磁力架上静置1分钟，然后小心移除上清液，注意不要扰动微珠。

然后将试管转移至非磁性架上。加入500 µL PBS，用PET洗涤磁珠。最终洗涤结束后，重复此步骤共三次。

将磁珠重悬于 490 µL PBS 中，然后加入 5 µL 来自 1 mg/mL 储存液的生物素化小鼠抗人 CD63 抗体。通过移液操作程序混合溶液：在样品旋转仪上以 90 度往复旋转 5 秒钟，再以 5 度振动 1 秒钟。将试管放入旋转仪中，在室温下运行该程序 30 分钟。

接着，将离心管转移至磁力架上静置五分钟。用500 µL PBS洗涤磁珠三次，然后将其重悬于490 µL含Caine的PBS中。用样本编号标记一个离心管，然后加入10 µL样本，反复吹打混匀，使样本与抗体偶联的磁珠充分混合。

接下来，将离心管转移至样品旋转仪中，在室温下运行相同的程序两小时。然后用500微升1摩尔的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液洗涤磁珠三次。利用磁性架，外泌体现在已结合到磁性珠上，以预包被电极。

首先将探针、氯化钾和油酸单体的储备试剂用蒸馏水稀释。5′端生物素标记的DNA探针特异性针对GA DH mRNA。通过涡旋振荡混合单体探针溶液。

使用一个包含16个传感器的电极阵列，其中每个单元电极由裸金构成的工作对电极和参比电极组成。将一个塑料小室放置在电极阵列上，以防止电极之间的交叉污染。转移60 µL单体探针溶液至金电极表面，使工作对电极和参比电极均被液体覆盖。

施加一种称为A-C-S-W-E场的循环方波电场，用于电聚合单体探针。这会在电极表面形成一层导电聚合物。用蒸馏水将传感器冲洗三次，然后用氮气吹干，以去除电极表面的液体。

用捕获探针预包被电极后，将5微升1微摩尔的检测探针溶液加入495微升珠-外泌体复合物溶液中，然后通过移液混匀。该探针是一种3'端荧光素标记的DNA引物，特异性针对GA dh。将一个预编码的电极阵列置于由16个磁体组成的磁体阵列上方，磁体位置与传感器的工作电极对齐。

然后将60微升珠-外泌体溶液转移至电极表面。施加A-C-S-W-E电场，循环20次。释放的外泌体内容物将与电极表面的探针杂交。

用蒸馏水冲洗电极表面三次，以去除任何未结合的分析物，然后用氮气吹干电极。接下来，在含有甘氨酸的 PBS 中将抗荧光素 HRP 标记抗体稀释 1000 倍。然后向电极表面加入 60 微升抗体稀释液。

将A-C-S-W-E场施加到电极表面，使抗荧光素HRP抗体与检测探针偶联。用蒸馏水冲洗传感器表面三次，以去除过量的抗体，然后用氮气吹干电极。接着，使用多通道移液器将60微升TMB底物加载到每个传感器表面，并利用电化学电位仪在负200毫伏下测量电极电流，持续60秒。

为了获得三重读数，采用透射电子显微镜检测外泌体是否结合到磁珠上。附着在磁珠上的70至100纳米大小的颗粒与已知的在外电场或去污剂裂解后外泌体的大小一致。在磁珠附近未见明显的外泌体。

通过荧光读出法检测外泌体中的GA DH mRNA。随着时间推移，GA DH的含量在电场或去污剂诱导的外泌体裂解后如预期般减少，表明其暴露于唾液的胞外环境。采用Efim检测注射了表达人源CD63-GFP外泌体标记物的人肺癌细胞的小鼠血清和唾液中外泌体的含量。

20天后，在注射癌细胞的小鼠血清和唾液中均检测到较高水平的CD63 GFP，而在注射生理盐水的小鼠中则未检测到。在进行该操作时，需注意：清洗磁珠以均匀清洗电极表面时，应避免触碰磁珠以吸取足量液体，并正确加载电极上的区域。该技术，即EFIM技术，提供了关键的、尚未满足的能力，用于研究全身性疾病或远端器官如何释放其信息，并在称为外泌体的实体中进行检测与分析。

它们如何进入唾液，进入我们的口腔，并能够捕获外泌体，释放这些分子靶标，从而实现对糖尿病、胰腺癌或其他危及生命的疾病等威胁性疾病的同步检测。观看本视频后，您将充分了解如何快速从生物液体中提取外泌体，如何释放外泌体的内含物，以及如何利用集成电极系统快速分析外泌体的内容物。