通过REPLACE方法开发蛋白-蛋白相互作用抑制剂：应用于设计与开发非ATP竞争性CDK抑制剂

该策略的总体目标是通过将一种蛋白质-蛋白质相互作用的肽类抑制剂转化为类似小分子药物的有效治疗剂。首先，建立目标肽-蛋白质相互作用的构效关系，以明确哪些部分可以被有效替代；随后，利用计算化学方法识别已知肽段决定因子的可行片段替代物，进而用于合成一系列片段-肽杂合物文库。

接下来，在这些片段与截短肽之间合成一个杂合分子文库，以生成可在体外实验中进行测试的分子，从而筛选出更具药物特性的分子，并重现天然肽的活性。结果表明，利用该方法能够鉴定出更具药物特性的化合物，这些化合物可作为针对蛋白-蛋白相互作用抑制剂药物发现的有效起点。因此，该技术相较于高通量筛选等现有方法的主要优势在于，从药物发现的角度来看，蛋白-蛋白相互作用极为难以靶向，而传统方法对此效果不佳。

替换策略涉及逐步迭代的方法，因此从长远来看可能耗时更长，但更有可能取得成效。今天，我将亲自演示大部分操作步骤，同时由我的同事 Sandra Craig 博士协助完成部分反应和程序的准备工作。首先需验证对接方案的可靠性，随后按照文本方案中的描述，准备受体结合位点和配体，将配体对接至周期蛋白 A 的沟槽区域。

首先，从受体-配体相互作用方案集中选择配体拟合程序，并将其设置到软件中，使用受体和已准备好的配体作为该方案的输入。在这些运行中，选择PLP one作为能量网格。对接程序所使用的能量网格是用于生成配体-受体相互作用及潜在结合构象的力场。

Plp one 是一种分段线性势能，特别优先考虑氢键相互作用。指定对构象进行能量最小化，并将生成的构象数目设为 10。首次计算时，其余所有参数均保持默认值。

在可视化程序中显示对接构象，然后按PLP one评分的降序进行排序。使用plp、one等打分函数，基于候选配体构象、几何特征及其与靶标受体结构的非共价相互作用，评估对接配体的结合亲和力。对得分最高的前25%构象进行目视分析，判断其与已知封端基团是否存在空间重叠冲突。

同时观察构象是否满足相互作用筛选条件，这些条件设置为包含原子约束，要求具有已知对结合至关重要的分子间接触，和/或要求将潜在的封端基团定位在适合酰胺键形成的正确几何构型中。最后，目视检查构象的互补性，即结合口袋被有效填充，且填充方式与已知的构效关系一致。末端封端基团的合成路线应使用所有商业化起始原料、溶剂和试剂，并通过常规有机合成化学方法进行合成。

通过将起始原料和反应混合物溶解在流动相中，然后使用毛细管将溶解的起始原料和反应混合物点样到硅胶薄层色谱板上，进行薄层色谱（TLC）以监测反应。随后将薄层色谱板放入含有流动相的展开 chamber 中。

当流动相迁移至薄层色谱板的90%位置时，取出色谱板并自然晾干。使用紫外光检测起始原料和反应混合物所形成的可见斑点。随后计算各斑点的比移值（Rf），即斑点迁移距离与流动相迁移距离的比值。

接下来，将反应混合物置于分液漏斗中，根据需要使用水相酸溶液或碱溶液进行洗涤。收集有机溶剂，用旋转蒸发仪蒸发除去溶剂，然后进行干燥。在真空条件下得到的粗产物，取500毫克粗产物溶于3至5毫升合适的溶剂中，再加样至硅胶或RP 18柱上，在空气中干燥前，将含有粗产物的样品加入硅胶反相预装柱中。

使用自动高效快速色谱法纯化粗产物。采用配备梯度洗脱的Snap 100克色谱柱，运行15个柱体积。

使用旋转蒸发仪将从快速柱色谱中收集的溶剂中的纯化产物进行干燥，蒸发至完全除去溶剂。随后在真空条件下进一步干燥产物，以去除所有残留溶剂。按照文本方案中所述，通过核磁共振（NMR）、质谱（MS）和分析型高效液相色谱（HPLC）对纯化产物进行表征，用于合成封端片段、连接的抑制性肽或FLIPS组装体。

通过标准固相合成方法合成肽类化合物末端。将五当量的C端氨基酸溶于两毫升二甲基甲酰胺（DMF）中，加入4.4当量的HBTU活化五分钟。随后加入六当量的N,N-二异丙基乙胺，将混合物于室温下反应一小时，上样至Rink树脂。

使用3毫升含20%INE的DMF溶液处理10分钟，以脱除C端残基上的FM保护基团。随后每一步逐步偶联下一个氨基酸。在2毫升DMF中，使用5当量的下一个氨基酸、6当量的N,N-二异丙基乙胺以及4.4当量的HBTU，反应1小时进行偶联。

室温下，在氨基酸偶联和肽链组装完成后的 FMOC 保护步骤之后进行洗涤循环。肽链组装完成后，在室温下用两毫升 DMF 中的六当量二异丙基乙胺和 4.4 当量 HBTU 处理一小时，以偶联 N 端封端基团。用两毫升裂解液处理反应混合物过夜，以去除侧链保护基团和树脂上的保护基团，然后用冷乙醚沉淀产物；如有必要，将所得固体在旋转蒸发仪中浓缩，过滤后真空干燥，或使用冷冻干燥机进行冷冻干燥。

此时，按照文本方案中所述进行荧光偏振结合实验，以测定竞争性结合。图中显示了H-A-K-R-R-L-I-F结合于周期蛋白结合沟槽的模型结构。该结合沟槽由两个疏水口袋组成，即一个较大的主要口袋和一个较小的次要口袋，二者通过红色所示的酸性残基相连。

其他重要的相互作用包括肽骨架的氢键接触以及肽中三个碱性残基的离子配对相互作用。此处展示了三氟-D-C-P-T-R-L-I-F的结合模式，其与色氨酸217和谷氨酰胺254侧链原子形成氢键，已进行对接显示。三种代表性化合物及其封端基团的结合构象如图所示，这些化合物均与色氨酸217和谷氨酰胺254的相互作用筛选原子形成氢键。如绿色虚线所示，茴香基取代基与次要疏水口袋之间存在范德华相互作用。

观看本视频后，您将更深入地了解如何实施并应用取代策略，即将一种已知的肽类抑制剂转化为更具药物特性的分子，该分子可抑制蛋白质-蛋白质相互作用，并可作为治疗药物开发的起点。