转座子介导的质粒DNA整合至新生小鼠侧脑室下区以构建新型胶质母细胞瘤模型

本实验的目的是通过在小鼠体内诱导携带特定基因突变的胶质母细胞瘤形成，从而建立新型胶质母细胞瘤模型，并最终开发新的治疗策略。该目标首先通过构建编码特定目的基因的转座子质粒来实现，随后将质粒与转染试剂混合，注射至新生小鼠的侧脑室中。

通过生物发光检测肿瘤进展过程中的摄取情况。当动物出现明显症状时，将其处死并进行组织学和免疫组织化学分析。因此，可在野生型或特定基因背景下诱导产生具有特定遗传改变的新型胶质母细胞瘤。

这些肿瘤可在体内进行研究，或在体外用于建立新的细胞系，以便开展生化分析以及利用化疗药物进行细胞毒性实验。与其它方法（例如胶质母细胞瘤细胞系的原位注射）相比，该技术的主要优势在于，肿瘤是通过针对特定选择的遗传改变，诱导免疫功能健全动物体内内源性细胞发生恶性转化而形成的。该过程更接近人类疾病的病因，并重现了人类胶质母细胞瘤（GBM）的关键组织病理学特征。

该方法有助于解答神经肿瘤学领域中的关键问题，例如哪些驱动突变导致成人或儿童胶质母细胞瘤多形性（胶质母细胞瘤）的不同亚型，如经典型、前神经型、神经型等。该技术的应用前景广泛，可推动胶质母细胞瘤的治疗发展，因为新型化疗药物、放射性免疫疗法或其联合治疗方案均可利用此模型在体内或体外进行相对较快的测试。

我最初产生这一方法的想法，是在与明尼苏达大学的同事John博士讨论时提出的。他此前已利用“睡美人”转座子介导的致癌基因整合技术，将肿瘤抑制基因的抑制剂插入宿主基因组DNA，建立了最初的脑肿瘤模型。我认为，该方法将非常有助于研究新突变在肿瘤进展中的作用，并推动脑癌靶向治疗的发展。实验前3至4周，设置一个包含一只雄鼠和一只雌鼠的小鼠繁殖笼，并放入一个彩色塑料小屋以丰富环境，提高交配成功率。一旦确认雌鼠怀孕，即移除雄鼠，并在交配后第18天开始密切观察雌鼠的分娩情况。

确保在分娩前后有合适的代孕母鼠可用。在出生后的第一天进行脑室内注射。配制注射溶液时，首先吸取20 µL含有转座子质粒的DNA混合物，使DNA终浓度为每微升0.5 µg。

接下来，向DNA溶液中加入20微升PEI溶液，在室温下孵育20分钟至1小时，之后将混合物置于冰上保存。对于注射针，将10微升注射器连接至30号、斜角为12.5度的皮下注射针头上，然后将注射器连接至带有自动注射功能的微量泵。

使用10微升水测试装置，并确保排空注射器。现在，用干冰和酒精的混合物冷却新生小鼠立体定位仪。当温度降至2至8摄氏度时，开始进行注射。

首先将幼鼠置于冰上两分钟以进行麻醉。在幼鼠冰上麻醉期间，用注射液填充注射器。麻醉完成后，将幼鼠转移至固定架上，并用覆盖纱布的耳杆固定其头部。

检查颅骨背侧是否水平且与框架表面平行，颅缝应清晰可见。若幼鼠头部未充分固定，在注射过程中会出现移动。

而如果幼鼠头部被框架的耳杆夹得过紧，人字缝将无法看到，且颅内压力会迫使注射液渗出。将幼鼠牢固固定于框架后，用70%乙醇擦拭其头部，然后降低针头并调整位置，使其接触人字缝。接着，抬高针头，将其侧向移动0.8毫米，垂直移动1.5毫米。然后再次降低针头，直至其轻微压陷皮肤。

记录该位置的坐标。然后将针头向下移动1.5毫米，穿过皮肤和颅骨，进入侧脑室处的皮层。在90秒内注射0.75 µL，随后等待1分钟，使溶液充分扩散。

下一个需要注射的幼鼠可以进行麻醉。称重后，缓慢拔出针头，然后将幼鼠转移到加热灯下的恢复区域。从麻醉到开始保温的时间必须少于10分钟。

越快越好地监测其呼吸，如有必要，可轻轻摩擦幼崽的四肢以刺激呼吸。一旦幼崽恢复体温，肤色转为红润且呼吸平稳，立即将其送回母体身边。从注射开始通常需要五到七分钟即可完成。

若注射了多只幼崽，应在将任何一只幼崽放回母鼠前确保全部幼崽均已恢复。若经过半小时后仍有幼崽未恢复，则先将其中一半放回母鼠身边，剩余部分在操作结束时再放回，并持续观察母鼠状态。幼崽放回后需进行监测。

如果她对幼崽没有反应，则将代孕母鼠放入笼中。注射后24至72小时，监测质粒的摄取情况，并将所有幼崽转移至六孔细胞培养板，每孔一只幼崽。然后用含有30毫克/毫升荧光素（Lucifer）的生理盐水或PBS溶液填充一支1毫升注射器，并连接一根30号皮下注射针头。

在每只幼鼠肩胛骨之间皮下注射30微升溶液；为避免损伤幼鼠，应将溶液注入皮肤的小褶皱下方。立即把幼鼠转移至活体生物发光成像系统。设置成像程序，以自动曝光、大视野和1.0光圈，每隔1分钟连续采集4张图像。

大约17天后，动物体内可能开始形成可通过生物发光和组织学检测到的肉眼可见肿瘤。监测肿瘤生长可能需要长达六周时间。使用26号针头，向腹腔内注射100微升的荧光素溶液。

三分钟后，在异氟烷-氧气麻醉舱中对动物实施麻醉，并将动物置于配备有分散异氟烷导管的成像舱内。使用自动曝光时间、中等像素合并模式以及F值为1的开放光圈，每隔两分钟采集一组共六幅图像。感兴趣区域通常为头部的椭圆形区域，采用相同的设置测量每只动物的生物发光强度，以表征SB诱导的胶质母细胞瘤的组织病理学特征。

在出生后第1天（P1），将C57黑六新生小鼠注射含有荧光素酶的质粒以及NRA S和SV40大T抗原质粒，这些质粒均携带具有致癌DNA的Inod转座子。另一种方法是注射编码短发夹P53、PDGFβ以及GFP报告基因的质粒，并联合使用NRAS。可见假栅栏状坏死，以及血管周围和弥漫性向脑实质浸润的病理表现。

实质胶质母细胞瘤也通过生物发光进行监测。动物通常因肿瘤负荷而死亡。当发光强度达到校准单位的10的7次方至10的9次方时。

动物的中位生存期可预测地取决于注射到新生小鼠脑内的致癌转座子组合。最具侵袭性的肿瘤由NRS和SV40大T抗原诱导产生，这些新生肿瘤的特征是表达特定的标志性分子。由SHP53和nras诱导表达GFP的新生肿瘤表达了神经干细胞标志物nestin，其中部分肿瘤还表达了胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein）。

56天后，发现一个肿瘤被大量GFAP阳性星形胶质细胞包围。这些肿瘤细胞表达nein，但不表达GFAP。观看本视频后，您应能够充分理解如何通过向新生小鼠脑室内注射诱导携带特定基因突变的胶质母细胞瘤的形成，以及如何利用生物发光技术监测疾病进展。

本文将详细介绍如何轻松克隆新的反式质粒（trans pro plasmid），该质粒可编码目的基因，以及如何通过组织学和免疫组织化学方法对肿瘤进行监测和分析。此外，您还将了解到如何从携带基因工程改造肿瘤的动物中建立新的胶质母细胞瘤细胞系。我们希望本文能够有助于加快针对这种严重人类疾病的新型治疗方法的发现进程。