Name: 通过电场诱导释放和测量（EFIRM）检测外体生物标志物 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 2 s
Description: 了解利用电场诱导释放和测量技术从生物体液中高效提取外泌体，并通过电化学方法快速分析其RNA和蛋白质货物，以用于疾病生物标志物发现。

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本研究由美国国立卫生研究院下属的国家研究资源中心和国家转化科学促进中心通过资助号 UL1TR000124（授予 FW）提供支持；Felix &amp;#38; 米尔德里德·叶普捐赠教授职位及巴恩斯家族基金（资助 DTWW），美国国家牙科与颅面研究所 &amp;美国国立卫生研究院牙科与颅面研究所资助编号T90DE022734（资助对象：MT）。本内容仅由作者负责，不一定代表美国国立卫生研究院的官方观点。

1. 基于磁珠的外泌体提取
<ol>
	<li>取5 µl充分混匀的链霉亲和素包被磁性微粒溶液，用移液器将其加入装有495 µl磷酸盐缓冲液（PBS）的微量离心管中，以重悬微珠。使用磁力架，用500 µl PBS对微珠洗涤并重悬三次。该磁力架为一个外壳装置，其侧面装有一排磁铁，可固定样品微量离心管。
	<ol>
		<li>每次洗涤时，先将离心管置于磁力架上静置1分钟，然后用移液枪头小心吸除上清缓冲液，避免扰动微珠。</li>
		<li>将离心管转移至无磁铁的普通试管架上。向管中加入500 µl PBS，并用移液器吹打混合溶液与微珠。随后将离心管放回磁力架，再次使微珠与溶液分离。</li>
		<li>重复上述磁力分离与PBS重悬步骤共三次。此过程完成对磁性微粒的初步洗涤。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将微珠重悬于490 µl PBS缓冲液中，离心管置于磁力架的非磁化区域。向微珠混合液中加入5 µl浓度为1.0 mg/ml的生物素化小鼠抗人CD63抗体，用移液器充分混匀微珠与抗体溶液。</li>
	<li>将含有微珠与生物素化抗体混合物的微量离心管置于样品旋转仪上。设置旋转仪参数为往复旋转，倾斜角度90°，持续5秒，振动角度5°，持续1秒。在室温下按此参数旋转样品-微珠混合管30分钟。</li>
	<li>偶联后去除未结合的抗体。
	<ol>
		<li>室温旋转30分钟后，将离心管重新置于磁力架上静置5分钟。</li>
		<li>使用微量移液器吸除液体相，并用500 µl PBS洗涤微珠三次。完成三次洗涤后，将微珠重悬于490 µl酪蛋白-PBS溶液中，并置于磁力架的非磁化区域。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用抗体包被微珠提取外泌体。
	<ol>
		<li>根据目标样品编号标记各离心管。用移液器向微量离心管中加入10 µl血清或唾液样品。通过反复吹打，用移液器充分混匀样品与磁性微珠。</li>
		<li>将含有样品与抗人CD63抗体微珠的离心管置于旋转仪上，在室温下按步骤1.2所述相同参数旋转2小时。</li>
		<li>样品旋转2小时后，进行三次洗涤：通过磁力分离使微珠与溶液分开，用微量移液器去除液体相，并将微珠重悬于500 µl Tris-HCl缓冲液中。此时微珠已结合外泌体，可用于后续电场释放与检测。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 电场诱导释放与外泌体内容物的检测
<ol>
	<li>使用GAPDH引物对电极进行初始预包被
	<ol>
		<li>将一个塑料小室应用于电极阵列上，以防止各个电极之间的交叉污染。本实验使用一个包含16个传感器的电极阵列，阵列中的每个单元电极均由裸金制成的工作电极、对电极和参比电极组成。</li>
		<li>通过移液将储备试剂加入含有超纯去离子水的离心管中，配制含有100 nM DNA探针、0.3 M KCl和10 mM吡咯的储备混合液。充分涡旋混匀。 
		注：本研究选用的DNA探针对应于存在于外泌体中的GAPDH参考基因。所用探针序列为：5'-Biotin-AGGTCCACCACTGACACGTTG-3'。将该混合液用于所有电极。</li>
		<li>将60 µl单体-DNA探针混合液滴加至每个金电极表面。检查电极，确保液体混合物充分覆盖工作电极、对电极和参比电极。</li>
		<li>通过在电极表面施加循环方波（CSW）电场，使单体-探针混合物发生电聚合，在电极表面形成导电聚合物层。该电场包括先施加+350 mV持续9秒，随后立即切换至+950 mV持续1秒。对电极施加该循环方波电场共10个循环，总施加时间为100秒。</li>
		<li>用去离子水冲洗传感器表面3次，并用氮气吹干，以去除电极表面残留液体。确保电极表面液体被彻底清除。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>外泌体内容物释放
	<ol>
		<li>将5 µl浓度为1 µM的检测探针加入495 µl珠-外泌体复合物混合液中，并用移液器混匀。 
		注：检测探针为在3'端偶联了荧光素分子的DNA引物序列。本研究所用检测探针序列对应于外泌体内的GAPDH mRNA。荧光素标记检测探针的序列为：5'-GCAGTGGGGACACGGAAGGCC-Fluorescein-3'。</li>
		<li>将60 µl探针与珠-外泌体复合物混合液滴加至下方装有磁阵列的金电极表面。该磁阵列由16个直径为2.54 mm的钕磁铁组成，排列方式与传感器的工作电极相对应。图2A展示了磁铁与珠-外泌体溶液的布置方式。</li>
		<li>样品加载至电极表面后，施加20个循环的CSW电场（每个循环包括-300 mV持续9秒和+200 mV持续1秒，共200秒）。释放的外泌体内容物将与电极表面的引物发生杂交。若研究目标为外泌体表面标志物，则跳过本实验步骤。图2B展示了该过程。</li>
		<li>用去离子水对电极表面进行三次冲洗，洗去未结合的分析物。用氮气吹干电极。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>报告抗体结合与信号读出
	<ol>
		<li>在酪蛋白/PBS缓冲液中稀释辣根过氧化物酶标记的抗荧光素抗体（HRP，1:1,000稀释），使其终浓度为150单位/毫升，取60 µl加入电极表面。</li>
		<li>通过电场驱动使抗荧光素HRP与探针夹心复合物结合。在电极表面施加-200 mV持续1秒、+500 mV持续1秒，共5个循环。图2A展示了蛋白质和核酸系统中捕获探针与检测探针复合物的形成。</li>
		<li>用去离子水对传感器表面进行三次清洗，并用氮气吹干。</li>
		<li>在洗去未结合的过量抗荧光素抗体后，加入60 µl 3,3',5,5'-四甲基联苯胺（TMB）底物。使用多通道移液器将该底物加载至各传感器表面。</li>
		<li>使用可同时测量16个通道的电化学恒电位仪，在-200 mV电位下测量60秒的电流，进行安培法信号读出。图2C为读出过程中电流曲线的一个示例。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="利用磁场和电化学传感器检测外泌体；分析图显示电流响应。" src="/files/ftp_upload/52439/52439fig2highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2">
图2. EFIRM 方法的组成部分。（A）利用包被抗人CD63的磁性微粒从生物流体中提取外泌体，并通过向粒子-外泌体复合物施加循环方波释放外泌体内容物的方法。（B）用于检测释放的外泌体中RNA/DNA/蛋白质靶标的电极生物传感器示意图。（C）EFIRM 方法的典型安培信号读出结果，其中较大的电流强度对应于更高水平的生物分子。该图来自 Wei et al.14 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52439/52439fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>

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<li>Wei, F., Yang, J., Wong, D. T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+exosomal+biomarker+by+electric+field-induced+release+and+measurement+%28EFIRM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors+and+Bioelectronics%22%5BJournal%5D)">Detection of exosomal biomarker by electric field-induced release and measurement (EFIRM).</a> Biosensors and Bioelectronics. 44, 115-121 (2013).</li>
</ol>

David Wong 是分子诊断公司 RNAmeTRIX Inc. 的联合创始人。PeriRx LLC 从 RNAmeTRIX 获得了与分子诊断相关的知识产权的分许可。David Wong 是 PeriRx 的顾问。

结果表明，包被抗人CD63的磁性纳米颗粒能够特异性捕获大小在70-100 nm范围内的小颗粒。所捕获的颗粒与先前观察到的外泌体特征一致。此外，在捕获颗粒后使用低压循环方波（CSW）可将颗粒从磁珠表面释放，并产生与传统基于裂解缓冲液方法相似的DNA降解谱，从而实现内容物的释放。这些数据表明，通过施加循环方波破坏外泌体脂质膜，可简化外泌体内容物释放的工作流程。该简化方法能够在无需使用可能对外泌体内容物产生不利影响的裂解缓冲液的情况下，实现快速内容物释放。因此，与传统的超速离心法和裂解缓冲液使用方法相比，EFIRM方法似乎是开展外泌体内容物研究的更优选择。EFIRM方法具有高灵敏度、高特异性和操作简便等优点，非常适合从生物液体中提取外泌体，并快速检测其内部的核酸和蛋白质靶标。
将EFIRM方法应用于注射了H460人肺癌细胞的裸鼠模型研究。H460人肺癌细胞 дополнительно 转染了人源CD63-GFP，使外泌体表面标志物CD63具有荧光特性。经过20天后，采集小鼠的血清和唾液样本，并利用EFIRM方法分析其外泌体成分。该研究显示血清与唾液样本之间存在线性相关性（R </...

An erratum was issued for <a href="http://www.jove.com/video/52439">Detection of Exosomal Biomarker by Electric Field-induced Release and Measurement (EFIRM)</a>. The disclosures were updated.

An erratum was issued for <a href="http://www.jove.com/video/52439">Detection of Exosomal Biomarker by Electric Field-induced Release and Measurement (EFIRM)</a>.

Errata: Detection of Exosomal Biomarker by Electric Field-induced Release and Measurement (EFIRM)

外泌体研究是一个新兴的研究领域，旨在研究携带RNA1、DNA2和蛋白质3等分子的脂质微囊泡。以往对外泌体生物学的研究已证实，外泌体存在于血液4、尿液5、母乳6和唾液7等生物流体中。研究表明，外泌体在不同的细胞通路中发挥作用，能够介导机体不同系统之间的远距离细胞间通讯8。由于外泌体在细胞间通讯中的重要作用，人们推测其可能包裹着与疾病状态相关的生物分子靶标（如蛋白质、RNA和DNA）。体外in vitro3研究和动物模型9研究似乎支持这一假说。在以外泌体内容物进行生物标志物发现的研究中，有必要建立一种方法，用于从生物流体中选择性地分离外泌体、诱导外泌体内容物的释放，并对外泌体中的生物分子进行定量分析。在本研究范围内，外泌体被定义为直径约为70–100 nm、并具有表面标志物CD63的结构。
研究人员通常首先通过超速离心法纯化外泌体10，然后使用裂解缓冲液试剂盒处理外泌体内容物。采用裂解缓冲液方法需要数分钟至数小时的孵育时间。该过程可能对外泌体所携带的分子造成损伤，并导致样本降解。例如，通过裂解缓冲液释放到周围细胞外环境中的唾液外泌体RNA，其半衰期不足1分钟，因此在未添加稳定试剂的情况下，裂解后对外泌体RNA进行检测尤为困难11。添加多种裂解和稳定试剂的复合效应可能会引入干扰物质，从而增加外泌体内容物分析的复杂性和干扰性。因此，一种可快速释放外泌体内容物并安全保存其分子 cargo 以供表征的替代方法可能具有重要意义。
在本研究中，我们提出利用非均匀电场来释放外泌体内容物。已知电场具有使形成细胞膜的脂质双分子层极化并破坏其结构的能力。我们的实验工作探索了使用非均匀循环方波（CSW）来破坏外泌体的微囊泡结构并释放其所携带的 cargo。该方法使用的电压在数百毫伏范围内，意味着大多数生物分子不会被破坏。我们证明，循环方波能够促使唾液外泌体中的 mRNA 内容物释放到周围流体环境中。这种外泌体内容物的释放可与电极系统无缝整合，用于定量检测生物标志物的表达水平12,13。该方法实现了对外泌体内容物的快速、高灵敏度且无需裂解缓冲液的分析。
<img alt="外泌体处理示意图：通过生物传感器方法进行提取、货物释放和内容物检测。" src="/files/ftp_upload/52439/52439fig1highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 
图1. EFIRM 工作流程概览。. EFIRM 方法 broadly 分为三个主要阶段，这些阶段对于外泌体的纯化与分析至关重要。
本研究采用基于CSW的外泌体内容物释放与分析方法，并结合CD63特异性磁性微珠进行外泌体分离。这些CD63亲和微珠可实现从唾液样本（及其他生物流体）中选择性分离外泌体。使用磁珠孵育并提取外泌体后，将磁珠转移至电化学传感器系统，以进行基于CSW的内容物释放与分析实验步骤。图1展示了EFIRM方法的工作流程概览。

<table><tbody><tr><td>带芯片接口的Helios 16通道读取系统&amp;nbsp;</td><td>Genefluidics, USA</td><td>&amp;nbsp;RS-1000-16</td><td></td></tr><tr><td>16通道传感器芯片，裸金表面，每包5片</td><td>Genefluidics, USA</td><td>SC1000-16X-B</td><td></td></tr><tr><td>生物素标记的抗人CD63抗体</td><td>Ancell, USA</td><td>215-030</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads MyOne 链霉亲和素T1磁珠</td><td>Invitrogen, USA</td><td>65601</td><td></td></tr><tr><td>钕磁铁（1/10&quot; 直径 × 1/32&quot; 厚度）</td><td>K&amp;J Magnetics, USA</td><td>DH101</td><td></td></tr><tr><td>超纯蒸馏水</td><td>Life Technologies, USA</td><td>10977-023</td><td></td></tr><tr><td>Mettler Toledo 3 M KCl溶液</td><td>Fisher Scientific, USA</td><td>1911512</td><td></td></tr><tr><td>吡咯</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>W338605-100g</td><td></td></tr><tr><td>抗荧光素-POD，Fab片段</td><td>Roche, Germany</td><td>11426346910</td><td></td></tr><tr><td>3,3&amp;prime;,5,5&amp;prime;-四甲基联苯胺底物（TMB/H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;，低活性）</td><td>Neogen, Usa</td><td>330175</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲盐水溶液</td><td>Life Technologies, USA</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>酪蛋白/PBS</td><td>Fisher Scientific, USA</td><td>37532</td><td></td></tr></tbody></table>

电场诱导释放与检测法（efirm）对外泌体生物标志物的检测

Detection of Exosomal Biomarker by Electric Field-induced Release and Measurement (EFIRM)

外泌体是一类在细胞间通讯中起介导作用的微囊泡结构。研究外泌体内部携带的成分，有助于判断其是否含有可用于区分疾病的生物标志物。为了开展外泌体分析，有必要建立一种从目标生物液体中分离和分析外泌体的方法，且该方法需确保外泌体内部内容物不被破坏。
电场诱导释放与检测（EFIRM）是一种用于从生物液体中特异性提取外泌体、释放其内含物并检测其内部RNA/蛋白质含量的方法。首先使用抗人CD63特异性抗体磁性微粒从生物液体中沉淀外泌体。提取后，施加低电压电循环方波（CSW）以破坏囊泡膜并促使内含物释放。外泌体内容物随后与固定在电极表面的DNA引物或抗体杂交，以实现对分子含量的定量检测。
EFIRM 方法在提取外泌体并释放其内含物用于分析时具有优势，无需使用裂解缓冲液。该方法能够对外泌体中的 RNA 和蛋白质生物标志物靶标进行特异性检测。EFIRM 依据外泌体表面标志物特异性地提取外泌体，而非基于尺寸的分离技术。
透射电子显微镜（TEM）和检测分析证明了该方法在外泌体捕获与分析中的功能性。为检测外泌体特征，将EFIRM方法应用于9只注射了人肺腺癌H640细胞（经转染表达外泌体标志物人源CD63-GFP的细胞系）的小鼠的外泌体分析，并与11只接受生理盐水对照的小鼠进行比较。在注射H640细胞的小鼠中，血清和唾液样本均检测到升高的外泌体生物标志物水平（参考基因GAPDH和蛋白表面标志物人源CD63-GFP）。此外，唾液和血清样本显示出良好的线性关系（R = 0.79）。这些结果提示，唾液外泌体生物标志物在远端疾病检测中具有可行性和应用潜力。

使用透射电子显微镜验证外泌体捕获微珠
采用抗人CD63磁珠从唾液中分离外泌体，并通过透射电子显微镜（TEM）图像验证提取方案。TEM显示磁珠周围紧邻70-100 nm的颗粒（见图3A和3B），符合已知的外泌体特征。而在未预先偶联抗人CD63抗体的磁珠中，则未观察到70-100 nm的颗粒（见图3C和3D）。
<img alt="电子显微镜示意图，纳米尺度下的纳米颗粒相互作用，100 nm 尺度，带标注的分析图。" src="/files/ftp_upload/52439/52439fig3highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 3"> 
图 3. 磁性微粒的透射电子显微镜（TEM）图像。...

外泌体是存在于生物体液中的微囊泡结构，可能携带重要的疾病鉴别生物标志物。本文采用一种新方法，通过非均匀电循环方波破坏外泌体后，特异性地提取外泌体，并快速检测其内含的RNA和蛋白质靶标。

电场诱导释放与检测法（EFIRM）对外泌体生物标志物的检测

外泌体是微囊泡结构，在细胞间通讯中起介导作用。研究其内部 cargo 具有重要意义。

本实验的总体目标是从生物流体中高效提取外泌体，释放外泌体内容物，并快速分析其内容物。该过程首先利用带有靶向外泌体标志物抗体的磁性微粒从生物流体中提取外泌体，然后将提取的外泌体加载到电极表面。接着，通过电场裂解外泌体，使外泌体内容物与电极表面的探针发生杂交。同时将报告分子杂交到该系统中。最后一步是在电极表面添加底物溶液，然后通过测量电流获得读数。最终，通过电化学电流测量来显示外泌体样本中核酸或蛋白质的含量。与现有方法（如超速离心法和赖氨酸缓冲液法）相比，该技术的主要优势在于它是一种简单快速的外泌体内容物提取与检测方法。我们对该技术感到非常兴奋，因为这是首次利用efim技术获取器官在疾病状态或正常状态下通过血管系统释放、并进入口腔的信息。该技术使我们能够捕获这些信息，并以灵活的方式同步释放并检测其中的分子成分。这种疾病鉴别信息通常对刚接触该方法的用户具有挑战性，因为如果不谨慎操作，磁性微粒的使用可能较为困难。此外，电化学方法在生物样本分析中的应用对某些人而言可能是一种全新的范式。该方法的可视化演示至关重要，因为磁性微粒的操作和电极加载过程较难掌握。在处理磁性微粒并将其加载到电极上时，必须格外小心。开始重悬时，取含有10微克/毫升链霉亲和素包被的磁性微粒的储存液，加入5微升。将该溶液加入含有495微升PBS的微量离心管中以洗涤微珠。首先，将离心管置于磁力架上静置1分钟，然后小心移除上清液，注意不要扰动微珠。然后将试管转移至非磁性架上。加入500 µL PBS，用PET洗涤磁珠。最终洗涤结束后，重复此步骤共三次。将磁珠重悬于 490 µL PBS 中，然后加入 5 µL 来自 1 mg/mL 储存液的生物素化小鼠抗人 CD63 抗体。通过移液操作程序混合溶液：在样品旋转仪上以 90 度往复旋转 5 秒钟，再以 5 度振动 1 秒钟。将试管放入旋转仪中，在室温下运行该程序 30 分钟。接着，将离心管转移至磁力架上静置五分钟。用500 µL PBS洗涤磁珠三次，然后将其重悬于490 µL含Caine的PBS中。用样本编号标记一个离心管，然后加入10 µL样本，反复吹打混匀，使样本与抗体偶联的磁珠充分混合。接下来，将离心管转移至样品旋转仪中，在室温下运行相同的程序两小时。然后用500微升1摩尔的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液洗涤磁珠三次。利用磁性架，外泌体现在已结合到磁性珠上，以预包被电极。首先将探针、氯化钾和油酸单体的储备试剂用蒸馏水稀释。5′端生物素标记的DNA探针特异性针对GA DH mRNA。通过涡旋振荡混合单体探针溶液。使用一个包含16个传感器的电极阵列，其中每个单元电极由裸金构成的工作对电极和参比电极组成。将一个塑料小室放置在电极阵列上，以防止电极之间的交叉污染。转移60 µL单体探针溶液至金电极表面，使工作对电极和参比电极均被液体覆盖。施加一种称为A-C-S-W-E场的循环方波电场，用于电聚合单体探针。这会在电极表面形成一层导电聚合物。用蒸馏水将传感器冲洗三次，然后用氮气吹干，以去除电极表面的液体。用捕获探针预包被电极后，将5微升1微摩尔的检测探针溶液加入495微升珠-外泌体复合物溶液中，然后通过移液混匀。该探针是一种3'端荧光素标记的DNA引物，特异性针对GA dh。将一个预编码的电极阵列置于由16个磁体组成的磁体阵列上方，磁体位置与传感器的工作电极对齐。然后将60微升珠-外泌体溶液转移至电极表面。施加A-C-S-W-E电场，循环20次。释放的外泌体内容物将与电极表面的探针杂交。用蒸馏水冲洗电极表面三次，以去除任何未结合的分析物，然后用氮气吹干电极。接下来，在含有甘氨酸的 PBS 中将抗荧光素 HRP 标记抗体稀释 1000 倍。然后向电极表面加入 60 微升抗体稀释液。将A-C-S-W-E场施加到电极表面，使抗荧光素HRP抗体与检测探针偶联。用蒸馏水冲洗传感器表面三次，以去除过量的抗体，然后用氮气吹干电极。接着，使用多通道移液器将60微升TMB底物加载到每个传感器表面，并利用电化学电位仪在负200毫伏下测量电极电流，持续60秒。为了获得三重读数，采用透射电子显微镜检测外泌体是否结合到磁珠上。附着在磁珠上的70至100纳米大小的颗粒与已知的在外电场或去污剂裂解后外泌体的大小一致。在磁珠附近未见明显的外泌体。通过荧光读出法检测外泌体中的GA DH mRNA。随着时间推移，GA DH的含量在电场或去污剂诱导的外泌体裂解后如预期般减少，表明其暴露于唾液的胞外环境。采用Efim检测注射了表达人源CD63-GFP外泌体标记物的人肺癌细胞的小鼠血清和唾液中外泌体的含量。20天后，在注射癌细胞的小鼠血清和唾液中均检测到较高水平的CD63 GFP，而在注射生理盐水的小鼠中则未检测到。在进行该操作时，需注意：清洗磁珠以均匀清洗电极表面时，应避免触碰磁珠以吸取足量液体，并正确加载电极上的区域。该技术，即EFIM技术，提供了关键的、尚未满足的能力，用于研究全身性疾病或远端器官如何释放其信息，并在称为外泌体的实体中进行检测与分析。它们如何进入唾液，进入我们的口腔，并能够捕获外泌体，释放这些分子靶标，从而实现对糖尿病、胰腺癌或其他危及生命的疾病等威胁性疾病的同步检测。观看本视频后，您将充分了解如何快速从生物液体中提取外泌体，如何释放外泌体的内含物，以及如何利用集成电极系统快速分析外泌体的内容物。

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基于多重表面等离子体共振成像芯片的多模态分析平台用于细胞外囊泡亚群分析

在此，我们介绍一种简便的实验方案，可实现 体外...

利用流式细胞术追踪miRNA向细胞外囊泡的释放

本文展示了从人体受试者的生物液体（如泪液和唾液）中收集的细胞外囊泡（EVs）的表征方法。该方法所使用的扫描仪能够检测仅1...

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