质粒DNA转座子介导整合到新生小鼠的脑室下区，以生成胶质母细胞瘤的新模型
2015年2月22日
在这里，我们描述了一种高效且通用的方案，使用注射到新生小鼠心室的转座子 DNA 来诱导、监测和分析新型胶质母细胞瘤 （GBM）。吸收质粒的脑室下区细胞转化、增殖并产生具有人 GBM 组织病理学特征的肿瘤。
该程序的目标是为胶质母细胞瘤创建新的模型，并最终通过诱导小鼠中携带特定基因突变的胶质母细胞瘤的形成来开发新的治疗方法。这是通过首先创建转座子质粒来实现的，编码特定的目标基因。下一步是用转染试剂制备质粒，并将其注射到新生小鼠的侧脑室中。
然后通过发光监测肿瘤进展中的摄取。当动物数量增加时，它们被处死用于组织学和免疫组织化学分析。因此，在野生型或靶向遗传背景中诱导具有特定遗传改变的新胶质母细胞瘤。
这些肿瘤可以在体内进行研究，也可以在体外用于生成适合使用化疗剂进行生化分析和细胞毒性实验的新细胞系。与其他方法（例如，胶质母细胞瘤细胞系的原位注射）相比，该技术的主要优点是，肿瘤是由内源性细胞恶性转化诱导的，这些细胞使用非常特异性选择的基因改变。这个过程更紧密地再现了人类疾病的病因，并概括了人类 GBM 的突出组织病理学特征。
该方法可以帮助回答神经肿瘤学领域的关键问题，例如负责诱导成人或儿科肿瘤中不同类型的多形性、经典性、神经前神经性、神经性 chy 的驱动突变是什么。自新型化疗以来，该技术的意义延伸到 GPM 的治疗。使用该模型，放射免疫疗法或其组合可以在体内或体外相对快速地进行测试。
当我与我的同事明尼苏达大学的 John 博士讨论时，我第一次有了这种方法的想法，他使用睡美人转座介导的癌基因整合开发了最初的脑肿瘤模型，癌基因是肿瘤抑制基因的抑制剂，可以整合到宿主基因组 DNA 中。我认为这种方法对于研究新突变对肿瘤进展的影响并有助于开发脑癌的靶向疗法将非常有效实验前三到四个星期，设置一个有一雄一雌的小鼠繁殖笼，包括一个彩色塑料冰屋，以丰富环境并增加交配的机会。一旦确认怀孕，就把雄性移走，交配日后 18 天，开始监测雌性分娩。
确保在分娩时有代孕母亲可用。在出生后的第一天，进行脑室内注射。首先用 Ali 制备注射液，引用 20 微升含有转座的质粒 DNA 混合物，终浓度为每微升 0.5 微克 DNA。
接下来，将 20 微升 PEI 溶液等分试样加入 DNA 溶液中，让它们在室温下孵育 20 分钟至一小时，然后将混合物储存在冰上。对于注射针头，将 10 微升注射器连接到 30 号皮下注射针头上，斜面为 12.5 度。然后将注射器连接到具有自动注射功能的微型泵上。
用 10 微升水测试设置，并确保清空注射器。现在，用干冰和酒精的浆液冷却新生儿立体定位阶段。当冷却到 2 到 8 摄氏度之间时，继续注射。
首先将幼犬放在冰上两分钟，麻醉幼犬。当幼犬在冰上时，将注射液装入注射器。麻醉后，将幼犬转移到框架上，并将其头部固定在覆盖纱布的耳杆之间。
检查颅骨的背侧是否水平且平行于框架表面。此外，颅缝应清晰可见。如果幼犬的头部没有足够牢固地固定，它会在注射过程中移动。
而如果它被用力挤压在框架的耳杆之间，lambda 将不可见，头部内的压力会迫使注射的溶液泄漏出来。在幼犬牢牢抓住框架的情况下，用 70% 乙醇擦掉头部，然后放下针头并调整其位置，使其接触 lambda。接下来，抬起针头并横向移动 0.8 毫米，并逐渐移动 1.5 毫米。然后再次降低它，直到它使皮肤略微凹陷。
记录此位置的坐标。然后将针头向下，穿过皮肤和颅骨 1.5 毫米，进入侧脑室的皮层。在 90 秒内注射 0.75 μL，等待一分钟，让溶液在等待期间散开。
可以麻醉下一只要注射的幼崽。负重后，慢慢抬起针头，然后将幼崽转移到加热灯下的恢复位置。从麻醉到升温的时间必须小于 10 分钟。
越快越能更好地监测它的呼吸，如有必要，轻轻摩擦四肢以刺激呼吸。一旦幼犬暖和起来，呈玫瑰色和稳定的呼吸，就把它放回妈妈身边。这通常需要注射后 5 到 7 分钟。
如果注射了几只幼崽，则应在将任何幼崽归还给母亲之前将它们全部恢复。如果半小时后所有幼崽都没有准备好，那么将一半归还给她，然后在手术结束时将其余的归还给她，监测母鼠。归还幼崽后。
如果她对幼崽没有反应，将代孕母亲添加到笼子中。注射后 24 至 72 小时，监测质粒摄取并将所有幼崽转移到六个孔组织培养皿中，每孔一只幼崽。然后在 1 毫升注射器中加入每毫升 30 毫克的 Lucifer 生理盐水或 PBS 溶液，并连接一根 30 号皮下注射针头。
在每只幼犬的肩胛骨之间皮下注射 30 微升溶液，以免伤害幼犬，将溶液注射到一小块皮肤下。立即将幼崽转移到体内生物发光成像系统中。设置一个序列，以一分钟的间隔采集四张连续图像，具有自动曝光、大弯曲和 1 光圈。后。
大约 17 天后，动物可能会开始形成可通过生物发光和组织学检测到的肉眼可见的肿瘤。监测肿瘤也可能需要长达 6 周的时间。用 26 号针头腹膜内注射 100 微升 Luciferian 溶液。
三分钟后，在 ISO 氟氧麻醉室中麻醉动物，并将动物放入装有锥体的成像室中以分散 ISO 氟。以两分钟的间隔采集一系列六张图像，具有自动曝光时间、中等像素融合和一的开放光圈 F 值。感兴趣的区域通常是头部上方的椭圆形，使用相同的设置测量每只动物的发光强度，以表征 SB 诱导的胶质母细胞瘤的组织病理学特征。
C 57 黑色 6 只新生小鼠在 P 1 注射质粒和涂层荧光素酶，结合 NRA S 和 SV 40 大 T 质粒 Inod 转座子与致癌 DNA。或者，将编码短发夹 P 53 的质粒与 PDGF β 和 GFP 报告基因与 NRAS 联合注射。假性苍白坏死很明显，血管周围和弥漫到大脑中也是如此。
薄壁胶质母细胞瘤也用生物发光监测。动物通常屈服于肿瘤负荷。当发光强度达到 10 到 7 到 10 到 9 时校准单位。
可以预见的是，动物的中位生存率取决于注射到新生儿大脑的致癌转座子的组合。NRS 诱导最具侵袭性的肿瘤，SV 40 大 T 抗原新发肿瘤的特征性分子表达以此为特征。表达 SHP 53 诱导的 GFP 的新生肿瘤和 nras 表达神经干细胞标志物 neston，有些还表达胶质纤维酸性蛋白。
56 天后，发现一个肿瘤被许多 GFAP 阳性星形胶质细胞包围。这些肿瘤细胞表达 nein 但不表达 GFAP。看完这个视频，你应该对如何诱导胶质母细胞瘤的形成有一个很好的了解，通过脑室内注射到新生小鼠体内来携带特定的基因突变，以及如何用生物发光监测疾病的进展。
在本文中，您将找到有关如何轻松克隆新的反式前质粒、编码目标基因以及如何监测肿瘤并使用组织学和免疫组织化学对其进行分析的详细信息。此外，您将找到有关如何从具有基因工程肿瘤的动物中生成新的胶质母细胞瘤细胞系的详细方法。我们希望这篇文章将有助于加快发现针对这种毁灭性人类疾病的新疗法。
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概述
本文介绍了一种使用转座子DNA诱导和分析新生小鼠脑胶质母细胞瘤（GBM）的协议。该方法允许监测肿瘤进展并研究与GBM相关的特定遗传突变。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 肿瘤学
- 遗传学
背景
- 脑胶质母细胞瘤是具有不良预后的侵袭性脑肿瘤。
- 目前用于研究GBM的模型在模拟人类疾病方面的能力有限。
- 转座子技术提供了一种在体内引入遗传改变的方法。
- 了解GBM的遗传基础可以导致新的治疗策略。
研究目的
- 开发新的小鼠脑胶质母细胞瘤模型。
- 研究特定遗传突变对肿瘤形成的影响。
- 加强对GBM生物学的理解以促进治疗开发。
使用的方法
- 创建编码感兴趣基因的转座子质粒。
- 通过侧脑室注射将质粒转染到新生小鼠中。
- 使用发光成像监测肿瘤进展。
- 在处死后进行组织学和免疫组化分析。
主要结果
- 成功诱导具有特定遗传改变的脑胶质母细胞瘤。
- 表征显示出与人类GBM相似的组织病理特征的肿瘤。
- 展示了使用转座子技术进行GBM研究的可行性。
- 对肿瘤微环境和进展机制的洞察。
结论
- 该协议为在受控环境中研究脑胶质母细胞瘤提供了可靠的方法。
- 研究结果可能有助于GBM靶向治疗的开发。
- 该模型可用于进一步的遗传学和药理学研究。
常见问题
Executive Industry Relevance
This transposon-mediated GBM model enables target validation by inducing specific oncogenic mutations in immunocompetent neonatal mice, recapitulating human disease etiology. The approach supports mechanistic de-risking through bioluminescence monitoring and histopathological confirmation, providing predictive confidence for therapeutic screening. It positions as a preclinical tool for lead identification and portfolio triage in neuro-oncology drug development.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by testing driver mutations like NRAS and SV40 large T antigen in glioma pathogenesis.
- Operational Value: Enables functional target validation via inducible tumor formation in wild-type or targeted genetic backgrounds.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by correlating specific transposon combinations with tumor aggressiveness and survival outcomes.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates luciferase-expressing tumors for quantitative bioluminescence readouts to monitor progression and treatment response.
- Operational Value: Standardizes tumor induction through controlled plasmid concentration and ventricular injection parameters.
- Assay Readiness: Produces reproducible in vivo models suitable for compound screening and cytotoxicity testing.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Recapitulates histopathological features of human GBM including pseudo-palisading necrosis and perivascular invasion.
- Biomarker Alignment: Enables correlation of genetic constructs with molecular markers like nestin and GFAP in tumor cells.
- Preclinical Utility: Facilitates derivation of primary GBM cell lines for biochemical analysis and chemotherapeutic screening.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical efficacy testing in neuro-oncology.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of oncogenic drivers via transposon-mediated gene delivery to the subventricular zone.
- Screening: Enables assay development through bioluminescence-based tumor monitoring for longitudinal tracking.
- Analytics: Provides quantitative luminescence measurements and histopathological endpoints for comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects to preclinical work via derivation of cell lines amenable to in vitro drug testing.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for testing multiple genetic combinations in immunocompetent models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by inducing tumors with defined genetic alterations in a physiologically relevant context.
- Operational Value: Offers standardization through plasmid preparation, injection coordinates, and luminescence monitoring protocols.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling rapid in vivo testing of chemotherapeutics, radiation, or immune therapies.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted advancement by linking specific transposon profiles to survival endpoints and tumor phenotypes.
Implementation Considerations
- Requires expertise in neonatal mouse handling, stereotaxic injection, and transposon molecular biology.
- Depends on instrumentation including micro pumps, stereotactic frames, and bioluminescence imaging systems.
- Necessitates cross-team standardization for plasmid preparation, injection volume, and post-operative care procedures.
- Involves adaptation considerations for different genetic constructs and mouse backgrounds.
- Limited by the technical precision required for ventricular injection and the variability in tumor latency and penetrance.
