Name: 质粒DNA转座子介导整合到新生小鼠的脑室下区，以生成胶质母细胞瘤的新模型 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 58 s
Description: 了解利用转座子质粒DNA通过侧脑室注射整合到新生小鼠体内，以诱导携带特定基因突变的胶质母细胞瘤形成的方法。该技术可用于监测肿瘤进展并进行组织学分析，为神经肿瘤学研究提供可靠的疾病模型。

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我们感谢 John Ohlfest 博士和 Stacey Decker 博士13慷慨提供质粒并为我们掌握本方法提供了培训。感谢 Marta Dzaman 在标准化石蜡包埋切片的苏木精-伊红染色流程方面给予的帮助。同时感谢 Molly Dahlgren 审阅本文稿并提出有益建议。本研究得到美国国立卫生研究院神经疾病与中风研究所（NIH/NINDS）向 MGC 和 PRL 提供的资助、Leah’s Happy Hearts 基金会向 MCG 和 PRL 提供的资助、Alex’s Lemonade 基金会青年研究者奖以及 St. Baldrick’s 基金会博士后奖学金对 CK 的支持。

注意：所有动物实验方案均已获得密歇根大学动物使用与护理委员会（UCUCA）的批准。
1. 将目的序列克隆至新型睡美人转座子中
注意：若要使用睡美人转座酶系统插入基因或抑制元件（如 shRNA），请将目的序列克隆至 pKT 或 pT2 质粒的骨架中。设计克隆方案时，应确保调控元件、目的基因和标记基因仍位于反向重复序列（IR/DR）之间。下文详细描述了将 PDGFβ 克隆至 pKT 骨架中的一个示例（另见图1b）。
<ol>
	<li>在50 µl反应体系中，加入5–10单位XbaI/XhoI限制性内切酶，于37 °C孵育4小时，消化5 µg质粒载体pKT-IRES-Katushka。</li>
	<li>在50 µl反应体系中，加入5–10单位NcoI/SacI限制性内切酶，于37 °C孵育4小时，消化5 µg pGEM-T-mPDGFβ质粒中的mPDGFβ cDNA。</li>
	<li>向总DNA中加入2.5倍体积的100%乙醇和1/10体积的3 M乙酸钠（pH 5.8），混匀后于-20 °C过夜孵育以沉淀DNA。</li>
	<li>将样品在13,800 × g离心15分钟。</li>
	<li>用500 µl 70%乙醇洗涤DNA沉淀，在13,800 × g离心1&#160;分钟，重复一次，最后将DNA重悬于19 µl无菌无DNase的水中。</li>
	<li>按照Quick Blunting试剂盒的说明书操作，对载体（pKT-IRES-Katushka）和插入片段（mPDGFβ）进行末端补平处理。</li>
	<li>将补平后的载体和插入片段加载至含溴化乙锭的1.2%琼脂糖凝胶上，80 V电泳40分钟。观察条带后，用洁净的刀片切下目标条带，并使用凝胶回收试剂盒按照制造商说明书纯化DNA。</li>
	<li>将步骤1.7中纯化的插入片段与载体DNA按4:1的摩尔比（插入片段:载体）加入同一离心管中。加入1 µl T4 DNA连接酶和2 µl含ATP的T4 DNA连接酶缓冲液，用无菌水调整总体积至20 µl。于16 °C孵育连接反应18小时。</li>
	<li>将连接产物转化至化学感受态DH5α大肠杆菌细胞中。
	<ol>
		<li>将感受态细胞置于冰上解冻。</li>
		<li>将全部连接反应产物加入50 µl感受态细胞中，轻轻混匀后冰上孵育30分钟。随后在42 °C热激45秒，立即放回冰上，继续冰上孵育2分钟。</li>
		<li>向转化体系中加入950 µl LB液体培养基，于37 °C振荡培养1小时。以2,400 × g离心3分钟，弃上清，将菌体沉淀重悬于200 µl LB培养基中。</li>
		<li>将转化后的菌液涂布于含有相应抗生素的LB-琼脂平板上，于37 °C过夜培养。</li>
		<li>最后挑取5–10个单菌落，接种于含抗生素的5 ml LB液体培养基中，于37 °C过夜培养。</li>
		<li>按照制造商说明书，使用质粒DNA小提试剂盒提取质粒DNA。进行诊断性限制性酶切以确认插入片段正确插入载体，并将阳性克隆送测序，验证插入片段方向正确。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>筛选正确克隆，并使用高质量、无内毒素的质粒提取试剂盒扩大质粒DNA的制备量。</li>
	<li>用无菌水或1 mM Tris-HCl洗脱DNA，于-20 °C保存，待用于新生小鼠注射。</li>
</ol>
2. 新生儿脑室内注射
<ol>
	<li>实验前3至4周，设置一个包含一只雄鼠和一只雌鼠以及一个彩色塑料小屋的鼠类繁殖笼。这可提供丰富的环境，并有助于交配过程。</li>
	<li>确认怀孕后，将雄鼠移至新笼中。交配后第18天起，每日观察笼内情况以监测分娩。在出生后第1天（P1）进行脑室内注射。</li>
	<li>注射液的制备 
	注意：注射液通过将质粒DNA与转染试剂混合形成转染颗粒而制得。以下示例说明如何制备注射液，所用质粒包括编码Sleeping Beauty转座酶和荧光素酶的pT2/SB100x-Luc，以及两个转座子质粒：pT/CAGGS-NRASV12和pT/CMV-SV40-LgT，三者比例为1:2:2。所有质粒浓度均为2 µg/µl。有关注射液制备的重要细节见讨论部分。
	<ol>
		<li>通过加入以下成分制备DNA溶液：pT2/SB100x-Luc 4 µg（2 µl）、pT/CAGGS-NRASV12 8 µg（4 µl）、pT/CMV-SV40-LgT 8 µg（4 µl）以及10 µl 10%葡萄糖，最终体积为20 µl，DNA浓度为1 µg/µl，葡萄糖浓度为5%。</li>
		<li>通过加入2.8 µl in vivo jet PEI、7.2 µl无菌水和10 µl 10%葡萄糖制备PEI溶液，最终葡萄糖浓度为5%。</li>
		<li>将PEI溶液加入DNA溶液中，混匀并涡旋，室温（RT）静置20分钟。此时溶液即可用于注射。室温放置超过一小时后，需将溶液置于冰上保存。</li>
		<li>将配备30号针头（12.5°斜面）的10 µl洁净注射器安装至微泵（图2 #1）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>为验证注射系统功能正常，使用自动注射器（图2 #1）吸取10 µl水进入注射器，然后完全排空。</li>
	<li>用干冰与酒精混合物冷却新生鼠立体定位仪（图2 #3），使其温度降至2–8°C。</li>
	<li>将幼鼠置于湿冰上2分钟以诱导麻醉。在后续操作过程中，麻醉作用将在冷却的立体定位架上持续维持。保持支架温度在冰点以上、2–8°C之间，可防止热损伤。作为特别预防措施，可在将幼鼠置于湿冰前用纱布包裹。</li>
	<li>用DNA/PEI溶液填充注射器。</li>
	<li>将幼鼠头部置于覆盖纱布的耳杆之间，固定于立体定位架中（图2b）。确保颅骨背侧水平，与支架表面平行，且颅缝清晰可见。用70%乙醇擦拭头部。</li>
	<li>降低注射器针头，调节立体定位坐标，使用立体定位架上的旋钮，直至针头接触lambda点&#160;（顶骨与枕骨中线交点）（图2b）。</li>
	<li>抬起针头，调节立体定位坐标至lambda点外侧0.8 mm、头侧1.5 mm处&#160;（图2b）。</li>
	<li>降低针头直至接触皮肤并轻微凹陷。测量坐标后，再将针头下降1.5 mm。此时针头将穿透皮肤和颅骨，穿过皮层进入侧脑室（图2c）。</li>
	<li>使用自动注射器以0.5 µl/min的速度注入0.75 µl DNA/PEI溶液。</li>
	<li>将幼鼠继续留在支架上约1分钟，使溶液在脑室内充分扩散。在此期间，可将另一只幼鼠置于冰上麻醉2分钟，为下一次注射做准备。</li>
	<li>缓慢轻柔地提起针头，将幼鼠置于加热灯下。监测其呼吸和活动情况。如有必要，轻轻刺激四肢直至出现首次呼吸。</li>
	<li>待幼鼠体温恢复、肤色转为红润、呼吸规律且活动正常后（通常需5–7分钟），将其归还母鼠。若同时注射多只幼鼠，应将所有幼鼠集中在一起，直至全部注射完成。若注射过程超过30分钟，应在前30分钟结束后先归还一半幼鼠，其余在操作结束时归还。</li>
	<li>监测母鼠是否对幼鼠有反应并表现出哺育行为。如有需要，可在笼中添加代孕母鼠。</li>
	<li>确保幼鼠从置于冰上到移至加热灯下的时间少于10分钟。操作越迅速，存活率越高。通常，麻醉和注射一只幼鼠所需时间为4分钟。</li>
</ol>
3. 肿瘤形成与进展的生物发光监测
3.1）注射后质粒摄取的监测
<ol>
	<li>注射后24-72小时，将所有仔鼠从母鼠笼中取出，放入6孔无菌细胞培养皿中，每孔一只仔鼠。</li>
	<li>配制浓度为 30 mg/ml 的荧光素溶液，溶解于生理盐水或磷酸盐缓冲液中。提前配制该溶液，并分装成小份后于 -20 °C 保存。</li>
	<li>使用配备30号皮下注射针头的1 ml注射器，在幼鼠肩胛骨之间皮下注射30 µl荧光素。注射前轻轻捏起皮肤并稍抬起，以确保针头不会刺入任何器官。</li>
	<li>立即成像，使用一个 体内 生物发光成像系统。对于 IVIS Spectrum，采集时使用以下设置：自动曝光、大像素合并（large binning）和光圈 f = 1。</li>
</ol>
3.2）监测肿瘤的形成与进展
注意：动物将在注射致癌质粒后2½至6周内开始形成可通过生物发光和组织学检测到的肉眼可见肿瘤，具体时间取决于所注射的致癌质粒。
<ol>
	<li>使用配备26号针头的1 ml注射器，向腹腔内注射100 µl浓度为30 mg/ml的荧光素溶液。</li>
	<li>将动物放入麻醉室中。可同时对最多五只动物进行注射。</li>
	<li>等待5分钟&#160;后，启动氧气/异氟烷气流（异氟烷浓度为1.5–2.5%），以麻醉动物。3–4分钟后，将动物从麻醉室中取出，并在生物发光成像室中开启氧气/异氟烷气流。将动物放入配备玻璃鼻罩的相应插槽中，以维持麻醉状态并确保光线无遮挡通过。</li>
	<li>通常以自动曝光时间、中等像素合并（binning）和f = 1的开放光圈设置，每隔2分钟采集一组共6幅图像。</li>
	<li>为所有成像动物设定感兴趣区域（ROI），通常为头部区域的椭圆形区域，并使用校准后的单位（光子数/s/cm2/sr）测量发光强度。</li>
	<li>记录每只动物的最大值。随后可在肿瘤进展过程中对同一只动物不同时点的记录进行比较，或在不同动物之间进行比较，例如在采用不同治疗方法的情况下。</li>
</ol>
4. 新发胶质母细胞瘤的组织学与免疫组织化学分析
注意：&#160;当肿瘤达到预定的实验时间点时，可处死动物，灌注并固定脑组织，随后进行分析。对于生存分析，濒死状态即为实验终点，此时应根据动物出现肿瘤负荷的早期临床症状（如活动能力受损、蜷缩姿势和毛发蓬乱）进行人道处死。以下简要描述所用的标准组织学和免疫组织化学方法。
4.1）灌注与固定
<ol>
	<li>通过腹腔注射给予小鼠 100 mg/kg 的氯胺酮和 10 mg/kg 的赛拉嗪进行麻醉。</li>
	<li>通过轻捏小鼠足部检查其足底反射。当该反射消失，表明已进入深度麻醉状态，此时用针将小鼠固定在解剖板上，打开腹腔，分离膈肌并打开胸腔以暴露心脏。</li>
	<li>将一根钝头的 20 号套管插入心脏左心室。将套管通过一段塑料管连接至蠕动泵，并进一步连接至盛有含氧且肝素化的台氏液（0.8% NaCl、0.0264% CaCl2·2H2O、0.005% NaH2PO4、0.1% 葡萄糖、0.1% NaHCO3、0.02% KCl）的容器。调节蠕动泵速度，使台氏液缓慢而稳定地流动，流速约为每秒一滴或更慢（若动物体型较小）。</li>
	<li>在心脏右心房处做一小切口，以便血液和台氏液排出。</li>
	<li>通过观察内脏器官（尤其是肝脏和肾脏）因血液清除而变得苍白，来监测灌注效果。</li>
	<li>当从心脏流出的液体变澄清后（3–5 分钟），将灌注液由台氏液更换为 4% 多聚甲醛进行固定（4% PFA，磷酸盐缓冲液配制，pH 7.34）。</li>
	<li>通过观察颈部和尾部组织硬度增加来判断组织固定良好。</li>
	<li>将小鼠断头，并小心地从颅骨中分离出脑组织。
	<ol>
		<li>将覆盖颅骨的毛皮向前（朝向鼻部）拉紧，并牢固夹住以稳定头部，使背侧朝上。</li>
		<li>使用锋利的手术刀沿眼眶边缘向下切割，横断眼眶肌肉及下方的颧弓。</li>
		<li>将头部翻转为腹侧朝上，使用咬骨钳去除附着的颈部肌肉。压碎第一颈椎并将其从脑干处移除。</li>
		<li>观察耳蜗位置，用咬骨钳夹住其上方的颞骨，在颞骨与枕骨之间制造开口，然后将枕骨从小脑表面剥离。</li>
		<li>用咬骨钳压碎鼻部上方的颅骨，小心地从脑表面移除剩余的额骨和顶骨，注意避免损伤脑表面，尤其注意眼眶区域。</li>
		<li>将头部翻转为腹侧朝上，此时脑组织会从颅骨残余部分滑出，仅通过脑神经相连。使用小型剪刀剪断嗅神经、视神经和三叉神经，即可完全释放脑组织。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将脑组织置于 4% 多聚甲醛中，在 4 °C 下过夜以进行后固定。</li>
	<li>如需进行组织学分析及苏木精-伊红染色，将脑组织转移至磷酸盐缓冲液中浸泡 24 小时，随后进行石蜡包埋。</li>
	<li>如需进行免疫组织化学分析，将脑组织转移至含 30% 蔗糖的磷酸盐缓冲液中，浸泡 24–48 小时（直至脑组织完全沉降至管底）。</li>
	<li>沿肿瘤区域中线将脑组织切成两半，将切面朝下放入冷冻模具中，用冷冻包埋介质（OCT 化合物）包埋，随后在干冰-乙醇混合物、干冰-异戊烷混合物或液氮中快速冷冻。将冷冻组织块保存于 -80 °C，直至切片和染色。</li>
</ol>
4.2）对石蜡包埋的脑组织进行苏木精-伊红染色，以进行内在性胶质母细胞瘤的组织病理学分析
<ol>
	<li>将石蜡包埋的脑组织切成 4 µm 厚度的切片，放入 42 °C 水浴中展片，然后贴附于玻璃载玻片上。</li>
	<li>将载玻片置于 60 °C 烤箱中 10 分钟以脱蜡，随后每隔 5 分钟依次转移至三个盛有二甲苯的切片容器中，完成脱蜡处理。</li>
	<li>通过一系列乙醇溶液水化切片：100% 乙醇中浸洗 2 分钟，重复一次；95% 乙醇中 2 分钟，重复一次；70% 乙醇中 2 分钟，然后将切片转移至水中。</li>
	<li>将切片浸入盛有 Harris 苏木精染液的容器中染色 2 分钟。</li>
	<li>用自来水冲洗，直至水流清澈。</li>
	<li>将切片浸入蓝化液（0.1% 碳酸氢钠）中两次。</li>
	<li>让切片在自来水中静置 2 分钟，然后转移至 80% 乙醇中 2 分钟。</li>
	<li>将切片浸入盛有伊红染液的容器中染色 5 分钟。</li>
	<li>通过一系列乙醇溶液脱水：80% 乙醇浸洗 3–4 次，95% 乙醇中 2 分钟，重复一次，100% 乙醇中 2 分钟，重复一次。</li>
	<li>用三份连续的二甲苯溶液透明处理，每次 3 分钟。</li>
	<li>使用基于二甲苯的封片介质封片，并在室温下平坦表面晾干，直至可进行成像。于室温保存。</li>
</ol>
4.3）冷冻保存包埋脑组织的免疫组织化学用于分子与细胞特征分析 从头合成 诱导型胶质母细胞瘤
<ol>
	<li>从-80 °C冰箱中取出冷冻组织块，置于冷冻切片机中，平衡温度30分钟。</li>
	<li>切取12-14 µm厚的切片，将2-3个切片贴附于带正电荷的玻片上。连续切片时，将相邻切片收集于不同的玻片上，以便在肿瘤内相邻组织切片上使用不同抗体进行染色。</li>
	<li>切片后将载玻片置于干燥器中干燥至少1小时，以确保组织良好贴附。</li>
	<li>在载玻片两端使用疏水性标记笔创建疏水屏障，以使液体能够覆盖组织切片并在洗涤过程中保留在载玻片上。用含0.1% Triton-X的磷酸盐缓冲盐水（PBS 0.1% Tx）溶液覆盖切片，置于水平摇床上轻柔振荡5分钟，以通透组织。重复此步骤两次。</li>
	<li>用10%正常山羊血清（或与二抗同源动物的血清）溶液在轻柔振荡条件下封闭非特异性结合位点，孵育30分钟</li>
	<li>在含2%正常山羊血清的PBS 0.1% Tx中配制一抗溶液，将溶液滴加至切片上。将载玻片置于避光的湿盒中，室温孵育过夜。</li>
	<li>次日，用含0.1% Tx的PBS缓冲液将切片洗涤3次，每次5分钟，然后在含2%正常山羊血清和0.1% Tx的PBS缓冲液中加入荧光标记的二抗，室温孵育1小时。</li>
	<li>用含 0.1% Tx 的 PBS 洗涤切片 3 次，每次 5 分钟，用核染料复染（例如，DAPI）染色2分钟，再次洗涤，用水清洗并用基于水的封片剂封片，以保持荧光信号。将载玻片置于平坦表面，在避光条件下静置至少24小时，待完全固化后进行成像。之后于4 °C保存。</li>
</ol>
5. 具有特定基因改变的原代肿瘤细胞系的建立。
<ol>
	<li>从携带肿瘤的Sleeping Beauty小鼠中建立细胞系时，选择经确认具有较大肿瘤（生物发光信号强度为10）的小鼠7-108 光子/秒/厘米²2/sr</li>
	<li>使用过量异氟烷麻醉剂处死小鼠，将动物断头后小心地从颅骨中分离脑组织（如第4节所述）。将脑组织置于干净的培养皿中。</li>
	<li>使用剃须刀片，在肿瘤的前部和后部进行冠状切面切割。由于脑组织具有透明性，肿瘤的位置通常可以辨认。</li>
	<li>用精细镊子分离肿瘤组织（通常直径为5-7 mm），放入装有300 µl神经干细胞培养基（NSC培养基：含B-27添加剂、N2添加剂和Normocin的DMEM/F12培养基，另加入浓度均为20 ng/ml的人重组EGF和bFGF）的1.5 ml离心管中。</li>
	<li>用与管壁贴合的塑料研杵轻轻匀浆肿瘤组织。</li>
	<li>加入1 ml无酶组织解离液，37 °C孵育5 min。</li>
	<li>将细胞悬液通过70 µm细胞滤网，用10 ml NSC培养基洗涤滤网，300 x g离心4分钟，弃上清，将沉淀重悬于7 ml NSC培养基中。</li>
	<li>接种至T25培养瓶中，在37 °C、含95%空气和5% CO₂的组织培养孵箱中进行培养23天后，部分细胞死亡，部分细胞贴壁附着于培养皿底部，另有部分细胞形成神经球，在培养基中自由漂浮。</li>
	<li>去除这些悬浮细胞，并重新接种至T75细胞培养瓶中。</li>
	<li>再培养三天后，收集神经球，按照步骤5.6所述方法进行解离，经细胞滤网过滤后计数细胞。将细胞分装，用含10% DMSO的胎牛血清冷冻保存。以每14 ml神经干细胞培养基（NSC）接种一百万个细胞的密度传代至T75培养瓶中，培养基需添加EGF和FGF。细胞生长速率取决于用于诱导肿瘤的癌基因。需调整细胞培养条件，防止过度生长，并维持相对较高的细胞密度。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突披露。

本文中，我们详细介绍了一种利用SB转座酶介导的致癌质粒DNA整合至新生小鼠脑室下区周围细胞，从而建立胶质母细胞瘤（GBM）新模型的通用且可重复的方法。我们提供了一种构建携带新目的基因的转座子质粒的实验方案，并展示了如何在活体动物中监测肿瘤进展，以及如何对这些肿瘤进行组织病理学和免疫组织化学特征分析。
由于我们的实验室 (图3）及其他人员13 已表明，该模型能够稳定地产生具有人类胶质母细胞瘤（GBM）典型特征的肿瘤，包括：（1）假栅栏样坏死，（2）血管增生，（3）核异型性，（4）异常有丝分裂，以及（5）血管周围和弥漫性浸润。使用新生小鼠在操作上具有优势，技术流程相对简便，所需设备少，且麻醉与恢复时间短，可快速生成携带特定基因改变的大样本量肿瘤。这些肿瘤会导致动物因肿瘤负荷而死亡，中位生存期可预测，并取决于所诱导的基因改变。最后，SB模型已被用作治疗干预的筛选平台，用于评估治疗反应。24.
在制备用于新生小鼠注射的溶液时...

多形性胶质母细胞瘤（GBM）是成人中最常见的原发性脑肿瘤（占60%），在采用手术、放射治疗和化学治疗联合治疗时，其中位生存期为15至21个月。1胶质母细胞瘤（GBM）亟需新的治疗方法。实验性疗法必须在能够充分再现人类疾病关键特征的动物模型中进行测试。在啮齿类动物中诱导GBM的策略包括使用烷化剂进行化学诱变、生殖系或体细胞遗传修饰，或利用胶质瘤细胞系进行移植。2最常用的模型采用胶质瘤细胞系移植, 可将同基因型细胞原位植入动物脑内，或皮下接种；也可将异种细胞（最常用的是人胶质母细胞瘤细胞系）植入免疫缺陷小鼠。3异种移植模型在研究颅内肿瘤方面具有诸多优势：便于重复、生长速率标准化、死亡时间可预测以及肿瘤定位明确。然而，这些模型也存在局限性，主要源于植入过程中所采用的人工侵入性手术方法，且难以准确再现人类胶质母细胞瘤（WHO IV级）的典型组织学特征，包括假栅栏样坏死、核异型性、弥漫性浸润、微血管增生以及肾小球样血管异常的形成。4-7通过使用致癌DNA（如病毒载体）改变体细胞基因组来诱导胶质母细胞瘤8-12或通过转座子介导的整合13，更贴近人类疾病的病因学，并重现了人类胶质母细胞瘤的组织病理学特征。
历史上，中枢神经系统（CNS）肿瘤的分类依据是其被认为起源于的细胞类型，而这种起源细胞类型被观察到可作为生存期的预测因素14。胶质母细胞瘤（GBM）分为原发性和继发性两类。当前不断积累的证据表明，原发性胶质母细胞瘤具有高度异质性15。继发性GBM（占15%）由低级别星形细胞瘤（WHO I级）和间变性星形细胞瘤（WHO II级）恶性转化而来，通常与较早发病、预后较好以及“前神经型”基因表达模式相关；而原发性GBM（占85%）则表现为发病较晚、预后较差，并呈现胶质（经典型）、神经型或间充质型的基因表达模式。这些基因表达模式是否真正对应肿瘤的实际起源细胞，目前仍在深入研究中。越来越多的数据表明，与GBM相关的遗传突变组合可用于预测患者生存期。例如，染色体1p/19q的杂合性缺失（LOH）、IDH1突变、PDGFRα扩增等特征与继发性GBM、前神经型表达模式及较好预后相关；而EGFR过表达、Notch通路和Sonic hedgehog通路的激活、Nf1和PTEN缺失以及p53突变则与神经型、经典型或间充质型的原发性GBM及较差预后相关16,17。随着大规模测序项目的开展以及可用于检测的大量患者样本的积累，关于GBM发病机制和进展过程中涉及的遗传突变与信号通路的信息日益丰富，个体化医疗的可能性也随之增加——即治疗方案可根据患者的遗传异常情况进行精准定制。最终，为了系统性地评估这些突变和通路的预测价值，并在每种情况下测试潜在的治疗方法，需要建立携带预先设定的遗传改变的GBM动物模型。转座子介导的基因组DNA整合为此提供了一种可行的技术途径。
睡美人转座子系统属于Tc1/mariner 类转座子，是通过多位点特异性突变从一种超过一千万年前已进入休眠状态的鲑鱼样转座酶基因中“唤醒”（构建）而来18,19。本质上，由特定序列（反向重复/直接重复：IR/DR）所侧翼的DNA转座子可在睡美人转座酶的作用下以“剪切-粘贴”的方式整合到基因组中。转座酶识别IR序列的末端，将转座子切除并随机插入另一DNA位点中位于T和A碱基之间的位置，而在转座过程中，T和A碱基会在转座子两端发生重复（图1a）。睡美人转座酶由三个结构域组成：转座子结合域、核定位序列以及催化结构域。需要四个转座酶分子共同作用，将转座子的两个末端拉近，从而完成转座；然而，若转座酶分子过多，则可能形成二聚体或四聚体，进而抑制转座反应20。高效的转座反应依赖于转座酶与转座子之间的最佳比例。编码转座酶的DNA可与转座子共位于同一质粒上（顺式，in cis），也可位于不同的质粒上（反式，in trans）。为确保转座酶与转座子之间的最佳比例，可选择具有适当活性的启动子来驱动转座酶的表达（适用于“顺式”模型），或优化注射溶液中两种质粒的比例（适用于“反式”模型）。睡美人转座子系统已成功应用于功能基因组学、插入突变、转基因技术以及体细胞基因治疗21。作为一种人工合成构建体，睡美人转座酶由一种无活性的鲑鱼样变异体重新改造为功能性分子，因此不会与人类或其他哺乳动物体内的其他转座子结合20。自发现以来，通过分子工程对SB转座子系统的IR序列进行改造，并在转座子两侧添加TATA二核苷酸，显著提高了其转座效率，由此产生了pT2转座子。这些转座子优化了SB转座酶对IR位点的结合能力，并增强了切除效率。SB转座酶本身也经历了重大改进；本研究中所使用的转座酶为SB100X，这是一种通过DNA改组策略结合大规模哺乳动物细胞遗传筛选获得的超活性转座酶22。
本报告中，我们介绍了一种快速、多功能且可重复的方法，通过非病毒性转座子介导的质粒DNA整合，将质粒DNA导入新生小鼠脑室下区细胞，从而在小鼠体内诱导产生内源性胶质母细胞瘤（GBM）23。我们提供了一种简便的方法，利用“睡美人”（Sleeping Beauty）转座酶构建可进行基因组整合的携带新基因的转座子，并展示了如何利用生物发光技术监测质粒的摄取及疾病进展。此外，我们对该模型所复制出的GBM的组织学及免疫组织化学特征进行了表征。同时，我们还介绍了一种从这些肿瘤中快速建立原代GBM细胞系的方法。该“睡美人”模型通过动物自身原有细胞诱导肿瘤，可实现对候选GBM基因在肿瘤发生与进展中功能的评估。该系统也适用于在免疫功能正常的小鼠中测试新型GBM治疗方法，包括免疫疗法，且无需进行可能改变局部微环境的侵入性炎症手术操作。

<table><tbody><tr><td>适用于大鼠和小鼠适配器的 Stoelting 实验室标准脑立体定位仪</td><td>Stoelting</td><td>51670</td><td>其他公司也生产类似的框架，任何带有小型小鼠适配器的产品均可使用&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Quintessential 立体定位注射仪（QSI）</td><td>Stoelting</td><td>53311</td><td>可以不使用该设备进行注射，但&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;自动注射器可提高实验重复性和操作便利性</td></tr><tr><td>10 &amp;mu;l 700 系列手工装配微量注射器</td><td>Hamilton</td><td>型号 701</td><td>该型号注射器可稳定递送 0.5 至 500 μl 溶液。也可使用其他型号注射器（例如 5 μl，型号 75）</td></tr><tr><td>30 号皮下注射针头&lt;br/&gt;（1.25&quot;，15&lt;sup&gt;o&lt;/sup&gt; 斜面）&amp;nbsp;</td><td>Hamilton</td><td>货号 S/O# 197462</td><td>该针头非常适合穿透新生小鼠的皮肤和颅骨，无需其他侵入性操作。若针头变钝（难以刺入皮肤），则需更换</td></tr><tr><td>in vivo-jetPEI</td><td>Polyplus Transfection</td><td>201-10G</td><td>分装成小体积后保存于 -20 °C&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>D-荧光素钾盐</td><td>Goldbio.com</td><td>LuckK-1g</td><td>其他来源的萤火虫荧光素酶同样适用</td></tr><tr><td>苏木精溶液，Harris 改良型</td><td>Sigma Aldrich</td><td>HHS128-4L</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek O.C.T. 包埋剂</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>62550-01</td><td>用于脑组织包埋以进行冷冻切片和免疫组织化学染色</td></tr><tr><td>高级 DMEM/F-12 培养基，不含谷氨酰胺</td><td>Life Technologies</td><td>12634-010</td><td>用于神经球的培养</td></tr><tr><td>B-27&amp;uml; 补充剂（50X），无血清&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>17504-044</td><td>神经球培养用无血清补充剂</td></tr><tr><td>N2 补充剂（100x）</td><td>Life Technologies</td><td>17502-048</td><td>神经球培养用无血清补充剂</td></tr><tr><td>Normocyn</td><td>InvivoGen</td><td>ant-nr-1</td><td>神经球培养用抗支原体试剂</td></tr><tr><td>重组人 EGF</td><td>PEPROTECH</td><td>AF-100-15</td><td>神经球培养用生长因子补充剂&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>重组人 bFGF</td><td>PEPROTECH</td><td>100-18B</td><td>神经球培养用生长因子补充剂&amp;nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>HyClone HyQTase&amp;nbsp; 细胞解离试剂&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>SV3003001</td><td>用于神经球的解离</td></tr><tr><td>Kimble-Chase Kontes 研磨杵</td><td>Fisher Scientific</td><td>K749510-0590</td><td>用于新鲜解剖肿瘤的解离</td></tr><tr><td>Falcon 细胞筛，孔径 70 μm</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-771-2</td><td>用于制备解离后神经球的单细胞悬液</td></tr><tr><td>二甲苯，组织学级</td><td>Fisher Scientific</td><td>C8H10</td><td></td></tr><tr><td>Protocol 无汞 Harris 苏木精溶液（酸化型）</td><td>Fisher Scientific</td><td>245-678</td><td></td></tr><tr><td>Protocol 加强型伊红 Y 溶液</td><td>Fisher Scientific</td><td>314-631</td><td></td></tr></tbody></table>

转座子介导的质粒dna整合至新生小鼠侧脑室下区以构建新型胶质母细胞瘤模型

Transposon Mediated Integration of Plasmid DNA into the Subventricular Zone of Neonatal Mice to Generate Novel Models of Glioblastoma

目前迫切需要验证新基因在人类胶质母细胞瘤（GBM）发病机制及进展中的作用，GBM 是成人中最常见的原发性脑肿瘤，预后极差。大量潜在的新疗法正从实验室快速涌现，亟需在能够紧密模拟人类疾病关键特征的实验模型中进行系统性测试。本文详细描述了一种利用转座子介导的质粒DNA整合至新生小鼠侧脑室下区细胞的方法，以诱导产生新的GBM模型。我们介绍了一种简便的克隆新型转座子的方法，该方法适用于利用“睡美人”（Sleeping Beauty）转座子系统进行基因组整合，并展示了如何通过生物发光成像、组织学和免疫组织化学技术监测质粒摄取情况及疾病进展。此外，我们还描述了一种建立新的原代GBM细胞系的方法。本报告有望进一步推动“睡美人”转座子系统在脑肿瘤研究领域的应用，从而深入理解GBM的发病机制与进展过程，并促进针对患者的有效治疗方案的及时设计与验证。

为表征SB诱导的胶质母细胞瘤的组织病理学特征，在出生后第1天（P1）向C57/BL6新生小鼠注射编码荧光素酶的质粒（pT2/SB100x-Luc），同时联合注射编码携带致癌DNA的转座子的质粒， 即，NRAS（pT/CAGGS-NRASV12）和 SV40 LgT（pT/CMVSV40-LgT）（图3c）或共转染编码短发夹p53并携带PDGFβ和GFP报告基因的质粒（pT2shp53/GFP4/mPDGFβ）以及NRAS图3d）。注射后次日对动物进行生物发光监测（图2a）并定期观察，直至达到濒死阶段后实施安乐死。濒死阶段定义为动物出现临床症状，表现为活动能力受损、蜷缩姿势、毛发杂乱及体重减轻。有时动物会出现癫痫发作或异常运动模式，如转圈行走和突然跳跃。实验结束时，动物被麻醉，脑组织经灌注、石蜡包埋，并进行苏木精-伊红染色。数据显示肿瘤具有人类胶质母细胞瘤（WHO IV级）的典型特征，伴有出血灶图 3c），假栅栏状坏死（图3e）以及血管周围和弥散性侵入脑...

本文介绍了一种高效且用途广泛的方案，通过将转座子DNA注射到新生小鼠的脑室内，诱导、监测和分析新型胶质母细胞瘤（GBM）。位于脑室下区的细胞摄取质粒后发生转化、增殖，并形成具有人类GBM组织病理学特征的肿瘤。

转座子介导的质粒DNA整合至新生小鼠侧脑室下区以构建新型胶质母细胞瘤模型

迫切需要验证新基因在人类胶质母细胞瘤（GBM）发病机制及进展中的作用，GBM是最常见的原发性...

本实验的目的是通过在小鼠体内诱导携带特定基因突变的胶质母细胞瘤形成，从而建立新型胶质母细胞瘤模型，并最终开发出新的治疗策略。该目标首先通过构建编码特定目的基因的转座子质粒来实现，随后将质粒与转染试剂混合，注射至新生小鼠的侧脑室中。通过生物发光监测肿瘤进展过程中的细胞摄取情况。当动物出现明显症状时，将其处死并进行组织学和免疫组织化学分析。因此，可在野生型或特定基因背景的小鼠中诱导产生具有特定遗传改变的新型胶质母细胞瘤。这些肿瘤可在体内进行研究，或在体外用于建立新的细胞系，以便开展生化分析以及利用化疗药物进行细胞毒性实验。与其它方法（例如胶质母细胞瘤细胞系的原位注射）相比，该技术的主要优势在于，肿瘤是通过针对特定基因改变，诱导免疫功能健全动物自体细胞发生恶性转化而形成的。该过程更接近人类疾病的病因，并重现了人类胶质母细胞瘤（GBM）的关键组织病理学特征。该方法有助于回答神经肿瘤学领域中的关键问题，例如哪些驱动突变导致了不同类型的多形性胶质母细胞瘤——经典型、前神经型、神经型——在成人或儿童肿瘤中的发生。该技术的应用前景延伸至GPM的治疗，因为利用此模型可以相对较快地在体内或体外测试新型化疗药物、放射性免疫疗法或其联合治疗方案。我最初产生这一方法的想法，是在与我在明尼苏达大学的同事John博士讨论时提出的，他此前已利用“睡美人”转座子介导的癌基因整合技术，将肿瘤抑制基因的抑制剂插入宿主基因组DNA，建立了初始的脑肿瘤模型。我认为，该方法将非常有助于研究新突变在肿瘤进展中的影响，并推动脑癌靶向治疗的发展。实验前3至4周，设置一个鼠笼用于小鼠繁殖，其中放入一雄一雌小鼠，并添加一个彩色塑料小屋以丰富环境，提高交配成功率。一旦确认雌鼠怀孕，即移除雄鼠，并在交配后第18天开始密切观察雌鼠的分娩情况。确保在分娩前后有合适的代孕母鼠可用。在出生后的第一天进行脑室内注射。配制注射溶液时，首先吸取20微升含有转座子质粒的DNA混合物，使DNA终浓度为每微升0.5微克。接下来，向DNA溶液中加入20微升PEI溶液，在室温下孵育20分钟至1小时，之后将混合物置于冰上保存。对于注射针，将10微升注射器连接至30号、斜面角度为12.5度的皮下注射针头，然后将注射器连接至带有自动注射功能的微量泵。使用 10 微升水测试装置，并确保排空注射器。现在，用干冰和酒精的混合物冷却新生小鼠立体定位仪。当温度降至 2 至 8 摄氏度时，开始进行注射。首先将幼鼠置于冰上两分钟以进行麻醉。在幼鼠冰上麻醉期间，用注射器吸取注射溶液。麻醉完成后，将幼鼠转移至固定架上，并用覆盖纱布的耳杆固定其头部。检查颅骨背侧是否水平且与框架表面平行，颅缝应清晰可见。若幼鼠头部未充分固定，则在注射过程中会发生移动。而如果幼鼠头部被框架的耳杆夹得过紧，人字缝将无法看到，并且颅内压力会迫使注射的溶液渗出。将幼鼠牢固地固定在框架上后，用70%乙醇擦拭其头部，然后降低针头并调整其位置，使其接触人字缝。接着，将针头抬起，向侧方移动0.8毫米，再向后方移动1.5毫米。然后再次降低针头，直至其轻微压陷皮肤。记录该位置的坐标。然后将针头向下移动1.5毫米，穿过皮肤和颅骨，进入侧脑室处的皮层。在90秒内注射0.75 µL，随后等待1分钟，使溶液充分扩散。下一个需要注射的幼鼠可以进行麻醉。称重后，缓慢抬起针头，然后将幼鼠转移到加热灯下的恢复区域。从麻醉到保温的时间必须少于10分钟。越快越好地监测其呼吸，如有必要，可轻轻摩擦幼崽的四肢以刺激呼吸。一旦幼崽恢复体温，肤色转为红润且呼吸平稳，立即将其送回母体身边。从注射开始通常需要五到七分钟即可完成这一过程。若注射了多只幼鼠，应确保全部幼鼠均恢复意识后，再将其归还给母鼠。若经过半小时后仍有部分幼鼠未恢复，则先将其中一半归还给母鼠，剩余部分在操作结束时再行归还，并持续观察母鼠状态。归还幼鼠后，需进行监测。如果她对幼崽没有反应，则将代孕母鼠放入笼中。注射后24至72小时，监测质粒的摄取情况，并将所有幼崽转移至六孔细胞培养板，每孔一只幼崽。然后用含30毫克/毫升荧光素（Lucifer）的生理盐水或PBS溶液填充一支1毫升注射器，并连接一根30号皮下注射针头。在每只幼鼠肩胛骨之间皮下注射30微升溶液；为避免损伤幼鼠，将溶液注入皮肤的小褶皱下方。立即把幼鼠转移至活体生物发光成像系统。设置一个序列，以自动曝光、大视野和光圈值1，每隔1分钟连续采集四幅图像。稍后。大约17天后，动物体内可能开始形成可通过生物发光和组织学检测到的肉眼可见肿瘤。监测肿瘤生长可能需要长达六周时间。使用26号针头向腹腔内注射100 µL的荧光素溶液。三分钟后，在异氟烷-氧气麻醉舱中对动物实施麻醉，并将动物置于配备有分散异氟烷导管的成像舱内。使用自动曝光时间、中等像素合并模式和F值为1的开放光圈，每隔两分钟采集一组共六幅图像。感兴趣区域通常为覆盖头部的椭圆形区域，采用相同的设置测量每只动物的生物发光强度，以表征SB诱导的胶质母细胞瘤的组织病理学特征。在出生后第1天（P1），将C57黑六新生小鼠注射含有荧光素酶的质粒以及NRA S和SV40大T抗原质粒，这些质粒均携带具有致癌DNA的转座子。另一种方法是注射编码短发夹P53、PDGFβ以及GFP报告基因的质粒，并联合使用NRAS。可见假栅栏状坏死，以及血管周围和弥漫性向脑实质浸润的病理表现。实质胶质母细胞瘤也通过生物发光进行监测。动物通常会因肿瘤负荷而死亡。当发光强度达到10的第七次方至10的第九次方校准单位时。动物的中位生存期可预测地取决于注射到新生小鼠脑内的致癌转座子组合。最具侵袭性的肿瘤由NRS和SV40大T抗原诱导产生，新生肿瘤的特征在于其表达特定分子。由SHP53和nras诱导表达GFP的新生肿瘤表达了神经干细胞标志物nestin，其中部分肿瘤还表达了胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein）。56天后，发现一个肿瘤，其周围被大量GFAP阳性星形胶质细胞包围。这些肿瘤细胞表达nein，但不表达GFAP。观看本视频后，您应能充分了解如何通过向新生小鼠脑室内注射诱导携带特定基因突变的胶质母细胞瘤的形成，以及如何利用生物发光技术监测疾病进展。在本文中，您将了解到如何轻松克隆新的反式质粒（trans pro plasmid），该质粒可编码目的基因，以及如何通过组织学和免疫组织化学方法对肿瘤进行监测和分析。此外，您还将获得一种详细的方法，用于从携带基因工程改造肿瘤的动物体内建立新的胶质母细胞瘤细胞系。我们希望本文能够有助于加快针对这种严重人类疾病的新型疗法的发现进程。

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质粒DNA转座子介导整合到新生小鼠的脑室下区，以生成胶质母细胞瘤的新模型

本视频介绍了一种通过将转座子DNA注射到新生小鼠脑室中以高效诱导胶质母细胞瘤（GBM）的技术。位于脑室下区的细胞摄取质粒后发生转化、增殖，并形成具有人类GBM组织病理学特征的肿瘤。...

利用SB介导的转座诱导胶质母细胞瘤：一种通过转座子介导的SB质粒整合至新生小鼠脑部以建立新型小鼠模型的技术

神经母细胞迁移是出生后神经发生过程中的基本事件。我们描述了一种通过高效标记神经母细胞的方案 体内...

体内 新生期电穿孔与小鼠急性脑切片中神经母细胞迁移的实时成像

我们建立了小鼠皮层原位胶质母细胞瘤模型，用于活体双光子显微镜观察，该模型可重现肿瘤生长过程中通常存在的生物物理约束条件。通过以慢性玻璃窗替代肿瘤上方的颅骨，可利用双光子显微镜对肿瘤进展进行长期动态追踪。...

一种保留脑实质物理约束并适用于活体双光子显微成像的原位胶质母细胞瘤小鼠模型

该方法展示了如何在发育中的小鼠前脑中靶向中间神经元 在子宫内...

皮层中间神经元亚型选择性电穿孔

本文展示了一种通过向新生小鼠脑内脑室内注射腺相关病毒实现广泛神经元转导的技术。该方法可快速、简便地实现病毒递送的转基因在生命全程中的持续表达。...

新生小鼠脑室内病毒注射以实现持续且广泛的神经元转导

本文介绍了一种简单的方法，用于分离和流式细胞术分析胶质瘤浸润的外周血单个核细胞，该方法可获得随时间变化的定量数据，反映进入早期脑肿瘤微环境的免疫细胞数量及其活化状态。...

胶质瘤浸润性外周血单个核细胞的分离与流式细胞术分析

通过在稀疏分布的细胞群体中诱导基因的缺失或获得功能，可研究基因在脑内的细胞自主性功能。本文描述 在体 电穿孔法递送 Cre 重组酶至具有 floxed 基因的稀疏发育期皮层神经元以实现基因功能缺失 在体内.

通过诱导小鼠大脑皮层中的 Cre-lox 重组 子宫内 电穿孔

激光显微切割（LMD）是一种灵敏且高度可重复的技术，可用于揭示介导胶质瘤异质性和侵袭性的分子通路。本文中，我们描述了一种优化的实验方案，通过激光显微切割从胶质瘤组织中分离特定区域，并随后进行转录组学分析。...

激光捕获显微切割胶质瘤亚区域用于肿瘤内异质性、肿瘤微流及侵袭的空间与分子特征分析

利用具有常见患者突变驱动的免疫健全、同源性肿瘤模型进行临床前测试，对免疫治疗研究至关重要。本方案描述了一种通过电穿孔递送质粒DNA来构建脑肿瘤小鼠模型的方法，该模型可模拟常见患者突变，从而提供一种准确、可重复且稳定的小鼠模型。...

建立脑肿瘤模型 体内 利用电穿孔法递送代表患者突变特征的质粒DNA

脓毒症是指由微生物感染引发的全身性炎症反应综合征，可通过一种称为盲肠结扎穿刺（CLP）的手术技术进行模拟。本文介绍了一种利用CLP诱导的动物模型筛选具有治疗作用的药用植物的方法。...

利用脓毒症动物模型评价新型草药疗法

了解利用转座子质粒DNA通过侧脑室注射整合到新生小鼠体内，以诱导携带特定基因突变的胶质母细胞瘤形成的方法。该技术可用于监测肿瘤进展并进行组织学分析，为神经肿瘤学研究提供可靠的疾病模型。

转座子介导的质粒DNA整合至新生小鼠侧脑室下区以构建新型胶质母细胞瘤模型

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